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Investigación de la diferenciación de células T CD4 murinas mediante la ablación génica mediada por el complejo de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9

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DOI:

10.3791/67380

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20 de junio de 2025

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1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

En este artículo

Resumen

Describimos un enfoque altamente adaptable para el uso de la ablación génica mediada por el complejo de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 en células T CD4 murinas para investigar la función génica en la diferenciación de células T CD4.

Resumen

La accesibilidad generalizada de la tecnología de repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR)-Cas9 ha hecho que la selección de genes en células primarias sea un método de rutina para evaluar la función génica en las células T. Dado el costo y la disponibilidad limitada de cepas de ratones knockout (KO), probar hipótesis preliminares que involucran la función génica en las células T puede ser prohibitivo utilizando modelos animales dirigidos a genes. Sin embargo, mediante el uso de recursos disponibles comercialmente, incluidos los ARN guía (ARNg) prediseñados, los investigadores pueden generar convenientemente células T vírgenes dirigidas a genes que se pueden usar para estudios de activación y diferenciación de células T.

Aquí describimos un protocolo para el uso de complejos de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 (RNP) administrados por nucleofección para generar de manera eficiente células T CD4 murinas previas al gen KO que se pueden usar para evaluar la función génica en la diferenciación de células T CD4, in vitro. El aislamiento de linfocitos T CD4 vírgenes de órganos linfoides secundarios de ratón, seguido de nucleofección con complejos de ARNg Cas9, garantiza que el gen KO se inicie antes de la activación de los linfocitos T posteriores, lo que ofrece una ventaja estratégica sobre la administración de ARNg mediada por retrovirales, que normalmente requiere la preactivación de los linfocitos T, lo que evita la evaluación de los efectos en los linfocitos T vírgenes. Además, este método basado en la nucleología evita los posibles problemas de desarrollo asociados con los animales con el gen KO.

Después de la administración de Cas9-gRNA, describimos los protocolos para estudiar la diferenciación de las células T CD4 en linajes Th1, Th2, Th17 y Treg utilizando polarización in vitro . Además, este protocolo es adaptable al uso de células T CD4 o CD8 dirigidas a genes para numerosas aplicaciones posteriores, incluidos otros estudios de activación de células T in vitro y estudios de transferencia adoptiva in vivo. El uso de los métodos CRISPR-Cas9 ha simplificado nuestra capacidad para evaluar la función génica en las células T y permite la KO rutinaria de muchos genes de interés, liberando a los investigadores de las limitaciones asociadas con el estudio de los animales con genes KO.

Introducción

El uso de tecnologías basadas en CRISPR (CRISPR) de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas ha transformado nuestra capacidad para manipular secuencias de ADN genómico, mejorando en gran medida nuestra capacidad para estudiar la función de los genes en innumerables sistemas biológicos. Con respecto a los linfocitos T CD4, han surgido métodos que utilizan complejos de ribonucleoproteínas (RNP) CRISPR-Cas9, que facilitan el knock-out (KO) eficiente de genes en linfocitos T naïve primarios que pueden ser utilizados para estudios in vitro e in vivo 1,2,3,4. La identificación de nuevos genes putativos que regulan la diferenciación de las células T CD4 a menudo se basa en análisis transcriptómicos y epigenómicos, lo que genera nuevos objetivos para los que puede haber pocos recursos o difíciles de obtener para investigar, particularmente si el gen afecta a múltiples tejidos y puede requerir evaluación con ratones condicionales dirigidos a genes. La focalización génica a través de la transducción retroviral de ARNg 5,6 se ha utilizado para evaluar la función génica en las células T, pero requiere la activación de las células T para la infección retroviral, y no se puede utilizar para dirigirse a genes en células T vírgenes. La CRISPR-Cas9 administrada por nucleofección en células T ingenuas ofrece una herramienta alternativa relativamente barata y rápida para validar e interrogar nuevos genes de interés antes de invertir en modelos de ratón costosos y que requieren mucho tiempo.

En nuestro protocolo descrito aquí, la edición génica mediada por CRISPR-Cas9 se lleva a cabo utilizando proteína Cas9 recombinante complejada con moléculas de ARN guía (ARNg) que se administran en células T CD4 vírgenes a través de la nucleofección. El ARNg se compone de dos componentes distintos, un ARN CRISPR transactivador (tracrRNA) y un ARN CRISPR (crRNA). Funcionalmente, las secuencias derivadas de tracrRNA facilitan la asociación del ARNg con Cas9, mientras que las secuencias de crRNA contienen especificidad para las regiones de interés del ADN diana. Los complejos de ARNg-Cas9 median las roturas de ADN bicatenario (ADNdd) dirigidas, y los ARNg median la especificidad de la secuencia de la actividad de la endonucleasa Cas9 7,8. La escisión del dsDNA mediada por Cas9 conduce a la inactivación de genes, a través de la generación de mutaciones indel después de la unión de extremos no homólogos en las células diana9. En este protocolo, recomendamos el uso de múltiples ARNg dirigidos a genes de interés para garantizar un KO robusto en células T CD4 vírgenes.

Las células T CD4 auxiliares son actores clave en el sistema inmunitario y guían las respuestas inmunitarias a través de la producción de una variedad de citocinas que modulan la función de muchos tipos de células inmunitarias. Tras la estimulación a través del receptor de células T (TCR) en presencia de citocinas específicas, las células T CD4 ingenuas pueden diferenciarse en distintos linajes de células T helper (Th) CD4 T, incluidas Th1, Th2, Th17 y células T reguladoras (Treg)10,11,12. La definición de estos linajes distintos de células T CD4 es la expresión de factores de transcripción (TF) y citocinas específicos que definen el linaje (Figura 1). La diferenciación de los linfocitos T CD4 se puede modelar utilizando polarización in vitro 13,14,15, utilizando linfocitos T CD4 naïve activados a través del TCR en presencia de citocinas promotoras del linaje y anticuerpos bloqueantes que evitan la adopción inapropiada del linaje.

La combinación de la segmentación génica CRISPR-Cas9 en linfocitos T CD4 vírgenes con la polarización in vitro de linfocitos T CD4 ofrece un sistema robusto para evaluar la función génica en estas células (Figura 2). Dada la amplia disponibilidad de reactivos para evaluar la diferenciación de CD4 mediante citometría de flujo, los aspectos clave de la diferenciación de linfocitos T CD4, incluida la expresión de TF y la producción de citocinas, se pueden interrogar fácilmente utilizando los protocolos descritos aquí. La identificación de nuevos genes que regulan la función de las células T CD4 mejora nuestra comprensión de estas células, y los métodos CRISPR-Cas9 junto con la polarización in vitro ofrecen una modalidad sólida para evaluar la función de los genes antes de comprometerse con los modelos de ratón KO del gen.

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Protocolo

Para todos los procedimientos descritos aquí, utilizamos ratones C57/BL6J de tipo salvaje (WT). Los ratones fueron mantenidos y tratados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) de acuerdo con las directrices del NIAID (protocolo LISB-22E) y los comités de Cuidado y Uso Animal de los NIH (Aseguramiento del Bienestar Animal #A-4149-01).

1. Consideraciones antes de comenzar

  1. Selección de reactivos de ARNg
    NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener reactivos de ARNg prediseñados dirigidos al genoma del ratón utilizado en este protocolo.
    1. Busque el gen de interés (Tabla de materiales, crRNAs deseados) y seleccione los tres crRNAs prediseñados mejor clasificados (formato de 2 nmol). Además, obtener crRNA de control negativo para usar en paralelo (Tabla de Materiales).
      NOTA: La formación de ARNg funcionales requiere la duplicación de ARNcr con ARNtrac; obtener un reactivo de tracrRNA y seguir los pasos de la sección 3.
    2. Diseñe secuencias de ARNg dirigidas a medida.
      NOTA: El diseño de secuencias de ARNg dirigidas personalizadas está fuera del alcance de este protocolo, pero se puede realizar utilizando herramientas disponibles públicamente como CRISPick (Tabla de materiales).
  2. Tampones, medios y equipos
    NOTA: A menos que se indique lo contrario, utilice tampones y reactivos fríos (4 °C).
    1. Prepare el tampón MACS, el tampón FACS, el tampón Triton X-100 al 0,5%, el tampón de permeabilización 1x, los medios RPMI completos y los medios IMDM (Tabla de materiales) completos antes de comenzar el procedimiento y almacene a 4 °C.
    2. Obtenga kits de aislamiento de células T CD4 y microperlas anti-FITC (Tabla de materiales) antes de comenzar este procedimiento.
    3. Antes de comenzar la nucleofección (sección 4), precaliente (37 °C) 5 mL de medio IMDM completo y prepare un mínimo de 10 mL de IMDM completo suplementado con IL-7 a 5 ng/μL calentado a 37 °C (Tabla de Materiales). Ajuste el volumen de los medios precalentados según sea necesario para tener en cuenta la adición de 125 μL por muestra después de la nucleofección. Ajustar el volumen de IMDM completo que contiene IL-7 según sea necesario, en función del número de células nucleafectadas (sección 4).
    4. Antes de iniciar el aislamiento de células presentadoras de antígeno (APC), prepare el reactivo de mitomicina C añadiendo 4 mL de H2O estéril al vial de 2 mg de mitomicina C (concentración de stock de 0,5 mg/mL).
      NOTA: Realice todos los pasos en una campana de cultivo de tejidos y utilice técnicas asépticas estériles.

2. Aislamiento previo de células T CD4

NOTA: Las células T CD4 vírgenes se pueden aislar mediante aislamiento magnético o mediante clasificación de células. La pureza obtenida del aislamiento magnético suele ser del 97% y la viabilidad celular es muy alta, mientras que la clasificación electrónica puede mejorar la pureza celular a expensas de la viabilidad celular. El protocolo descrito aquí utilizará aislamiento magnético, pero se puede adaptar a cualquiera de los dos escenarios. Asegúrese de que las columnas LS estén preparadas correctamente (Tabla de materiales).

  1. Aísle el bazo y los ganglios linfáticos (inguinal, braquial, axial y cervical) de los ratones (aquí se utilizan ratones WT C57BL/6J).
  2. Colocar una criba de 70 μm en un plato de 60 mm con 5 mL de RPMI (Tabla de Materiales) completa para cada tejido procesado. Procese los ganglios linfáticos y el bazo en diferentes platos para aumentar el rendimiento. Muele suavemente los pañuelos a través del filtro con un émbolo de una jeringa de 3 ml. Enjuague el filtro con 1-3 mL de medio y transfiera las suspensiones de una sola celda a tubos cónicos de 15 mL.
  3. Repita el paso 2.2 para obtener ganglios linfáticos y tejidos esplénicos adicionales, según sea necesario.
  4. Centrifugar las suspensiones unicelulares a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  5. Prepárese para contar las celdas de la siguiente manera.
    1. Para muestras esplénicas, aspire el sobrenadante, vuelva a suspender suavemente el gránulo celular en 1 mL de tampón de lisis ACK, incube durante 2-5 min en RT, luego agregue 2 mL de RPMI completo, centrifugar, resuspender en 5 mL de RPMI completo y cuente las células.
    2. En el caso de las células de los ganglios linfáticos, aspire el sobrenadante, vuelva a suspender la pellet de la célula en 5 ml de RPMI completo fresco y cuente las células.
  6. Para la entrada en el kit de aislamiento de CD4 naïve, mezcle los esplenocitos con las células de los ganglios linfáticos para alcanzar el número de células deseado para el aislamiento.
    NOTA: Por lo general, 1 × 108 células de ganglios linfáticos y bazo de ratones WT-B6 producen 2-8 × 106 células T CD4 ingenuas.
  7. Centrifugar las células agrupadas del bazo y los ganglios linfáticos a 500 × g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en el volumen adecuado de tampón MACS (Tabla de materiales) como se indica en el protocolo del fabricante (kit de aislamiento de células T CD4 ingenuas).
  8. Siga con precisión el protocolo del fabricante para aislar las células T CD4 vírgenes por selección negativa (Tabla de materiales) utilizando el cóctel de anticuerpos de biotina de células T CD4+ vírgenes, las microperlas anti-biotina y las microperlas CD44; utilizar columnas LS para este aislamiento y recoger las células en tubos cónicos de 15 mL.
  9. Después del aislamiento, centrifugar las células a 500 × g durante 5 min, 4 °C, retirar el sobrenadante, resuspender el pellet de la célula en 2 mL de medio RPMI completo y contar las células.
  10. Almacene las células a 4 °C hasta que estén listas para comenzar con la nucleofección.

3. Formación del complejo Cas9-gRNA

NOTA: Prepare existencias de crRNA de control negativo y específicas de genes. Describimos el uso de un CRRNA único para las condiciones de control negativo y tres crRNA únicos para las condiciones de orientación génica. El uso simultáneo de tres crRNAs distintos garantiza la KO de los genes de interés.

  1. Vuelva a suspender los crRNAs y el tracrRNA a concentraciones de stock de 100 μM utilizando tampón dúplex (Tabla de materiales). Esto equivale a 10 μL de tampón por 1 nmol de ARN.
  2. Combine crRNAs individuales con tracrRNA en una proporción de 1:1 en tubos de PCR estériles y mezcle mediante pipeteo. Calentar a 95 °C durante 5 min en un termociclador. Luego, deje que los complejos se enfríen a RT en una mesa de trabajo durante al menos 10 minutos.
    NOTA: A partir de este momento, los dúplex de ARNcr/ARNtracr se denominan ARNg . Los complejos son estables durante al menos 6 meses si se almacenan a -20 °C. Por lo general, producimos 6 μL de ARNg (3 μL de ARNcr + 3 μL de ARNtrac) por corrida, lo que proporciona suficiente material para aproximadamente cinco muestras (1 μL/muestra).
  3. Para ARNg dirigidos a genes: en tubos de PCR estériles, agregue 3 μL de ARNg (1 μL de cada uno de los tres ARNg únicos por objetivo), 1 μL de proteína Cas9 y 1 μL de tampón dúplex (5 μL en total por muestra). Pipetea suavemente para mezclar y asegurarte de que todo el material esté en el fondo del tubo. Incubar en RT durante 10 min. Sincronice el tiempo de este paso con la nucleofección (pasos 4.1-4.2).
  4. Para ARNg de control negativo: En tubos de PCR estériles, agregue 1 μL de ARNg, 1 μL de proteína Cas9 y 3 μL de tampón dúplex (5 μL en total por muestra). Pipetea suavemente para mezclar y asegurarte de que todo el material esté en el fondo del tubo. Incubar en RT durante 10 min. De nuevo, sincronice el tiempo de este paso con la nucleofección (pasos 4.1-4.2).
    NOTA: El uso de 50 pmol de ARNg para el control negativo (frente a 3 x 50 pmol para la prueba) es más rentable y no tiene ningún impacto en los resultados.

4. Nucleofección - Ablación de genes mediada por Cas9-gRNA

  1. Centrifugar 1-8 × 106 células T purificadas a 500 × g durante 5 min, 4 °C por muestra de nucleofección. Retire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante.
  2. Vuelva a suspender las células en 20 μL de tampón P3 (16,4 μL de P3 + 3,6 μL de suplemento por muestra; Kit de nucleofectores, Tabla de materiales) y transferir la suspensión a tubos de PCR que contienen los complejos Cas9-gRNA. Mezclar y transferir a pozos independientes de un nucleocuvette de 16 pocillos (Kit Nucleofector, Tabla de Materiales). Asegúrese de que no se hayan formado burbujas al transferir las células a la cubeta, ya que esto puede afectar negativamente la eficiencia de la nucleofección. Golpee la cubeta contra una superficie de trabajo para asegurarse de que todo el material esté en el fondo de cada pocillo y libre de burbujas.
  3. Realizar nucleofección utilizando el programa DN100 del nucleofector referenciado (Tabla de Materiales). Agregue inmediatamente 125 μL de medios IMDM completos precalentados a los pocillos de nucleocuvette y transfiera las celdas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Enjuague cada pocillo una vez más con 125 μL de medios precalentados para asegurar la recolección de todas las células.
  4. Centrifugar las células a 500 × g durante 5 min, 4 °C, retirar todos los medios y volver a suspender en 200 μL de medios IMDM completos calentados + 5 ng/mL IL-7 (Tabla de Materiales).
  5. Transfiera 200 μL de las células a la placa de cultivo y agregue medios IMDM completos calentados + 5 ng/mL de IL-7 para obtener el volumen final deseado de acuerdo con el tamaño de la placa de la siguiente manera: 1-2 × 106 celdas por pocillo en una placa de 48 pocillos (1 mL de medio por pocillo), 2-4 × 106 celdas por pocillo en una placa de 24 pocillos (1,5 mL de medio por pocillo) volumen, 4-6 × 106 celdas por pocillo en una placa de 12 pocillos (2 mL de medio por pocillo), y 6-10 × 106 celdas por pocillo en una placa de 6 pocillos (4 mL de medio por pocillo). Cultivar las células en una incubadora a 37 °C, 5% CO2 durante 3 días.
    NOTA: Dependiendo del recambio de proteína y del ensayo posterior, optimice este período de cultivo. Hemos encontrado un período de descanso óptimo de 3 días, pero se puede ajustar en función del gen diana a entre 1 y 7 días utilizando estas condiciones.
  6. Después del cultivo en medios IMDM completos + 5 ng/mL de IL-7, resuspender las células mediante pipeteo y recogerlas en tubos cónicos de 15 mL. Centrifugar las células a 500 × g durante 5 min, 4 °C, eliminar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en 1 mL de medio RPMI completo.
  7. Cuente las células para determinar el número de células T CD4 vírgenes vírgenes que corresponden a las células nucleofectas de ARNg de interés.
    NOTA: En el proceso de nucleofección, espere perder ~ 50% de las células de entrada en el transcurso de este protocolo y ajuste el número de células T CD4 ingenuas utilizadas en consecuencia. Además, en este punto, puede probar la eficiencia de la orientación génica en células T CD4 vírgenes utilizando una variedad de técnicas (citometría de flujo, Western blot, qPCR o ensayo T7EI).

5. Aislamiento de células presentadoras de antígenos (APC)

NOTA: Asegúrese de que se haya preparado el reactivo de mitomicina, que se utilizará para tratar las APC después del aislamiento (Tabla de materiales). Lea el protocolo de microesferas anti-FITC del fabricante antes de comenzar y asegúrese de que las columnas LS estén preparadas adecuadamente (Tabla de materiales).

  1. Aísle el bazo de ratones WT designados para el aislamiento de APC.
  2. Realizar suspensiones unicelulares como se ha descrito anteriormente (2.2, 2.5.1): lisar eritrocitos con tampón de lisis ACK, resuspender el pellet celular en 5 mL de RPMI completo (4 °C) y contar las células.
    NOTA: Después del aislamiento de APC, espere obtener aproximadamente la mitad del número de celdas de entrada, por ejemplo, 1 × 108 esplenocitos de entrada producirán ~ 40-50 × 106 APC. Prepare el número deseado de esplenocitos para el aislamiento.
  3. Centrifugar las células a 500 × g durante 5 min, 4 °C, y resuspender el pellet de la célula en 800 μL de tampón MACS (Tabla de Materiales).
  4. Añadir 4 μL de anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 conjugados con FITC (Tabla de materiales) a los esplenocitos. Mezclar bien e incubar a 4 °C durante 15 min.
  5. Centrifugar las células a 500 × g durante 5 min, 4 °C y eliminar el sobrenadante. Siguiendo las instrucciones del fabricante, vuelva a suspender las células en el volumen recomendado de tampón MACS y agregue la cantidad adecuada de microperlas anti-FITC (Tabla de materiales).
  6. Incubar las células a 4 °C durante 15 min. Centrifugar las células a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón MACS y pase las células a través de la columna LS preparada como se describe en el protocolo del fabricante, recogiendo las células en un tubo cónico de 15 mL.
  7. Centrifugar las células a 600 × g durante 5 min, 4 °C, retirar el sobrenadante y resuspender las células en 2,7 mL de PBS estéril 1x.
    NOTA: Los APC pueden pellets mal; Utilice una mayor velocidad para la centrifugación.
  8. Agregue 300 μL de solución de mitomicina C a las células para obtener una concentración final de 50 μg/mL. Mezclar bien e incubar a 37 °C en un baño de agua durante 30 min o durante 45 min a 37 °C, 5% de CO2 en una incubadora.
  9. Después de la incubación, centrifugar las células a 600 × g durante 5 min, 4 °C, y lavarlas con 10 mL de PBS estéril 1x. Use la aspiradora para eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante. Repita el lavado 2 veces.
  10. Centrifugar las células de nuevo a 600 × g durante 5 min, 4 °C, eliminar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en 5 mL de medio RPMI completo (4 °C). Cuenta las celdas. Almacene las APC a 4 °C hasta que estén listas para realizar la diferenciación de células T CD4.

6. Diferenciación de linfocitos T CD4

NOTA: Este protocolo está configurado para cultivar células en un formato de placa de 48 pocillos: 2 × 105 CD4 naïve + 1 × 106 APC por pocillo, en una proporción de 1:5. Las células se cultivan en medios IMDM completos. Aquí, proporcionaremos las condiciones para la diferenciación de las células T Th1, Th2, Th17 y Treg CD4; sin embargo, se pueden elegir condiciones de linaje individuales según el enfoque del usuario.

  1. Determine el número de celdas en una placa de 48 pocillos que se utilizarán y calcule el número de celdas necesarias para cada tipo de celda.
    NOTA: Por ejemplo, 10 pozos requerirían 2 × 106 CD4 ingenuos y 10 × 106 APC para mantener la relación 1:5. Si los números de celdas lo permiten, calcule suficientes celdas para un pocillo adicional para tener en cuenta cualquier error de pipeteo al enchapar.
  2. Mezcle el número deseado de CD4 y APC naïve a 1:5, centrifugue las células a 600 × g durante 5 min, 4 °C, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en 500 μL de medio IMDM completo por pocillo (por ejemplo, celdas correspondientes a 10 pocillos en 5 mL de medio).
  3. Coloque incrementos de 500 μL de células en pocillos de una placa de 48 pocillos, asegurándose de que cada pocillo contenga 2 × 105 CD4 naïve + 1 × 106 APC.
  4. Para las condiciones deseadas de diferenciación de linfocitos T CD4, prepare 2 mezclas de citocinas + anticuerpos en IMDM completo como se describe en la Tabla 1. Agregue 500 μL de la mezcla 2x a los incrementos de 500 μL de celdas previamente sembrados para hacer que las concentraciones finales de reactivos sean 1x.
    NOTA: Estos ejemplos se basan en la elaboración de 2,5 mL de preparaciones 2x, suficientes para cinco pocillos para cada condición. De nuevo, si las cantidades de reactivos lo permiten, realice un incremento adicional de mezcla 2x para tener en cuenta el error de pipeteo.
  5. Añada 500 μL de citocina 2x + medio de anticuerpos a 500 μL de pocillos que contienen células CD4/APC para obtener una concentración final de reactivos 1x.
  6. Coloque la placa de 48 pocillos en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2. Cultive las células durante 72 h para permitir que se complete la polarización de CD4.
    NOTA: Examine la placa después del período de cultivo para asegurar un crecimiento robusto. El medio debe ser de color naranja después de la incubación, y el medio amarillo debe indicar un posible sobrecrecimiento celular.

7. Evaluación del impacto de la ablación génica en la diferenciación de linfocitos T CD4

NOTA: Para todos los pasos de tinción, prepare una mezcla maestra de anticuerpos añadida en la dilución adecuada al tampón de tinción requerido. Se utiliza un volumen de 50 μL del cóctel anticuerpo/tampón por muestra. Ajustar los anticuerpos específicos utilizados en función del experimento. Los usuarios deben elegir paneles de anticuerpos relevantes para sus experimentos específicos; A continuación, proporcionamos una plantilla con la que abordar esto en el contexto de los genes a los que se dirige aquí.

  1. Después de la diferenciación de CD4, extraiga cuidadosamente 600 μL del sobrenadante y, a continuación, vuelva a suspender las células de cada pocillo mediante pipeteo.
  2. Extraiga 200 μL de las células de cada pocillo y agréguelas a una placa de 96 pocillos marcada para la tinción del factor de transcripción. Granular las muestras girándolas a 500 × g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y proceder a la tinción de la superficie (paso 7.5).
  3. Para el análisis de citocinas, reestimule los 200 μL restantes de células con PMA (50 ng/mL), ionomicina (500 ng/mL) y Golgi Stop (dilución de 1/2.000) en IMDM completo. Añadir 200 μL de la mezcla de reestimulación 2x a cada pocillo e incubar a 37 °C, 5% CO2 durante 4 h.
    NOTA: Deben quedar 200 μL en la placa de 48 pocillos; por lo tanto, agregar 200 μL de la mezcla 2x de PMA (2x, 100 ng/mL), ionomicina (2x, 1 μg/mL) y Golgi Stop (2x, 1/1,000) creará una concentración final de 1x (Tabla de Materiales).
  4. Mientras tanto, comience la tinción del factor de transcripción. Realizar la tinción de antígeno de superficie resuspendiendo las células en 50 μL de tampón FACS que contiene los anticuerpos conjugados con fluorocromo deseados por muestra (Tabla 2). Incubar en la oscuridad a 4 °C durante 30 min.
  5. Agregue 150 μL de tampón FACS a cada pocillo para lavar el tampón de tinción. Centrifugar la placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Apaga el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados.
  6. Fije las celdas con 100 μL de solución de fijación Foxp3 (Tabla de Materiales) en la oscuridad a RT durante 25 min.
  7. Después de 25 minutos, agregue 100 μL de tampón FACS a cada pocillo para lavar el fijador. Centrifugar la placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados.
  8. Realizar la tinción intracelular resuspendiendo las células en 50 μL de 1x tampón de permeabilización Foxp3 que contiene anticuerpos específicos del factor de transcripción directamente conjugados por muestra (Tabla 2) durante un mínimo de 1 h a 4 °C en la oscuridad.
  9. Una vez completada la tinción intracelular, agregue 100 μL de tampón FACS a cada pocillo. Centrifugar la placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados. Resuspender las células en un volumen final de 200 mL para la citometría de flujo.
  10. Después de la reestimulación con PMA/ionomicina/Golgi Stop, vuelva a suspender las células mediante pipeteo y transfiera 400 μL de cada muestra de citocinas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Granular las muestras a 500 × g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las muestras celulares en 100 μL de tampón FACS y transfiéralas a una placa de 96 pocillos para la tinción de la superficie. Vuelva a granular las muestras girándolas a 500 × g durante 5 min a 4 °C, retire el sobrenadante.
  11. Prepare un cóctel de tinción de superficie con tampón FACS que contenga anticuerpos fluorescentes dirigidos contra antígenos de superficie (Tabla 2). Vuelva a suspender las células en 50 μL de tampón de tinción por muestra e incube durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.
  12. Agregue 150 μL de tampón FACS a cada pocillo para lavar el tampón de tinción. Centrifugar la placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Apaga el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados.
  13. Fije las celdas en 100 μL de PFA (Tabla de Materiales) al 4% en la oscuridad a RT durante 25 min.
  14. Agregue 100 μL de tampón FACS a cada pocillo para lavar el fijador. Centrifugar la placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Apaga el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados.
  15. Realizar la tinción de citocinas intracelulares resuspendiendo las células en 50 μL de anticuerpo anticitocina que contiene un 0,5% de tampón de tinción Triton X-100 por muestra (Tabla 2) durante un mínimo de 1 h a 4 °C en la oscuridad.
  16. Una vez completada la tinción intracelular, agregue 100 μL de tampón FACS a cada pocillo. Centrifugar la placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita para un total de dos lavados. Resuspender las células en un volumen final de 200 mL para la citometría de flujo.
  17. Analice el factor de transcripción y las muestras teñidas con citocinas mediante citometría de flujo.
    NOTA: Los perfiles de citometría de flujo esperados de los paneles de tinción delineados se mostrarán en la sección de resultados representativos.

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Resultados

Para validar que se obtuvo una población pura de linfocitos T CD4 vírgenes utilizando nuestro protocolo (Sección 2), utilizamos citometría de flujo para identificar estas células antes y después del aislamiento magnético. Utilizando nuestro enfoque, obtuvimos una población de alta pureza de células T CD4 + TCRb + CD25-CD44-CD62L+ vírgenes CD4 vírgenes después del aislamiento (Figura 3A). Además, para confirmar que los co...

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Discusión

La integración de protocolos para la administración de complejos CRISPR-Cas9 en linfocitos T CD4 naïve con métodos para estudiar la diferenciación de linfocitos T CD4 proporciona una herramienta sólida para explorar nuevos genes que regulan la biología de los linfocitos T CD4. Aquí, proporcionamos una guía completa para utilizar reactivos Cas9 y gRNA disponibles comercialmente con los que es fácil trabajar. La administración mediada por nucleofección de complejos Cas9-gRNA en células T C...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del NIAID, NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA, pH = 8,0IPM Scientific11005-016
16% Paraformaldehído, PFAMicroscopía Electrónica Sciences15710Diluir con PBS para hacer una solución fijadora de PFA al 4%
1x tampón eBioscience (1x tampón de permeabilización)Thermo Fisher Scientific00-5523-00Utilice el tampón de permeabilización del kit para hacer 1x solución
1x PBS, pH = 7,4Calidad Biológico114-058-101
2-mercaptoetanol (1000x)Gibco21985-023
4D Nucleofector Unidad CentralLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X UnidadLonzaAAF-1003X
60 mmantena Falcon
70 µ m colador de malla de nylonFisherbrand 22363548
ACK Tampón de lisisGibcoA10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032Este kit incluye: P3 Solución de Células Primarias, Suplemento 1, y 16 pocillos de nucleocuvette tiras microperlas
anti-FITCMiltenyi Biotec130-048-701Siga el protocolo Miltenyi Anti-FITC Microbeads
anti-ratón CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1véase la Tabla 1 para la concentración de existencias
anti-ratón CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1véase la Tabla 1 para la concentración de existencias
anti-ratón IFNγ (XMG1.2)bioXcellBE0055ver Tabla 1 para la concentración
de stock anti-ratón IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051ver Tabla 1 para la concentración
de stock anti-ratón IL-4 (11B11)bioXcellBE0045ver Tabla 1 para la concentración
de stock BioLite 48-well MutlidishThermo Fisher Scientific130187
Albúmina sérica bovina, BSASigma Life CienciaA3059
Enzima Cas9IDT 1081059Alt-R S.p. Cas9 nucleasa V3 (10 mg/mL) - contiene secuencia de localización nuclear
Medioscompletos con 5 ng/mL Medios
IMDM completosIMDM IMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-Glutamina, 1% Pen/Strep, 0.1% BME
MediosRPMI completosRPMI-1640, 10% FBS, 1% L-Glutamina, 1% Pen/Estreptococo, 0.1% BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
crRNAs deseados IDTUsado prediseñado desde el sitio web de IDT: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/Juego de tampones de tinción de factor de transcripciónThermo Fisher Scientific00-5523-00El kit contiene tres reactivos: concentrado de fijación/permeabilización (4x), diluyente de fijación/permeabilización y tampón de permeabilización (10x)
Tampón1x PBS, 1 % FBS, 1 mM
de suero fetal bovino (FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085Inactivar el calor antes de usar (calentar a 56 grados; C durante 45 minutos)
FITC anti-ratón CD4 (RM4-5)Biolegend100510dilución 1/200 (concentración de stock de 0,5 mg/mL)
FITC anti-ratón CD8α (53-6.7)Biolegend100706dilución 1/200 (concentración de stock de 0,5 mg/mL)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZdilución 1/2000
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Ionomicina sal cálcica de Streptomyces conglobatus (1 mg/mL)Sigma Aldrich10634Concentración final recomendada de 500 ng/mL
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081
LS columnasMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Buffer1x PBS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, filtro esterilizado
Mitomicina C (0,5 mg/mL)Millipore SigmaM4287-2MG 
Ratón Naï ve Kit de aislamiento de células T CD4Miltenyi Biotec130-104-453Seguir Miltenyi Naï Protocolo de aislamiento de células T CD4. Este kit incluye Naï Cóctel de anticuerpos de biotina de células T CD4+, microesferas antibiotina y microesferas CD44
Control negativo crRNAIDT1072544alternativa al diseño propio de control negativo
Tampón dúplex libre de nucleasasIDT1072570
tiras de tubo de PCR USAScientific1402-2700
Penicilina EstreptomicinaGibco15140-023
Forbol 12-miristato 13-acetato, PMA (100 µ g/mL)Sigma AldrichP8139Concentración final recomendada de 50 ng/mL
ProSeries Tubos de centrífuga de alto rendimiento de 15 mlAlkali ScientificPS560015 mL tubos cónicos
recombinantes humanos (h) IL-2Peprotech200-02ver Tabla 1 para la concentración de stock
TGF-b1 humano recombinante (derivado de HEK293)Peprotech100-21ver Tabla 1 para stock concentración
murina recombinante IL-12p70Peprotech210-12ver Tabla 1 para la concentración de existencias
recombinante murina IL-4Peprotech214-14ver Tabla 1 para concentración
de existencias recombinante murina IL-6Peprotech216-16ver Tabla 1 para concentración de existencias
recombinante murina IL-7Peprotech217-17Preparar a 100 ng/mL
RPMI 1640 MediaGibco21870-076
TermocicladorApplied Biosystems 4375786Utilizamos este modelo de termociclador, sin embargo, cualquier equipo similar funcionará bien en este protocolo
tracrRNA Atto550 etiquetado...IDT1075928Permite la detección de complejos Cas9-gRNA después de la nuceloefectión utilizando la fluoresencia Atto550 como lectura. Recomendamos este reactivo si es posible.
Tampón1x PBS, 0,5 % TritonX-100, 0,1 % BSA
TritonX-100BioRad161-0407
tracrRNA sin etiquetar;IDT1072534Una opción de tracrRNA más rentable, pero no permite evaluar la eficiencia de la nucleofección de los complejos Cas9-gRNA
Termociclador Veriti, termo rápido de 96 pocillosFisher Scientific4375305Utilizamos este modelo de termociclador, sin embargo, cualquier equipo similar funcionará bien en este protocolo
353002 IMDM + IL-7 IL-7 FACS Triton-X

Referencias

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