Imágenes en vivo extendidas de nichos de células madre germinales hembras de Drosophila melanogaster

Resumen

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar imágenes en vivo de la división asimétrica de las células madre de la línea germinal (GSC) en el nicho ovárico de Drosophila. Utilizamos una línea transgénica que expresa de forma ubicua una fusión de proteína verde fluorescente (GFP) de la proteína espectrosómica Par-1.

Resumen

Los métodos de imagen en vivo permiten el análisis de procesos celulares dinámicos en detalle y en tiempo real. El ovario de Drosophila representa un excelente modelo para explorar la dinámica de una miríada de procesos de desarrollo, como la división celular, la madre, la diferenciación, la migración, la apoptosis, la autofagia, la adhesión celular, etc., a lo largo del tiempo. Recientemente, hemos implementado un cultivo ex vivo extendido e imágenes en vivo del nicho GSC femenino de Drosophila. Utilizando como ejemplo una línea de Drosophila que alberga un transgén GFP::P ar-1, este método permite la visualización de la división asimétrica de las GSCs dentro de su nicho y la descripción de los cambios en la morfología del espectrosoma a lo largo del ciclo celular. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el cultivo ex vivo de Drosophila germaria, lo que permite la visualización prolongada del nicho femenino de GSC. Es importante destacar que este protocolo es ampliamente aplicable a las GSC de imágenes en vivo con múltiples proteínas de interés marcadas con fluorescencia que están disponibles en los centros de almacenamiento y/o en la comunidad de investigación de Drosophila.

Introducción

Las imágenes en vivo de los procesos biológicos son fundamentales para obtener evidencia experimental directa. La combinación de microscopía confocal avanzada y la optimización de metodologías permite la exploración de múltiples eventos biológicos con alta precisión. La optimización de los pasos en protocolos como la manipulación y disección de tejidos, la preparación y conservación de muestras y la configuración de adquisición de microscopía es fundamental para maximizar la fiabilidad y solidez de los resultados obtenidos. Aquí, presentamos un protocolo para monitorear muestras para imágenes extendidas, que está especialmente enfocado en los ovarios de Drosophila melanogaster. El ovario de Drosophila melanogaster es un excelente sistema modelo para el análisis de una amplia gama de procesos de desarrollo. Entre muchos otros, este órgano reproductor de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster contiene un nicho de células madre adultas muy bien definido. Este nicho GSC sustenta el desarrollo de los gametos femeninos durante la edad adulta. Los ovarios de Drosophila están compuestos por aproximadamente 18 ovariolos, donde se desarrollan cámaras de huevos en el germarium. En la punta de cada germario, se mantienen 2-4 GSCs en un nicho celular somático formado principalmente por un filamento terminal de 8-10 células, una roseta de 5-8 células de capuchón y 2-3 células de escolta anteriores (Figura 1A). Este nicho somático proporciona a las GSC señales esenciales y apoyo físico para mantener su tallo, controlar la proliferación y prevenir la diferenciación^1,2,3,4,5.

Las GSCs normalmente se dividen asimétricamente para generar una nueva célula madre que mantiene contacto con el nicho somático y una célula hija, el cistoblasto (CB), que pierde el contacto directo con las células del capuchón somático y se diferencia. Las GSCs y CBs contienen un orgánulo altamente dinámico y citoplasmático, el espectrosoma, cuya función principal es la correcta orientación del huso mitótico durante la mitosis⁶. El CB se divide 4 veces con citocinesis incompleta para desarrollar quistes de 16 células, donde una de las células de la línea germinal se especifica en el ovocito y las otras 15 células se convierten en células nodrizas. El espectrosoma CB se convierte en una estructura ramificada llamada fusoma, que conecta las células germinales interconectadas de 16 células. El espectrosoma está enriquecido en pequeñas vesículas y proteínas esqueléticas como la serina-treonina quinasa Par-1 y el componente de membrana Hu-li tai shao (Hts)⁷. Durante el ciclo celular GSC, el espectrosoma crece por la adición de nuevo material y cambia su forma, lo que permite la identificación de las fases G1, S, G2 y M (Figura 1B)^8,9.

Recientemente hemos implementado un método de cultivo ex vivo del germarium de Drosophila que permite obtener imágenes de GSCs vivas durante un máximo de 16 h. Dado que estas células se dividen una vez cada 15,5 h en promedio⁸, este método permite la filmación de grandes porciones del ciclo celular GSC. Así, en combinación con otras herramientas, nuestro método de cultivo ha permitido la descripción de la morfología del espectrosoma durante el ciclo celular GSC y el análisis de la duración de las diferentes fases del ciclo celular in vivo⁸ (Figura 1C). Aquí, proporcionamos un protocolo detallado de este método de imágenes en vivo extendido respaldado por un video guiado paso a paso que describe la metodología (Figura 2).

Protocolo

NOTA: El paso 1.4 debe realizarse con al menos 2 días de anticipación. Los pasos 2.1 y 2.2 se pueden realizar con 1 día de anticipación.

1. Configuración pre-experimental I

1. Prepare 100 μL de alícuotas de la mezcla antibiótica de estreptomicina/penicilina (10.000 U/mL de penicilina y 10 mg/mL de estreptomicina) y almacene a -20 °C hasta su uso.
2. Prepare 15 mL de las siguientes soluciones con agua pura esterilizada en autoclave, guárdelas a 4 °C y utilícelas en el plazo de un mes: Bicarbonato de sodio (NaHCO₃) 0,1 M pH 8,0 y 0,1% Tween 20.
3. Prepare el siguiente medio de cultivo y la solución en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Use puntas y tubos de filtro esterilizados.
   1. Prepare 2 mL de suero fetal bovino (FBS) sin diluir y almacene a -20 °C hasta su uso en condiciones asépticas.
   2. Prepare el medio Drosophila de Schneider suplementado con una mezcla de antibióticos de 15% de FBS y 0,6% de estreptomicina/penicilina. Preparar 7 mL de alícuotas y almacenar a 4 °C. Una alícuota es suficiente para dos placas MatTek (ver sección 2).
      1. Prepare la solución de Ringer (128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl₂, 4 mM de MgCl₂, 35,5 mM de sacarosa, 5 mM de Hepes en agua pura esterilizada en autoclave; pH 6,9). Prepare alícuotas de 1 mL y almacene a -20 °C hasta su uso.
4. Recoja moscas de 1-2 días de edad que expresen de manera constitutiva y ubicua la proteína Par-1 fusionada con GFP (línea de poli Ubiquitina-mGFP6: :p ar-1) en un nuevo tubo con alimento para moscas suplementado con levadura en polvo. Cultivarlos durante 2 días a 25 °C en una incubadora antes de la disección.
   NOTA: Este paso se puede realizar con cualquier reportero de interés marcado con fluorescencia.

2. Recubrimiento y preparación de la placa inferior de vidrio

1. Coloque una gota de 3 μL de un adhesivo Cell-Tak específico (en lo sucesivo denominado adhesivo de células y tejidos) en el centro del cubreobjetos de una placa recubierta de poli-D-lisina de 35 mm (placa con fondo de vidrio, consulte la Tabla de materiales) sin esparcir manualmente. Utilice puntas estériles.
   NOTA: El adhesivo para células y tejidos debe almacenarse a 4 °C. En el caso de experimentos con dos condiciones genéticas (por lo general, condiciones de control y mutantes), coloque dos gotas individuales y bien separadas del adhesivo en la misma placa de fondo de vidrio. Esto asegurará que ambos antecedentes genéticos se visualicen en las mismas condiciones.
2. Inmediatamente después, añada un volumen igual (3 μL en esta configuración de protocolo) de 0,1 M de NaHCO₃ pH 8,0 con cuidado en la gota adhesiva de 3 μL según lo recomendado por el fabricante y mezcle mediante pipeteo.
3. Para una evaporación completa, incubar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos y luego mantenerla a 4 °C durante la noche para usarla al día siguiente. Alternativamente, incube la placa preparada a 37 °C durante 25 minutos hasta la evaporación completa y proceda directamente al siguiente paso. En ambos casos, mantenga la placa con su tapa. Use puntas estériles.
4. Deje que el plato con fondo de vidrio preparado alcance RT colocándolo en el banco durante 15-20 minutos antes de usarlo.
5. Lave 3 veces el plato preparado cuidadosamente. Evite tocar y alterar la(s) capa(s) adhesiva(s). En cada lavado, agregue 6 μL de agua pura esterilizada en autoclave y luego elimine el agua con una boquilla limpia para cada uno de los tres lavados para eliminar los residuos de la solución de NaHCO₃.
6. Permita la evaporación completa del agua colocando la placa limpia y preparada en RT mientras disecciona durante 5-10 min con la tapa puesta para evitar partículas de polvo.

3. Disección de ovario de Drosophila y aislamiento y montaje de ovariolos

NOTA: La disección de ovario se realiza en solución de Ringer (en lugar del medio de Schneider) sin FBS para evitar la presencia de proteínas que podrían interferir con la adherencia del tejido de la muestra al adhesivo.

1. Limpie un plato de disección de tres pocillos, fórceps y agujas de disección con etanol al 70% antes de comenzar.
2. Agregue un volumen suficiente (~200 μL) de solución de Ringer en cada uno de los tres pocillos.
3. Diseccionar los ovarios de 5 hembras alimentadas con levadura en 200 μL de solución de Ringer en el primer pocillo con la ayuda de dos pares de pinzas siguiendo los procedimientos estándar^10,11. Agarra a la hembra de Drosophila en la intersección del tórax y el abdomen con una de las pinzas. Luego, rasgue suavemente la cutícula en la parte posterior del abdomen y tire de la cutícula del abdomen hasta que los dos ovarios queden expuestos.
4. Transfiera los ovarios disecados al segundo pocillo para reducir la contaminación con restos de otros tejidos o desechos resultantes de la disección.
5. Retire la vaina muscular de 15-20 ovarios con la ayuda de un microscopio estereoscópico (zoom 8X-13.5X) con iluminación de diodo emisor de luz (LED) y pinzas de punta fina. Use un par de pinzas para anclar todo el cuerpo del ovario, y use el segundo para agarrar suavemente una cámara de óvulos en etapa tardía y estírela suavemente hasta que el músculo se rompa y se quede atrás.
   NOTA: Es fundamental evitar daños en los germarios con solo reducir el contacto con esta parte de los ovarios. Retire las cámaras de huevos más antiguas que las etapas 8-9.
6. Transfiera uno por uno los 15-20 ovariolos sin vaina muscular utilizando las pinzas al tercer pocillo que contiene 200 μL de medio de Ringer.
7. Humedecer previamente una punta de 20-200 μL con 0,1% de Tween 20 mediante pipeteo. Esto evita la adhesión de los ovariolos a las paredes plásticas de la punta.
8. Transfiera 6 μL de la solución de Ringer que contiene los ovariolos sin vaina muscular utilizando una punta prehumedecida a la placa adhesiva preparada (mantenida en RT).
   NOTA: Evite todo contacto entre la punta y la capa adhesiva para evitar el desprendimiento de germarios después de la deposición de ovariolo (siguiente paso). Aproximadamente el 30% de los germarios no se adhieren como se esperaba.
9. Para asegurarse de que los ovariolos transferidos se adhieran a la superficie adhesiva, presiónelos con cuidado hasta el fondo de la gota del Ringer hasta que entren en contacto con la superficie adhesiva con una aguja de disección o pinzas><. NOTA: No intente reorganizar los ovarios una vez que se asienten.
10. Llene cuidadosamente la placa MatTek con 3 mL de medio de Schneider suplementado con la mezcla de antibióticos 15% de FBS y 0,6% de estreptomicina/penicilina (paso 1.3). Para evitar el desprendimiento de los ovarios, agregue lentamente 1 mL a la vez alrededor del borde exterior de la placa.
11. Transporte la placa que contiene los ovarios sin vaina muscular sobre una superficie plana hasta la estación de microscopio.

4. Imágenes en vivo usando un microscopio confocal

1. Coloque la placa en el objetivo de 63x de un microscopio de disco giratorio o un microscopio confocal (se puede utilizar un equipo similar) y enfoque la muestra. Seleccione el plano z central para cada germarium.
2. Configure los siguientes parámetros experimentales: tipo de captura: time-lapse 3D, ajuste la potencia del láser de 70/100, longitud de onda de excitación: 488 nm, rango de la pila Z: 30 μm y distancia entre pilas Z: 1,2 μm, duración: 17 h, intervalo entre puntos de tiempo: cada 10 min.
3. Si está disponible, utilizando una opción de múltiples posiciones, redefina las coordenadas XY de las muestras y seleccione un plano Z en el centro de cada germario, ya que las pilas Z estarán centradas en esta posición. Iniciar la adquisición.
   NOTA: Como el ancho normal de un germarium es de 30 μm, cada pila Z tendrá ~25-27 secciones. Dependiendo del confocal, se pueden obtener imágenes de al menos 25 germenios en los intervalos de 10 minutos. Normalmente, se utilizan objetivos de inmersión en aceite de 40x/1,30 NA o 63x/1,40 NA, corregidos por planapo.
4. Analice las imágenes en el tiempo y en el eje Z para visualizar cambios específicos en la morfología del espectrosoma utilizando el software Imaris o ImageJ (Fiji)^12,13. Se muestran los tiempos específicos de su observación (Figura 1B'). Para montar las películas, seleccione manualmente el mejor plano Z en cada punto de tiempo.

Resultados

Con este protocolo extendido de imagen en vivo, podemos registrar la mitosis asimétrica de las CSG femeninas dentro de su nicho sin perturbaciones biológicas aparentes. Para ello, utilizamos germarios que expresan de forma ubicua la proteína GFP::Par-1, la cual permite distinguir entre cinco morfologías distintas del espectrosoma a lo largo del ciclo celular de las CSG: Redonda, Tapón, Barra, Fusión y Signo de exclamación (Figura 1B,C). En una descripción más detallada, obse...

Discusión

Aquí presentamos un protocolo para monitorear el nicho GSC de Drosophila melanogaster durante un período prolongado de tiempo, hasta 16 h. La mayoría de los protocolos para filmar los procesos biológicos de Drosophila ex vivo se centran en ventanas de tiempo más cortas y se pueden encontrar múltiples ejemplos para los discos de las alas imaginales 15,16,17, las gónadas embrionarias^18,...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de vidrio de 9 pocillos	Corning	7220-85	n/a
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma Aldrich	C3881	CaCl2· 2H2O; Para preparar la solución de Ringer
Cell-Tak	Corning	354240	Adhesivo para células y tejidos utilizado para unir células o secciones de tejido a muchos tipos de superficies, incluyendo plástico, vidrio, metal, polímero FEP y materiales biológicos.
Pinzas Dumont #5	Finescience	11252-20	n/a
Dumont #55 Pinzas	Finescience	11255-20	Dimensiones 0,05 mm x 0,02 mm y longitud 11 cm
Suero fetal bovino	Gibco	10500-064	Calificado, inactivado por calor, aprobado por la UE, Origen de América del Sur
Platos con fondo de vidrio	MatTek	P35GC-1.5-10-C Plato de	35 mm, No. 1.5 Cubreobjetos, 10 mm Diámetro de vidrio,  HEPES recubierto de poli-D-lisina
	Sigma Aldrich	H4034	Para preparar la solución de Ringer
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	M1028	MgCl2; Para preparar la solución de Ringer,
portaagujas	Roboz	RS-6061	Mango liviano y hueco de acero inoxidable; 4 3/4" de largo.
Prismáticos Nikon SMZ18	Nikon		https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	10.000 U/mL
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P3911	KCl; Para preparar la solución de Ringer
, Drosophila Medium	Biowest	L0207	Medio de cultivo celular para células de insectos
Bicarbonato de sodio	Sigma Aldrich	S8875	NaHCO3; ≥ 99,5%,
cloruro de sodio en	Sigma Aldrich	S9888	NaCl; Para preparar la solución de Ringer,
sacarosa,	Sigma, Aldrich,	S9378	≥ 99,5% (GC); Para preparar la solución de Ringer,
aguja de disección de tungsteno	, Roboz	RS-6064	0,25 mm, ultrafino, punta de 1 micra (Pk 10)
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416	para biología molecular, líquido viscoso
Levadura en polvo	Sigma Aldrich	51475	n/a

polvo