Una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas

Summary

Este protocolo tiene como objetivo platear de manera estable ensamblajes fusionados dorsal-ventral en matrices de electrodos múltiples para modelar la epilepsia in vitro.

Abstract

Los organoides del cerebro humano son estructuras tridimensionales (3D) derivadas de células madre pluripotentes humanas (hPSC) que recapitulan aspectos del desarrollo del cerebro fetal. La fusión de organoides cerebrales dorsales con ventrales especificados regionalmente in vitro genera ensamblajes, que tienen microcircuitos funcionalmente integrados con neuronas excitadoras e inhibidoras. Debido a su complejidad estructural y a la diversidad de la población de neuronas, los ensamblajes se han convertido en una herramienta útil in vitro para estudiar la actividad aberrante de la red. Los registros de matrices de electrodos múltiples (MEA) sirven como método para capturar potenciales de campo eléctrico, picos y dinámica de red longitudinal de una población de neuronas sin comprometer la integridad de la membrana celular. Sin embargo, adherir ensamblajes a los electrodos para registros a largo plazo puede ser un desafío debido a su gran tamaño y área de superficie de contacto limitada con los electrodos. Aquí, demostramos un método para colocar ensamblajes en placas MEA para registrar la actividad electrofisiológica durante un período de 2 meses. Aunque el protocolo actual utiliza organoides corticales humanos, se puede adaptar ampliamente a organoides diferenciados para modelar otras regiones del cerebro. Este protocolo establece un ensayo electrofisiológico robusto y longitudinal para estudiar el desarrollo de una red neuronal, y esta plataforma tiene el potencial de ser utilizada en el cribado de fármacos para el desarrollo terapéutico en la epilepsia.

Introduction

Los organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) son estructuras 3D espacialmente autoorganizadas que reflejan la arquitectura del tejido y las trayectorias de desarrollo in vivo. Están compuestas por múltiples tipos de células, incluyendo progenitores (células neuroepiteliales, glía radial, progenitores neuronales, progenitores gliales), neuronas (neuronas excitadoras de tipo cortical e interneuronas inhibidoras) y células gliales (astrocitos y oligodendrocitos)^1,2. Los ensamblajes representan la próxima generación de organoides cerebrales, capaces de integrar múltiples regiones cerebrales y/o linajes celulares dentro de un cultivo 3D. Proporcionan una herramienta útil para modelar las conexiones entre varias regiones del cerebro que se asemejan a las contrapartes in vivo, capturar las interacciones entre neuronas y astrocitos para imitar mejor las redes neuronales maduras y complejas, y estudiar el ensamblaje de circuitos neuronales. Por lo tanto, los ensambles se están convirtiendo en una herramienta ampliamente utilizada para recapitular las características distintivas de la fisiopatología de la epilepsia, en la que son necesarias medidas funcionales para interrogar las redes neuronales aberrantes que pueden subyacer a la causa de la enfermedad 3,4,5,6.

Para modelar las interacciones entre las neuronas glutamatérgicas corticales y las interneuronas GABAérgicas, varios grupos desarrollaron organoides separados que se asemejaban al cerebro dorsal y ventral y luego los fusionaron en un ensamblaje de múltiples regiones 7,8,9,10. Aquí, se aplicó un protocolo de cultivo de ensambles previamente descrito con subtipos neuronales regionalmente específicos⁹. Sin embargo, un obstáculo importante es la falta de ensayos funcionales reproducibles para monitorear la actividad de la red neuronal durante el neurodesarrollo. Muchas pruebas funcionales de las redes en organoides arrojan resultados que tienen una alta variabilidad entre lotes de diferenciaciones y líneas celulares. Las técnicas que implican cortar o disociar organoides alteran sus redes inherentes al cortar la conectividad sináptica⁸.

Las matrices de electrodos múltiples (MEA) proporcionan una visión a gran escala de la actividad de la red a lo largo del tiempo con una alta resolución temporal para caracterizar las propiedades electrofisiológicas de los organoides sin interrumpir las condiciones de cultivo o la integridad de la membrana celular¹¹. En comparación con la electrofisiología de la pinza de parche, MEA permite la adquisición de datos de alto rendimiento basada en grandes poblaciones de neuronas en lugar de células individuales. Las plataformas MEA varían en su densidad de electrodos, satisfaciendo diferentes necesidades en la investigación de organoides cerebrales¹². Los sistemas ampliamente utilizados, como se muestra en este protocolo, registran de 8 a 64 electrodos por pozo 13,14,15. Los MEAs de alta densidad con hasta 26.400 electrodos por pocillo permiten aumentar la resolución espacial y temporal, cuantificar la velocidad de propagación del potencial de acción y combinarlos con la estimulación optogenética 14,16,17. Por lo tanto, MEA sirve como una herramienta poderosa para modelar la epilepsia in vitro y un paradigma traslacional para la detección de medicamentos anticonvulsivos.

Uno de los principales desafíos es estabilizar los ensamblajes de gran tamaño en una superficie metálica hidrófoba para grabaciones a largo plazo. Este protocolo describe una metodología detallada para la siembra de ensamblajes intactos en placas MEA para el registro longitudinal a largo plazo junto con ensayos farmacológicos. Las ventajas únicas del protocolo incluyen la unión estable de los ensambles a la superficie del electrodo sin perder la actividad eléctrica, el uso de medios basales neurofisiológicos disponibles comercialmente para acelerar la maduración de la red funcional después de la colocación de placas, la viabilidad de realizar ensayos funcionales posteriores como el tratamiento con medicamentos y una amplia aplicación a organoides generados con otros protocolos específicos de la región.

El objetivo es proporcionar un ensayo funcional con alta resolución temporal para investigar la actividad de la red, examinar los cambios específicos de la enfermedad y probar fármacos con potencial terapéutico en la epilepsia. Se proporcionan instrucciones en video para los pasos más desafiantes de este protocolo, mostrando las técnicas para enchapar ensamblajes en placas MEA, así como grabaciones representativas de estos cultivos.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales que se muestran a continuación se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas éticas de la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Michigan y el Comité de Supervisión de la Investigación de Células Madre Pluripotentes Humanas. Las líneas de iPSC utilizadas en este protocolo y los experimentos representativos se derivaron de fibroblastos de prepucio humano obtenidos de una fuente comercial. Los detalles de las líneas celulares, los reactivos y el equipo utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Derivación de organoides cerebrales específicos del destino a partir de iPSCs

NOTA: Este protocolo contiene información para preparar 3 pocillos en la placa de cultivo de micropocillos a partir de 5 pocillos confluentes (~85%) de una placa de 6 pocillos. El protocolo de mantenimiento de iPSC varía en función de las líneas celulares.

1. Prepare los medios de cultivo celular individuales utilizando la composición detallada en la Tabla 1. Almacenar protegido de la luz a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
2. Enjuague todos los pocillos que se van a utilizar en la placa de cultivo de micropocillos con 1 mL de DMEM/F-12 una vez. Agregue 1 mL/pocillo mTeSR plus + 50 μM Y-27632 y gire la placa a 2000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar las burbujas de aire de los micropocillos. Almacene la placa en una incubadora de 5% CO₂ a 37 °C.
3. Regiones limpias de iPSC diferenciadas con una punta de pipeta P10 estéril bajo el microscopio en un banco de limpieza de flujo laminar. Lave los restos celulares de la monocapa con PBS de 1 mL/pocillo sin calcio ni magnesio.
4. Disocie la monocapa en células individuales añadiendo 1 mL/pocillo de reactivo de disociación celular precalentado y colocando la placa en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 4-7 min (dependiendo de las características y la confluencia de las líneas celulares) hasta que la mayoría de las células se despeguen, con una agitación suave cada 2-3 min.
5. Añadir 4 mL de DMEM/F-12 a cada pocillo para diluir el reactivo de disociación celular y triturar moderadamente con una pipeta serológica de 10 mL. Recoja la suspensión celular de todos los pocillos de la misma línea en un tubo cónico de 50 mL.
6. Centrifugar a 200 x g durante 4 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL y resuspender las células en 2 mL de mTeSR plus + 50 μM Y-27632. Saque 10 μL de suspensión de células, mezcla 1:1 (v/v) con azul de tripán, y cuente las células con un contador de células automatizado.
7. Placa 3 x 10⁶ celdas vivas por pocillo, 3 pocillos por línea. Agregue mTeSR adicional más + 50 μM Y-27632 según sea necesario para llevar el volumen total a 2 mL/pocillo. Gire la placa a 100 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente y vuelva a colocarla en la incubadora.
   NOTA: La placa de cultivo de micropocillos utilizada aquí contiene 300 micropocillos por pocillo, por lo que el recubrimiento de 3 x 10⁶ celdas da como resultado 10,000 celdas/micropocillo.
8. Al día siguiente, realice un cambio de medio volumen retirando suavemente 1 mL de medio y añadiendo lentamente 1 mL de medio mTeSR plus (sin Y-27632) con una punta de pipeta P1000. Mantenga la punta cerca de la superficie del medio y aspire lo más lentamente posible, para no perturbar las células agregantes en la parte inferior.
9. Revise bajo un microscopio invertido un día después del cambio de medio, y se puede ver un contorno claro de cada agregado. Retire el medio original de cada pocillo con las puntas de pipeta P1000.
10. Rocíe moderadamente 0.5 mL de medio de inducción neural (NIM) con dorsomorfina (DM) y SB-4321542 (SB) en cada pocillo con puntas P1000 estériles y cortadas. Inmediatamente, pipetee suavemente los agregados suspendidos en el medio y transfiéralos a una placa de cultivo en suspensión estéril de 10 cm. Repita hasta que se transfieran todos los agregados. NO triturar.
11. Agregue NIM + SB/DM adicional según sea necesario para llevar el volumen total a 10 mL/plato. Coloque la placa en un agitador orbital en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C para evitar la fusión espontánea de agregados. Marque la fecha de transferencia como el día 0 del cultivo de organoides.
12. Desde el día 1 hasta el final, siga la receta de medios en la Tabla 1 y la línea de tiempo de cambio de medios⁹ en la Figura 1. En particular, los organoides se dividen en dos placas de cultivo en suspensión designadas como "dorsal" y "ventral" el día 4.
    NOTA: Hay varios puntos de tiempo clave a tener en cuenta: la expansión de los organoides comienza el día 6, cuando los medios se cambian al medio de diferenciación neuronal (NDM) con EGF/FGF. La diferenciación neuronal es apoyada a partir del día 25 por NDM + BDNF/NT3, y los organoides se mantienen en NDM sin factores de crecimiento a partir del día 46.

2. Marcaje viral y generación de ensamblajes

NOTA: Se recomienda el marcaje viral ^7,9 para reconocer la identidad de cada organoide específico de la región en un ensamble y asignar la actividad electrofisiológica de electrodos específicos a las regiones del ensamble. Es óptimo si solo se siembra un organoide para cada pocillo de MEA. Este protocolo también se puede aplicar a la placa de organoide individual.

1. Calcular los volúmenes de stock de virus y medios de dilución que se van a utilizar: se necesitan 200 μL de medios con virus para cada organoide que se va a etiquetar. Los organoides dorsales se marcan con pAAV1-CAG-tdTomato, normalmente en una proporción de dilución de 1:1000 (v/v), o aproximadamente 2 x 10¹⁰ vg/mL. Para los organoides ventrales, se utiliza el virus 1:300 (v/v) o 2 x 10¹¹ vg/mL pAAV1-mDLX-GFP.
   NOTA: Las diluciones deben ajustarse al efecto deseado y se ven afectadas por el título viral.
2. Caliente la cantidad adecuada de medio a 37 °C. Descongele las existencias de virus almacenadas a -80 °C en hielo. Etiquete suficientes placas de 48 pocillos para acomodar todos los organoides etiquetados.
3. Coloque un vaso de precipitados que contenga un 10% de lejía en el capó. Expulse cualquier material que esté en contacto con virus en el vaso de precipitados. Diluir los virus completamente descongelados en medios de cultivo en tubos cónicos separados de 15 mL, etiquetados como "dorsal" y "ventral".
4. Traslade los organoides del día 56 de las placas de cultivo a las placas de 48 pocillos. Se recomienda un organoide por pocillo para evitar la fusión espontánea en cultivo estático. Elimine la mayor cantidad posible de medios de cultivo residuales.
5. Agregue 200 μL de mezcla de virus y medios a cada pocillo, respectivamente. Vuelva a colocar las placas en la incubadora de 5% CO₂ a 37 °C. Incline las placas sobre una placa vacía estéril para ayudar a concentrar las partículas virales en el fondo del pocillo y optimizar la eficiencia de la transducción.
   NOTA: Las partículas virales tienden a hundirse hasta el fondo del tubo cónico de 15 mL, por lo que es muy importante invertir con frecuencia el tubo para mezclar los virus con los medios antes de agregarlos a cada pocillo para garantizar una eficiencia de transducción uniforme para todos los organoides.
6. Al día siguiente (día 57), agregue 800 μL adicionales de medio de cultivo a cada pocillo para llevar el volumen total a 1 mL/pocillo.
7. Tres días después (día 60), realice un cambio completo de medio en los organoides marcados. Blanquea cualquier material que esté en contacto con partículas virales.
8. Tres días después (día 63), verifique la expresión de fluorescencia bajo un microscopio invertido de epifluorescencia. Si la señal es fuerte, comience a generar ensamblajes (consulte el paso 2.9).
9. Enjuague todos los organoides marcados con PBS de 1 mL/pocillo dos veces para evitar la contaminación cruzada por las partículas virales restantes durante la fusión de organoides. Utilice una punta de pipeta P1000 cortada para transferir un organoide ventral a cada pocillo dorsal (o viceversa) y vuelva a etiquetar la placa de ensamblaje en consecuencia. Incline las placas como en el paso 2.5 para una mejor fusión.
10. Realice cuidadosamente un cambio de medio volumen 3 días después del procedimiento de fusión (día 66) sin interrumpir los ensamblajes. Por lo general, se tarda alrededor de una semana en formar ensamblajes estables (día 70).

3. Colocación de ensamblajes en placas MEA pretratadas

NOTA: Se necesitan al menos 4 días para completar los procedimientos de preparación de la superficie de las placas MEA antes de enchapar los ensamblajes. Para ahorrar tiempo, la fusión de organoides dorsales y ventrales (es decir, el paso 2.9) y el pretratamiento de MEA se pueden realizar en paralelo.

1. Preparar reactivos para el pretratamiento y recubrimiento de superficies.
   1. Para preparar una solución de detergente/enzima al 1%, disuelva 0,5 g de polvo de enzimas/detergente en 50 ml de agua desionizada. Agite el vórtice a fondo hasta que el polvo se disuelva por completo. Esterilice la solución con un filtro de vacío superior de tubo estéril en la cabina de bioseguridad antes de agregarla a los pocillos de MEA. Hacer fresco antes de cada uso.
      NOTA: El detergente/enzima esteriliza la superficie de MEA, elimina los aceites residuales del proceso de fabricación de MEA y garantiza que la superficie sea lo suficientemente hidrófila como para promover interacciones con el compuesto hidrofílico polietilemina (PEI)¹⁸.
   2. Para preparar una solución de PEI al 0,07%¹⁹, comience haciendo una solución de PEI al 7% mezclando 1 mL de solución de PEI al 50% en un tubo cónico de 15 mL con 6 mL de tampón de borato 1x. Diluir 1 mL de solución de PEI al 7% en 99 mL de tampón de borato 1x para lograr la concentración final de trabajo. Para la esterilización, filtre a través de una unidad de filtro de 0,22 μm en la cabina de bioseguridad antes de usar.
      NOTA: El PEI, un polímero con carga positiva, se utiliza en el proceso de recubrimiento primario para facilitar la unión de un recubrimiento secundario con carga negativa con matriz de membrana basal (BMM) y los ensamblajes²⁰. Extraiga 1 mL de PEI al 50% vertiendo en lugar de pipetear en el tubo cónico, ya que la solución madre es muy viscosa. La cantidad necesaria se puede medir más fácilmente pesándola en un tubo cónico, y la solución de PEI al 50% tiene una densidad de 1,08 g/mL. La solución de PEI al 7% puede almacenarse en alícuotas de 1 ml a -20 °C durante un máximo de un mes. Lleve a cabo todos los pasos posteriores en el gabinete de bioseguridad.
2. Teniendo en cuenta el tamaño de cada ensamble, se utilizan placas MEA de 6 pocillos con 64 electrodos por pocillo para acomodar un ensamblaje por pocillo. Calcule el número de placas MEA necesarias para los experimentos a fin de garantizar suficientes réplicas biológicas.
3. Agregue 1 mL de solución de detergente/enzima al 1% a cada pocillo de una placa de MEA estéril. Tenga cuidado de no dañar los electrodos con la punta de la pipeta. Si utiliza un aspirador de vacío para lavados, no permita que la punta toque la guía de electrodos. Incubar en una incubadora a 37 °C durante 2 h.
4. Retire el detergente/enzima y lave cada pocillo cinco veces con 1,5 ml de agua desionizada estéril. Dado que el detergente/enzima no es biocompatible, es importante asegurarse de que los productos químicos restantes se laven por completo.
5. Llene cada pocillo con 1 mL de medio de cultivo para el preacondicionamiento. Vuelva a colocar las placas a 37 °C en la incubadora con 5% de CO₂ durante 2 días. La exposición de la superficie de MEA a las condiciones de cultivo celular promueve la adhesión celular.
6. Retire el medio de cultivo y cubra los electrodos de MEA en cada pocillo con 50 μL de solución de PEI al 0,07% para el recubrimiento primario. Incubar a 37 °C durante 1 h.
7. Aspire la solución de PEI por completo. Lave cada pocillo con 1 mL de agua desionizada estéril. Realiza 3 lavados rápidos en total. Seque las placas a temperatura ambiente durante 15 minutos en la cabina de bioseguridad sin tapa.
8. Cubra el área del electrodo en cada pocillo con 50 μL de BMM 1:20 (v/v) diluido en medios de cultivo para el recubrimiento secundario. Vuelva a colocar las placas MEA en la incubadora a 37 °C durante la noche. Agregue agua estéril a los compartimentos que rodean los pozos para garantizar suficiente humedad durante todo el curso del recubrimiento.
9. Al día siguiente, aspire BMM diluido con vacío, dejando una capa delgada en la superficie. Si se ha formado una capa gruesa, rocíe enérgicamente el área de contacto del electrodo con medios de cultivo con una punta de pipeta P1000. Lave tantas veces como sea necesario para eliminar los trozos gruesos.
   NOTA: El BMM grueso residual puede interferir con el contacto del electrodo con las celdas.
10. Recoja un ensamblaje con una punta P1000 ampliamente cortada y colóquelo encima de los electrodos en un pocillo mientras transfiere la menor cantidad de medios posible.
11. En una campana de flujo laminar bajo un endoscopio de disección, empuje cuidadosamente el conjunto con una aguja de disección estéril o una punta P20 hasta la ubicación deseada, donde los organoides dorsales y ventrales pueden cubrirse principalmente con electrodos. Utilice una punta P20 para eliminar el líquido alrededor del conjunto. Repita esto para todos los ensamblajes o un subconjunto, lo que se puede hacer en unos minutos.
    NOTA: Trate de NO tocar ni rayar la superficie MEA con la punta de la pipeta y/o la aguja. Trate de NO pinchar ni rasgar el conjunto con las puntas de las pipetas. Termine de enchapar lo más rápido posible para evitar que el organoide se seque por completo.
12. Incubar los ensambles a 37 °C durante 10 min (sin medios). Transfiera las placas de la incubadora a una campana de flujo laminar y aplique 2-3 gotas pequeñas de BMM 1:50 diluidas en medios de cultivo sobre los ensamblajes bajo un endoscopio de disección. Incubar a 37 °C durante otros 30 min.
13. Agregue con cuidado 3 gotas de medio de cultivo cerca de los ensamblajes bajo un endoscopio de disección. Esto mantiene los organoides hidratados. Incubar a 37 °C durante 1 h.
    NOTA: Si el ensamblaje se mueve o flota en cualquier paso posterior, el enchapado debe reiniciarse desde el paso 3.11.
14. Cada hora, agregue cuidadosamente 20-50 μL de medio de cultivo celular a cada pocillo bajo un endoscopio de disección. Esto se puede hacer en el transcurso de un día. El objetivo es alcanzar al menos 250 μL de volumen total al final del día.
15. Al día siguiente, compruebe si todos los ensamblajes están asentados y estabilizados bajo el visor de disección. Añada 750 μL adicionales de medio de cultivo para alcanzar un volumen total de 1 mL/pocillo. Deje las placas intactas durante al menos 2 días.
16. Realice cuidadosamente los cambios de medios semanales sacando 500 μL de medio de cultivo y agregando 700 μL de medio basal neurofisiológico. El volumen adicional de medios agregados representa la evaporación y se puede ajustar dependiendo de la cantidad de evaporación que tenga la placa de MEA que se esté utilizando. Agregue agua estéril alrededor de los pozos según sea necesario para minimizar la evaporación de los pozos MEA.

4. Registro de MEA y análisis de datos

1. Comience el registro de MEA aproximadamente una semana después de cambiar a medios basales neurofisiológicos (generalmente alrededor del día 78).
2. Espere hasta que la cámara de grabación alcance la temperatura establecida (normalmente 37 °C). Transfiera una placa al dispositivo y deje que se equilibren durante al menos 5 minutos antes de grabar.
3. Configuración en vivo de hardware
   1. Establezca la frecuencia de muestreo, es decir, la velocidad a la que se registran los datos de voltaje bruto. Se recomienda la configuración predeterminada (12,5 kHz).
   2. Especifique el modo analógico (normalmente picos neuronales, como en este caso) para configurar el ancho de banda y la ganancia del hardware para aplicaciones concretas. Para la supervisión visual de la actividad durante la grabación, utilice los módulos Spike Detector y Burst Detector .
      NOTA: La configuración analógica afecta la forma en que se registran los datos de voltaje bruto y no se puede cambiar después de registrar los datos.
   3. (Opcional) Aplique un filtro digital de hardware a los datos de grabación. Las opciones de filtro de paso bajo incluyen una ventana Kaiser de 2 kHz o 3 kHz. La configuración predeterminada se puede modificar después de seleccionar la configuración analógica.
   4. Se establece en la referencia por mediana (valor predeterminado), que es muy recomendable para la grabación neuronal, como en este caso. La referenciación mejora la calidad de las señales de baja amplitud al reducir la interferencia de ruido común a los grupos de canales.
      NOTA: Los parámetros anteriores se pueden ajustar según sea necesario en función de la actividad observada en los ensamblajes, pero deben mantenerse consistentes para todas las grabaciones de un experimento dado.
4. Agregue mapas de placas y descripciones (si es necesario). Importe el mapa de placas de la grabación anterior para la misma placa para garantizar la coherencia y facilitar el procesamiento de datos por lotes. Asegúrese de que los archivos tengan el nombre correcto.
5. Si las señales se ven bien (ruido y artefactos mínimos), registre los datos sin procesar. Por lo general, de 2 a 5 minutos de grabación son suficientes para obtener una muestra representativa.
6. Registre longitudinalmente la actividad eléctrica una o dos veces por semana, durante 5-15 min, dependiendo del diseño experimental. Espere al menos 24 horas después de cada cambio de medio antes de comenzar la siguiente ronda de grabación, ya que la actividad eléctrica disminuye inmediatamente después de cada cambio de medio.
7. (Opcional) Si es necesario localizar la actividad eléctrica y distinguirla entre organoides dorsales y ventrales, o si es necesario analizar la actividad de cada electrodo por separado, obtenga una imagen de cada ensamblaje en campo claro y epifluorescencia (Figura 2B) después de cada registro.
8. Al analizar los datos, aplique una configuración de análisis, que incluya un detector de picos/ráfagas y un compilador de estadísticas. Utilice un umbral adaptable establecido en 5,5-6 desviaciones estándar desde la línea de base para la detección de picos. Identifique las ráfagas como una actividad con ≥5 picos en 100 ms¹³. Defina la actividad de la red cuando más del 25% del total de electrodos activos se disparan dentro de los 100 ms con un mínimo de 50 picos por ráfaga de red^13,14.
   NOTA: Estos parámetros se modulan en función de las características de disparo de un experimento específico. Para aumentar la sensibilidad de los picos de baja amplitud, se puede reducir el umbral adaptativo para la detección de picos. Para la detección de ráfagas, se pueden utilizar varios métodos y los parámetros se pueden adaptar para detectar ráfagas de picos que difieren significativamente de la actividad en segundo plano. Los parámetros de actividad de la red pueden modularse a un porcentaje menor de electrodos, especialmente cuando los ensambles no cubren todo el campo de electrodos. Todos los parámetros deben permanecer constantes durante la duración de un experimento para permitir comparaciones longitudinales.
9. Ejecute el módulo Compilador de estadísticas para el procesamiento por lotes mientras se reproducen los datos registrados. Exporte métricas avanzadas y/o archivos de salida de picos para análisis avanzados.
   NOTA: La salida de métricas avanzadas contiene .csv archivo con promedios de electrodos, pocillos y grupos para el disparo medio, la ráfaga y la sincronía. La salida de picos (archivo .spk) incluye trazas de forma de onda para todos los picos, que se pueden importar a otras plataformas para análisis avanzados, por ejemplo, clasificación de picos.

5. Ensayo farmacológico de punto final y reciclaje de placas

NOTA: Los ensayos de tratamiento farmacológico se pueden realizar después de que los ensamblajes estén lo suficientemente maduros y la actividad eléctrica alcance su punto máximo. El registro de la actividad basal/pre-tratamiento y la actividad post-tratamiento debe realizarse el mismo día.

1. Agregue 1-10 μL de solución de medicamento justo encima del ensamblaje y agite suavemente la placa para asegurar una mezcla uniforme. En algunos casos, se recomienda un tiempo de incubación más prolongado en medios que contengan fármacos, por ejemplo, ensayos de tratamiento farmacológico relacionados con sinapsis con agonistas/antagonistas del receptor de glutamato/GABA (Figura 2E) (consulte la sección de Resultados para obtener más detalles).
   NOTA: Se recomienda agregar una pequeña cantidad de solución de medicamento a cada pocillo para lograr una concentración de trabajo final, ya que un gran cambio de volumen disminuirá temporalmente la actividad eléctrica en general. Es importante asegurarse de que la adición de un vehículo en el que se disuelven los fármacos de interés no provoque cambios significativos en los parámetros electrofisiológicos.
2. Realice suficientes lavados con PBS (generalmente 3) y lave los medicamentos después de la grabación posterior al tratamiento. Realice un registro adicional al día siguiente después del lavado del medicamento para ver si la actividad eléctrica vuelve al nivel basal.
3. Opcionalmente, pipetee a la fuerza los medios para separar los ensamblajes de la placa MEA al final de las grabaciones para realizar experimentos adicionales, por ejemplo, imágenes en vivo, fijación con paraformaldehído al 4% para inmunotinción de montaje completo o lisis para extracción de ARN o proteínas.
4. Para fines de análisis, utilice al menos tres réplicas técnicas y biológicas para cada condición. Exprese los datos electrofisiológicos como una media de n ≥ 3 se reproduce.
5. Para reciclar la placa al final de los experimentos, aspire los medios restantes después de quitar los ensamblajes adjuntos. Lavar una vez con PBS estéril. Cubra completamente el área metálica con 200 μL/pocillo de tripsina-EDTA al 0,25% y vuelva a colocar la placa en una incubadora a 37 °C durante la noche.
6. Al día siguiente, aspire tripsina, lave dos veces con etanol estéril al 70% y tres veces con agua desionizada estéril.
7. Seque al aire la placa en el gabinete de bioseguridad durante 15 minutos sin la tapa o hasta que esté completamente seca. Selle la placa limpia en una bolsa de plástico y guárdela a temperatura ambiente hasta que la use en el futuro.
   NOTA: Una placa MEA bien limpia se puede reutilizar tres veces sin perder significativamente la calidad de grabación.

Results

Los ensamblajes dorsal-ventrales humanos se colocaron en una placa MEA de 6 pocillos (n = 6 por diferenciación, 3 diferenciaciones), y cada pocillo contenía 64 electrodos (Figura 2A). Nueve de los diez ensamblajes planeados para el registro longitudinal estuvieron firmemente unidos a los electrodos durante más de 50 días in vitro (Figura 2D). 6 de los 8 ensambles designados para ensayos farmacológicos se resolvieron con éxito a través de la fase de lavado con una actividad de red apropiada para la etapa de desarrollo (Figura 2E). Se muestran imágenes de contraste de fase y fluorescencia de un pocillo representativo (Figura 2B), en el que se distinguen fácilmente los organoides dorsales marcados con AAV-CAG-tdTomato y los organoides ventrales marcados con AAV-mDLX-GFP ^7,9.

La actividad de las neuronas en un MEA se puede analizar para evaluar la excitabilidad celular general y la actividad de la red, a través de una variedad de parámetros. Las tasas generales de disparo en todo el cultivo proporcionan información sobre la excitabilidad celular y de la red, mientras que la frecuencia de ráfagas sincronizadas a través de múltiples electrodos indica el rango de redes de neuronas sinápticamente activas. Múltiples picos repetidos que ocurren a través de electrodos espacialmente distintos durante un corto período de tiempo (estallido de la red) pueden servir como un correlato biológico para la actividad similar a las convulsiones, aunque los ensamblajes en los MEA siguen siendo limitados en comparación con un organismo completo que puede tener convulsiones de buena fe . La Figura 2C ilustra los patrones de estallido de la red de ensamblajes cultivados en medios basales neurofisiológicos disponibles comercialmente en los días 84 y 91, con un aumento de la duración del estallido en el punto de tiempo posterior probablemente debido a la maduración funcional de las neuronas. En este caso, la actividad celular y de la red aumenta gradualmente desde el día en que se platean los ensamblajes, generalmente alcanzando su punto máximo en el día 92 y casi desvaneciéndose en el día 125 (Figura 2D). Es probable que el aumento de la maduración en la etapa posterior contribuya a la duración prolongada de la ráfaga sincronizada en el punto temporal de grabación posterior.

La bicuculina, un antagonista del receptor GABA_A , mejora la actividad sincronizada de la red de los ensamblados, como lo demuestran las tasas de disparo significativamente más altas y las frecuencias de ráfaga (de red) después de agregar el fármaco en el día 108 (Figura 2E). Esto es similar a lo que se ha demostrado previamente en registros de electrofisiología de una sola célula²¹. Se realizó un análisis de potencia para el ensayo farmacológico utilizando G*Power3 basado en un tamaño del efecto de 0,94 y un alfa de 0,05. Se requirió una muestra total de 15 ensamblajes con tres grupos de igual tamaño de n = 5 para lograr una potencia de 0,8 (Figura 2E). Se incluye un control del vehículo para verificar que la respuesta es un verdadero evento de señalización y no simplemente un cambio en la intensidad de la señal que puede surgir de la adición de una pequeña cantidad de medios (Figura 2E).

Figura 1: Resumen del estudio. Protocolo para la generación y colocación de ensamblajes marcados duales en MEA cronología del protocolo de diferenciación que detalla las etapas críticas y los suplementos de moléculas pequeñas correspondientes (para obtener información adicional sobre la composición, consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Registro de ensamblajes de MEA. (A) Mapa de calor de la actividad media de disparo de una sola placa MEA (n = 6 pocillos) en el día 82, es decir, el día 10 posterior al recubrimiento. Todos los pozos representan cultivos de la misma condición y genotipo. (B) Imágenes representativas de contraste de fase y confocales del ensambladoide, con el ensambloide dorsal marcado con rojo y ventral con verde. Las puntas de flecha blancas indican interneuronas GABAérgicas migradas desde el lado ventral al dorsal. Barra de escala = 500 μm. (C) Trazados ráster representativos durante 120 s de tiempo de registro de un solo pozo. Las ráfagas de red se resaltan con un cuadro morado. Se muestran dos puntos de tiempo separados, el Día 78 (1 semana después de la siembra, día de inicio de la grabación) y el Día 92 (3 semanas después de la siembra, también cuando la actividad alcanza su punto máximo). (D) Cuantificación de las velocidades medias de disparo, la frecuencia de ráfaga y la frecuencia de ráfaga de la red desde el día 78 hasta el día 127 (n = 3 diferenciaciones, 3 ensamblajes/diferenciación). Cada curva indica un ensamblaje individual, compilado a partir de 3 diferenciaciones (codificadas por colores). La curva roja muestra el valor medio. (E) Cuantificación de los resultados del ensayo de bicucullina (n = 6 ensambles/condición). El gráfico de barras se mostró como media ± SEM. Cada punto representa un ensamblado, compilado a partir de 3 lotes de diferenciación (codificados por colores). Se realizó una prueba de Friedman no paramétrica. **p < 0,01; ns, no significativo. MEA, matrices multielectrodos. El mapa de calor y los gráficos ráster se generan utilizando el software analítico Neural Metric Tool. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Componentes de los medios en diversas etapas de diferenciación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

Se han utilizado métodos basados en MEA para registros electrofisiológicos de la actividad de la red en ensamblajes derivados de iPSC para el modelado in vitro de la epilepsia^22,23. Esta plataforma propuesta que integra conexiones sinápticas excitadoras e inhibidoras tiene el potencial de abordar los mecanismos de hiperexcitabilidad neuronal y el papel de las interneuronas corticales en el proceso de epileptogénesis. Además, esta plataforma permite la estabilización de ensamblajes y la recopilación de datos electrofisiológicos longitudinales durante unos 50 días in vitro, incluso en presencia de perturbaciones farmacológicas, proporcionando así un enfoque para probar compuestos con potenciales dianas terapéuticas.

La estabilización de ensamblajes maduros y relativamente grandes en una superficie hidrofóbica durante un largo período in vitro ha sido un desafío técnico. Para superar este obstáculo, se aplica la estrategia de doble recubrimiento con productos químicos cargados a la inversa para facilitar la adherencia a corto y largo plazo de los organoides a la superficie del electrodo. Este protocolo optimiza el método²⁴ utilizado anteriormente al cambiar los reactivos de recubrimiento de placas de poli-L-ornitina (PLO)/laminina a PEI/BMM, logrando una unión sólida con altas tasas de éxito y baja toxicidad. Además, este sistema de cultivo estabilizado a largo plazo tiene el potencial de producir datos de alto rendimiento. Por ejemplo, el preetiquetado con virus duales puede complementar la clasificación de picos por electrodos individuales para localizar y comparar la actividad de diferentes regiones. La plataforma propuesta también proporciona una herramienta estable para registrar potenciales de campo locales, que es muy relevante para la función de las interneuronas sin interrumpir la estructura intacta de los ensamblajes²⁵. La principal limitación de este protocolo es que los ensamblajes se aplanan después del enchapado, lo que genera preocupaciones sobre si las estructuras 3D iniciales se conservan o no. El cultivo de organoides alrededor de los electrodos utilizando plataformas MEA más avanzadas que envuelven un organoide con electrodos²⁶ podría superar la limitación.

Uno de los principales obstáculos de los métodos basados en MEA para el registro electrofisiológico de organoides es la variabilidad y reproducibilidad de los hallazgos experimentales a través de protocolos de diferenciación e incluso lotes de diferenciación. Estudios previos muestran que la actividad de red de las neuronas medida por MEA depende del estado de maduración neuronal de los organoides dorsales y ventrales²⁷. La grabación de ensamblajes en un punto de tiempo posterior con neuronas y circuitos relativamente maduros es una forma de mejorar la consistencia. Además, la elección de sistemas MEA de pocillos múltiples que generen datos de alto rendimiento permitirá comparaciones estadísticas a la luz de la variabilidad experimental. Si la actividad electrofisiológica de un cultivo es inconsistente con lo que se espera en un momento dado, será importante y útil recolectar el cultivo intacto de la plataforma funcional para las medidas de control de calidad, incluido el análisis inmunocitoquímico y transcriptómico.

Lo primordial de la plataforma propuesta es integrar funcionalmente neuronas corticales excitadoras especificadas regionalmente en el lado dorsal e interneuronas inhibidoras en el lado ventral. Los protocolos para la generación de organoides específicos de la región cerebral encontrados en la literatura difieren ampliamente en relación con las condiciones del medio, el momento de los cultivos, el rendimiento y los perfiles de maduración, entre otros factores²⁸. Si bien este protocolo es específico de la corteza y la eminencia ganglionar en su capacidad para generar neuronas excitadoras e interneuronas GABAérgicas, se pueden utilizar técnicas de diferenciación bien establecidas para generar neuronas derivadas de iPSC que muestran otras identidades, como las neuronas motoras²⁹ y las células de Purkinje³⁰. Por lo tanto, la plataforma propuesta tiene el potencial de modelar circuitos neuronales entre la corteza cerebral y la médula espinal / cerebelo. Después de algunas optimizaciones relacionadas con el momento de la siembra y la visualización de los tipos de células con el marcaje viral, este método se puede trasladar a otros modelos de enfermedades además de la epilepsia, como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA)¹⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Placas de cultivo no tratadas con TC	Corning	08-772-32	Para cultivo en suspensión en el agitador
Vaso de precipitados de 100 mL	Fisher Scientific	FB100100
100% etanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-mercapttoetanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Concentración de trabajo 100 μ Placa
de cultivo celular M de 48 pocillos	Fisher Scientific	50-202-140
Placa de cultivo celular de 6 pocillos	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Centrífuga refrigerada	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspendido 5mg en DMSO para obtener 1 mM de solución madre. Alícuota y congelación en &menos; 80 °C. Diluir a 1:10.000 para su uso. Concentración de trabajo 100 nM.
Contador celular automatizado	Thermo Fisher	AMQAX2000
Placas de 6 pocillos Axion CytoView MEA	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro Plataforma MEA	Axion Biosystems	Maestro	Con control ambiental de temperatura
Suplemento B-27 (regular, con vitamina A)	Thermo Fisher	21985023
suplemento B-27 (sin vitamina A)	Thermo Fisher	12587010
Matriz de membrana basal- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Baño de perlas	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Microscopio invertido de sobremesa	Olympus	CKX53	Mantenido en flujo laminar banco limpio
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Concentración de trabajo 10 μ M
Bleach	CLOROX	67619-26
Tampón de borato 20x	Thermo Fisher	28341	Concentración de trabajo a 1x
medio BrainPhys	StemCell Technologies	5790
Reactivo de disociación celular (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron agitador orbital	HT-Infors	I69222
Detergente/enzima (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Concentración de trabajo 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamina	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorfina	Sigma-Aldrich	P5499	Disuelva 5 mg en DMSO para obtener 10 mM de solución madre. Alícuota y congelación en &menos; 20 °C. Diluir a 1:2000 para su uso. (concentración de trabajo 5 μ M)
D-PBS sin calcio o magnesio	Thermo Fisher	14190144
Neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF)	Peprotech	450-10	Disolución 100 μ g en 1 ml de PBS a 100 μ g/ml. Alícuota y congelación en &menos; 20 °C. Diluir a 1:5000 para su uso. (concentración de trabajo 20 ng/mL).
Suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher	35050061
Hemacitómetro	Elección Microscopía Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Incubadora de cultivo celular con control de humedad	Thermo Fisher	370	ajustada a 37 &grados; C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Alícuota y congelar a &menos; 80 °C. Precipitará si se descongela a temperatura ambiente. Las alícuotas congeladas deben colocarse directamente en 37 ° C antes de usar.
Reemplazo de suero knockout (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medio + suplementos)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, medio estabilizado sin alimentador para células iPSC humanas
Suplemento de N2	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Aminoácidos no esenciales (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Disolución 100 μ g en 1 ml de PBS a 100 μ g/ml. Alícuota y congelación en &menos; 20 °C. Diluir a 1:5000 para su uso. (concentración de trabajo 20 ng/mL).
NuFF Fibroblastos del prepucio neonatal humano	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Pipeta de penicilina/estreptomicina	Thermo Fisher	15140122
(P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Puntas P1000 cortadas en autoclave para la recogida de organoides
Poli (etileneimina) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Diluir el caldo en tampón de borato estéril. Concentración de trabajo 0,07%. Ver detalles en manuscrito.
Factor de crecimiento epidérmico humano (EGF) recombinanteR	& D Systems	236-EG-200	suspendido en PBS. Alícuota y congele a -20 °C.
Factor de crecimiento de fibroblastos humanos (FGF) recombinante-básico	Peprotech	100-18B	suspendido en PBS. Alícuota y congele a -20 °C.
Factor neurotrófico derivado del cerebro humano (BDNF) recombinantePeprotech		450-02	Centrífuga brevemente antes de la reconstitución. Disolver 100 μ g en 1 ml de PBS a 100 μ g/ml. Alícuota y congelación en &menos; 20 °C. Diluir a 1:5000 para su uso. (concentración de trabajo 20 ng/mL).
Ácido retinoico (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Disuelva 100 mg en 3,3 ml de DMSO para obtener 100 mM de solución madre. Alícuota de la acción 100 μ L/tubo y congelar a &menos; 80 °C. Toma 200 μ L de 100 mM de caldo y diluya 10x (agregue 1,8 ml de DMSO) para hacer 10 mM de stock. Alícuota 50 μ L/tubo y almacenar en &menos; 80 °C. Diluir a 1:100.000 para su uso. (concentración de trabajo 100 nM).
Inhibidor de ROCK Y-27632	Tocris	1254	1:200 de 10 mM
SAG (agonista suavizado)	Selleckchem	S7779	Alícuota y congelar a &menos; 80 °C. Concentración de existencias 1mM. Utilizar a 1:10.000 diluciones (concentración de trabajo 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Disuelva 5 mg en 1,3 ml de DMSO para obtener 10 mM de solución madre. Alícuota y congelación en &menos; 80 °C. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 μ M)
Llenadora de pipetas serológicas	Fisher Scientific	14-387-166
Filtro superior de tubo de vacío Steriflip	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Campanas de cultivo celular estériles	Baker Company	SG-600
Solución azul de tripano (0,4%)	Thermo Fisher	15250061
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher	25200056
Microscopio estereoscópico Zoom	Olympus	SZ61/SZ51	Mantenido en banco de limpieza de flujo laminar