Artículo de método

Imágenes tridimensionales de los tejidos aórticos en la aterosclerosis

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DOI:

10.3791/67400

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25 de octubre de 2024

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1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos protocolos optimizados de limpieza de tejidos para obtener imágenes de la aorta murina en tres dimensiones (3D). Delineamos procedimientos de última generación para la inmunotinción, el aclaramiento óptico y la obtención de imágenes con la intención de definir la proximidad anatómica del sistema nervioso periférico con las placas ateroscleróticas y la adventicia en la aterosclerosis.

Resumen

Investigaciones recientes han avanzado en la comprensión de la aterosclerosis como una enfermedad inflamatoria crónica transmural que afecta a las tres capas de la pared arterial, incluida la placa íntima, los medios y la adventicia, que forma la capa de tejido conectivo externo de las arterias. Nuestros estudios recientes han sugerido que la adventicia es utilizada por el sistema nervioso periférico como un conducto para llegar a todas las células de los tejidos. También encontramos que el sistema nervioso periférico, es decir, el sistema nervioso sensorial y simpático, sufre importantes procesos de remodelación que involucran la neogénesis de las redes de axones adyacentes a las placas ateroscleróticas. En este contexto, la comprensión de la estructura de la red neuronal y sus interacciones con los componentes vasculares de las arterias enfermas es prometedora para una mejor comprensión de la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares. Para lograr estos objetivos, se necesitan métodos para visualizar la arquitectura subcelular de las arterias sanas y enfermas intactas junto con sus compartimentos perivasculares circundantes. La limpieza de tejido permite obtener imágenes intactas de tejido profundo de compartimentos de tejido más grandes que, de otro modo, serían inaccesibles. Permite la obtención de imágenes volumétricas de arterias intactas mediante la integración de herramientas de etiquetado, aclarado, imágenes microscópicas avanzadas y procesamiento de imágenes. Aquí, describimos dos enfoques de limpieza de tejidos pasivos distintos pero complementarios, es decir, el aclaramiento acuoso de 2,2-tiodiethanol (TDE) y la obtención de imágenes tridimensionales de aclaramiento de órganos aclarados con solvente (iDISCO) habilitada para inmunomarcaje basado en solventes para obtener imágenes de segmentos aórticos aislados o aorta completa in situ en todo el ratón.

Introducción

Las técnicas histológicas proporcionan una comprensión básica de las muestras biológicas a través de la sección de tejidos/órganos. Sin embargo, la delineación de interacciones anatómicas complejas célula/célula y tejido/tejido en tres dimansiones (3D) ha sido, hasta hace poco, difícil de lograr. Esta necesidad insatisfecha fue particularmente evidente en el contexto del sistema cardiovascular en condiciones sanas y enfermas. La obtención de imágenes de tejidos intactos ha sido un desafío en el pasado debido a la absorción y dispersión de la luz, lo que los hace intrínsecamente opacos. La limpieza de tejidos hace que la muestra biológica intacta sea transparente al minimizar estas limitaciones. Los desarrollos recientes en las técnicas de limpieza de tejidos permiten obtener imágenes 3D de alta resolución de tejidos transparentes no seccionados para proporcionar información considerable sobre la microarquitectura celular y estructural de órganos completos con una resolución micrométrica, lo que permite la definición de redes de conectividad anatómica.

La aterosclerosis involucra tres capas de la pared arterial, incluida la capa íntima interna, la capa media media y la capa de tejido conectivo externo, que se denomina adventicia. Las placas ateroscleróticas en la capa interna de las arterias han sido un objetivo convencional de investigación durante décadas 1,2. Sin embargo, la capa adventicia contiene vasos sanguíneos, vasos linfáticos y fibras nerviosas del sistema nervioso periférico. Además, la adventicia está conectada con los componentes del tejido adiposo perivascular y del tejido neuronal, incluidos los nervios periféricos y los ganglios perivasculares 3,4. Se sabe que los nervios periféricos utilizan los adventicia como conductos para llegar a los tejidos diana distantes y, de hecho, a las células5. Nuestros estudios recientes han avanzado en el progreso de la comprensión de las interacciones de múltiples capas de los principales sistemas biológicos, que incluyen el sistema inmunológico, el sistema nervioso y el sistema cardiovascular. Hemos denominado a estas interacciones interfaces neuroinmune-cardiovasculares 6,7. Durante la aterogénesis, los componentes de la pared arterial se someten a una reestructuración y remodelación robustas. Por ejemplo, adyacente a la progresión de la placa aterosclerótica en la íntima, se forman agregados de células inmunitarias y se produce una neogénesis del axón neuronal en la adventicia aórtica murina 6,8,9. A medida que la aterosclerosis progresa, los agregados de células inmunitarias se convierten en órganos linfoides terciarios de arterias (ATLO) bien estructurados con áreas distintas de células T, células B y células plasmáticas10. Sin embargo, para delinear estos cambios en 3D, las imágenes de alta resolución del tejido intacto han sido un desafío debido a la insuficiente permeabilización de la membrana y la dispersión de la luz inherente11. Los abordajes de depuración de tejidos han superado las principales limitaciones de los abordajes histológicos convencionales 11,12,13,14,15 con una mayor penetración de los anticuerpos para llegar profundamente a los tejidos u órganos intactos mediante el ajuste uniforme del índice de refracción (IR), lo que conduce a imágenes de resolución a escala micrométrica con mayor profundidad de imagen en vóxeles. Los IR de las muestras se pueden combinar con glicerol (RI 1.46) o aceite de inmersión (RI 1.52), lo que reduce en gran medida la dispersión de la luz y las aberraciones esféricas, lo que permite una alta resolución. Los avances recientes en las técnicas de limpieza de órganos enteros o tejidos de cuerpo entero, como el 2,2-tiodietanol (TDE) de base acuosa y las imágenes 3D de órganos aclarados con disolvente (iDISCO) habilitadas para el inmunomarcaje, respectivamente, junto con las técnicas de imagen volumétrica (incluidas las imágenes de microscopía confocal, multifotónica y de lámina de luz) han permitido reconstruir la microanatomía de la arquitectura vascular mediante la construcción de su atlas de conectividad11,16. La visualización de estas conexiones celulares y estructurales en 3D puede proporcionar nuevos conocimientos para responder a preguntas biológicas hasta ahora sin respuesta.

Protocolo

El presente estudio se realizó de acuerdo con los lineamientos del comité local y nacional de uso y cuidado animal. En el presente estudio se utilizaron ratones machos Apoe-/- hiperlipidémicos con fondo C57BL/6J mantenidos con una dieta estándar de comida para roedores que desarrollan aterosclerosis espontáneamente durante el envejecimiento.

1. Imágenes de montaje completo de aorta aislada y aclaramiento de TDE

  1. Preparación de tejidos
    1. Prepare el anestésico a 150 mg/kg de ketamina y 30 mg/kg de xilacina (ver Tabla de Materiales) por ratón. Anestesiar profundamente a los ratones mediante inyección intraperitoneal y confirmarlo por la falta de reacción a la prueba de dolor profundo.
      NOTA: La concentración y el volumen de la inyección son los siguientes: Ketamina 100 mg/mL; Xilacina 20 mg/mL; Volumen de inyección 50:50 por volumen de mezcla de ketamina y xilacina a 3 μL/g.
    2. Coloque el ratón sobre una placa de espuma cubierta con toallas de papel quirúrgico y fije los brazos y las piernas en posición supina con cintas. Desinfectar el tórax con etanol al 75% (ver Tabla de Materiales) y extraer sangre a través del ventrículo izquierdo con una jeringa desechable de 1 mL para extraer la sangre y mejorar la perfusión.
      NOTA: También se puede utilizar la recolección de sangre cardíaca a través de una toracotomía.
    3. Hacer una incisión en la línea media del tórax para exponer el corazón y una pequeña incisión en la aurícula derecha para permitir la perfusión transcardíaca. Perfundir el ratón a través del ventrículo izquierdo con 10 mL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; ver Tabla de Materiales) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min, seguido de 20 mL de PBS durante 5-10 min hasta que la sangre sea expulsada. Finalmente, perfundir con 10 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 min.
      NOTA: Todos los procedimientos se pueden realizar con una bomba de perfusión peristáltica con una presión de 100-125 mm Hg a temperatura ambiente (RT). La aguja de perfusión se inserta en el corazón del ratón a través del mismo orificio que la extracción de sangre.
    4. Extirpar órganos internos, como el bazo, el hígado, los pulmones y los órganos gastrointestinales y reproductivos, mediante instrumentos quirúrgicos. Mantener el corazón, la aorta y los riñones intactos in situ.
      NOTA: Los instrumentos quirúrgicos utilizados para la disección y extracción de órganos son las tijeras de disección, las tijeras de iris fino, las tijeras de resorte, las pinzas romas, las pinzas curvas y las pinzas finas curvas.
    5. Exponga toda la aorta desde la aorta ascendente hasta la bifurcación ilíaca bajo el microscopio estereoscópico de disección (aumento de 30-40x). Retire con cuidado el timo y el tejido adiposo sin lesionar la aorta.
      NOTA: Tenga cuidado de no cortar la aorta. En el caso de los ratones Apoe-/- , mantenga el tejido adiposo perivascular rodeado mínimo de la aorta para que la estructura esté conectada.
    6. Coseche toda la aorta en una placa de Petri llena de PBS. Separe la aorta en diferentes segmentos y divida toda la aorta longitudinalmente con un iris o unas tijeras de resorte para exponer la superficie íntima siguiendo la secuencia y la dirección indicadas en la Figura 1A para el aclaramiento de TDE.
    7. Sujete la aorta de la cara en la placa plana de cera negra en forma de Y, como se indica en la Figura 1A. Postfícalo en PFA al 4% durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Sujete la aorta a la placa de cera antes de la fijación para evitar que se doble y se enrosque en los siguientes pasos.
    8. Desenganche la aorta y transfiérala al PBS. Lave bien la aorta durante 5 minutos durante 5 veces.
      NOTA: Transfiera la aorta a diferentes tubos llenos de PBS cada vez que se lave.
  2. Tinción de anticuerpos para la aorta facial
    NOTA: Todos los pasos de incubación se realizan en tubos de bloqueo seguro de 2 ml con rotación suave o agitación en RT.
    1. Transfiera la aorta fija a una solución de bloqueo durante 2 h para el bloqueo y la permeabilización.
      NOTA: La solución bloqueante varía en función de los anticuerpos primarios y secundarios. Por ejemplo, solución bloqueante: 0,5 mg/mL CD16/32 (1:100), 10% de suero de burro normal, 2% de Triton X-100 en PBS (ver Tabla de Materiales)
    2. Incubar la aorta con anticuerpos primarios en la solución bloqueante anterior (paso 1.2.1), por ejemplo, CD3e (dilución 1:100), NF200 (dilución 1:200) y B220 (dilución 1:200) durante 24 h (ver Tabla de materiales). Lave la aorta en PBS durante 5 minutos durante 5 veces.
    3. Incubar la aorta con anticuerpos secundarios en suero de burro normal al 10% (dilución 1:300) y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1 mg/mL) para la tinción nuclear durante la noche (ver Tabla de Materiales). Lave la aorta en PBS durante 5 min 5 veces y almacene la aorta en PBS a 4 °C hasta el procedimiento de limpieza de tejidos.
      NOTA: Transfiera la aorta a diferentes tubos llenos de PBS cada vez que se lave. Cubra los tubos con papel de aluminio para mantenerlos en la oscuridad para el paso 1.2.3.
  3. Aclaramiento de tejido TDE
    NOTA: Todos los pasos de incubación se realizan en tubos de bloqueo seguro de 2 ml, que giran suavemente a RT y se cubren con papel de aluminio en la oscuridad. Las soluciones de trabajo TDE (ver Tabla de Materiales) son altamente permeables y deben manipularse con cuidado en una campana extractora. Recoja y deseche los desechos de acuerdo con las regulaciones locales.
    1. Transfiera la aorta teñida a soluciones de trabajo con TDE al 20% e incube durante 1 h.
    2. Transfiera la aorta a soluciones de trabajo al 47% de TDE e incube durante 12 h. Transfiera la aorta a soluciones de trabajo con TDE al 60% e incube durante 24-36 h hasta que las muestras se vuelvan transparentes a la luz visible para que coincidan con la IR.
    3. Almacene la aorta en un 60 % de TDE en RT en la oscuridad hasta la toma de imágenes.
      NOTA: Actualice las soluciones de trabajo cada 30 minutos para el corto plazo de incubación (por ejemplo, paso 1.3.1) y cada 4 h para el largo plazo de incubación (por ejemplo, paso 1.3.2). El tiempo de incubación de cada paso se puede ajustar en función del tamaño del tejido para conseguir una mejor penetración de los anticuerpos o una mayor transparencia. En el caso de la aorta de ratón Apoe-/- rodeada de tejido adiposo, el tiempo de incubación debe prolongarse adecuadamente.
  4. Obtención de imágenes de la aorta que aclara la TDE mediante microscopio de barrido láser confocal (CLSM)
    1. Utilice pocillos espaciadores espaciadores rectangulares adhesivos de doble cara para imágenes de doble cara disponibles en el mercado con un grosor de 0,2 mm (consulte la tabla de materiales). Pegue el pocillo a un portaobjetos de vidrio limpio y transfiera la aorta limpia. Asegúrese de que la adventicia aórtica facial mire hacia el cubreobjetos.
      NOTA: Golpee suavemente la aorta facial plana con el lado abluminal de la aorta facial en la parte superior con pinzas en ángulo. Apile varios pocillos espaciadores de imágenes para que coincidan con el tamaño del tejido si es necesario.
    2. Monte la aorta con gotas de solución de TDE al 60%. Fije con cuidado un cubreobjetos al pocillo, evitando las burbujas de aire entre la muestra y el cubreobjetos.
      NOTA: Retire cuidadosamente las burbujas con una aguja antes del cubreobjetos. No utilice una cantidad excesiva de solución de montaje, ya que la muestra puede flotar.
    3. Utilice un instrumento CLSM invertido (ver Tabla de Materiales) equipado con un (multi) objetivo de inmersión 20x (NA: 0,75).
      NOTA: CLSM permite la obtención de imágenes volumétricas de hasta 70 μm de profundidad con una resolución más alta, necesaria para el análisis del diámetro del nervio y la interacción nervio-célula inmunitaria en la adventicia aórtica.
    4. Seleccione el objetivo de inmersión (aceite) 20x/0,75. Ajuste los detectores de diodos híbridos en función de los tintes teñidos. Ajuste la configuración de la pantalla y seleccione el formato XY de 1024 x 1024 píxeles para la creación de imágenes.
      NOTA: Una lente de objetivo de inmersión en aceite captura las señales mejor que el agua.
    5. Deje caer el aceite de inmersión (con glicerol) uniformemente a lo largo de la aorta en el cubreobjetos. Mueva el objetivo 63x bruscamente hacia la muestra hasta que toque el aceite de inmersión/cubreobjetos.
    6. Mueva finamente el objetivo 63x bajo el microscopio para localizar la región de interés. Adquiera la pila Z del lado adventicio de la aorta facial a un tamaño de paso de 2-4 μm hasta 60 μm de profundidad para obtener imágenes en 3D.
    7. Asigne un nombre al archivo con los detalles de la muestra, los detalles del análisis y guarde los datos.
  5. Obtención de imágenes de la aorta que elimina la TDE con un microscopio multifotónico
    1. Siga los pasos 1.4.1-1.4.2 para montar la aorta frontal en el portaobjetos.
    2. Utilice un microscopio multifotónico vertical (ver Tabla de Materiales) equipado con un objetivo 20x (inmersión en agua, NA: 1,00, distancia de trabajo = 2 mm), que permite obtener imágenes volumétricas de hasta 1,5 mm de profundidad.
    3. Adquiera pilas Z desde el lado abluminal a un tamaño de paso de 10-15 μm hasta una profundidad de 700 μm. Asigne un nombre al archivo y guarde los datos como en el paso 1.4.7.

2. Inmunotinción de cuerpo entero y limpieza de tejidos iDISCO

  1. Preparación de tejidos
    1. Siga los pasos 1.1.1-1.1.3 anteriores para la anestesia, la fijación del ratón y la perfusión.
    2. Extirpar la piel y los órganos internos, incluidos el bazo, el hígado, los pulmones y los órganos gastrointestinales y reproductivos, mediante instrumentos quirúrgicos. Mantener el corazón, la aorta y los riñones intactos in situ.
    3. Diseccionar la parte del cuerpo por encima del nivel del diafragma y fijar la parte inferior del cuerpo con PFA al 4% durante 1-2 días (s) a 4 °C.
      NOTA: Realice la fijación, los lavados y las incubaciones en tubos de 50 mL en un agitador que gire suavemente. Refresque la solución en tubos nuevos 2-3 veces.
    4. Lave bien la muestra durante 10 minutos 3 veces en RT.
      NOTA: Transfiera la aorta a diferentes tubos llenos de PBS cada vez.
    5. Incubar la muestra en cócteles de imágenes cerebrales/corporales transparentes al 20% y sin obstrucciones y en una solución de análisis computacional (CUBIC) durante 48 h para la decoloración.
      NOTA: Para una solución cúbica al 20%, disuelva 25 g de urea en 15 mL de Triton X-100 y 28 mL de Quadrol, y agregue PBS al volumen final de 100 mL. Prepáralo en la campana ya que los ingredientes son estimulantes (ver Tabla de Materiales).
    6. Lave a fondo la muestra durante 1 h cinco veces en PBS en RT.
  2. Tinción de anticuerpos
    NOTA: Todos los pasos de incubación se realizan en tubos de cierre seguro de 50 ml con rotación suave o agitación a 4 °C.
    1. Incubar la muestra en una solución de PBS-gelatina-Triton X-100-serum (PGST) durante la noche para la permeabilización y el bloqueo.
      NOTA: La solución bloqueante varía según los anticuerpos. Por ejemplo, solución de bloqueo: PBS-gelatina-Triton X-100-suero (PGST, consulte la tabla de materiales) solución: 0,2% de gelatina de piel porcina, 0,5% de Triton X-100 y 5% de suero de cabra en PBS.
    2. Incubar la muestra con anticuerpos primarios en solución de PGST, por ejemplo, NF200 (dilución 1:200, ver Tabla de Materiales) a 4 °C, y agitar suavemente durante 10-12 días. A continuación, lavar a fondo la muestra en PGST durante 1 h 5 veces a RT.
    3. Incubar la muestra con solución de anticuerpos secundarios (dilución 1:300) y DAPI (1 mg/mL) en PGST a 4 °C durante 7 días.
    4. Lave a fondo la muestra en PGST durante 1 h 5 veces en RT. Transfiera la muestra a PBS y almacene la aorta en PBS a 4 °C para pasos posteriores.
      NOTA: Cubra los tubos con papel de aluminio para mantenerlos oscuros para los pasos 2.2.3-2.2.4.
  3. Limpieza de tejidos iDISCO modificada
    NOTA: Durante el aclarado, los tubos deben cubrirse con papel de aluminio para evitar el blanqueo/enfriamiento de la señal debido a la exposición directa a la luz natural/artificial. Todos los reactivos orgánicos utilizados en la limpieza de DISCO son dañinos, y todos los pasos de limpieza deben realizarse en una campana extractora. Use una bata de laboratorio, guantes y una mascarilla cuando manipule los reactivos para evitar la inhalación y el contacto con la piel y los ojos. Recoja y vierta los residuos de limpieza en los contenedores de residuos adecuados de la campana.
    1. Transfiera las muestras teñidas del paso 2.2.4 a una serie de concentraciones aumentadas de soluciones de trabajo de tetrahidrofurano (THF, consulte la Tabla de materiales) para la deshidratación, es decir, 50%, 70%, 90% y 100% (dos veces 100%). Incubar durante 12 h por concentración.
      NOTA: Diluir el reactivo THF (99%-100%) en agua destilada para soluciones de trabajo de diferentes concentraciones en la campana. Actualice las soluciones de trabajo cada 6 h.
    2. Transfiera la muestra a una solución de diclorometano absoluto (DCM, ver Tabla de Materiales) durante 3 h para la eliminación de lípidos.
    3. Transfiera la muestra a una solución de trabajo de bencil-alcohol-bencil-benzoato (BABB) que coincida con RI (consulte la Tabla de materiales). Incubar durante 3-6 h hasta que el tejido sea translúcido y mayoritariamente transparente a la luz visible.
      NOTA: Para preparar la solución de trabajo BABB, mezcle 1 parte de alcohol bencílico y 2 partes de benzoato de bencilo (1:2) en una botella de vidrio. Agítalo suavemente durante 5 minutos en el capó.
  4. Obtención de imágenes del tejido de limpieza iDISCO con un microscopio de lámina de luz
    NOTA: Tome una imagen de la muestra aclarada tan pronto como se logre una transparencia óptima. Se utiliza un microscopio de lámina de luz, como un ultramicroscopio II (véase la Tabla de materiales), para la obtención de imágenes. Llene el depósito de imágenes con la solución de limpieza final, la solución BABB. Tenga cuidado de no derramar BABB en el instrumento para evitar daños al instrumento.
    1. Utilice un objetivo de aire 1x para obtener imágenes de bajo aumento que cubran todo el ancho de toda la muestra. Transfiera suavemente la muestra de la solución aclarante sobre un paño de papel y séquela brevemente.
      NOTA: Utilice pinzas romas para evitar apretar la muestra.
    2. Seleccione un portamuestras del tamaño adecuado en función del tamaño de la muestra/tejido y fije la parte posterior de la muestra al portamuestras con superpegamento.
      NOTA: Espere 1-2 minutos hasta que la muestra esté firmemente unida al portamuestras.
    3. Llene el depósito de imágenes del microscopio de lámina de luz con solución BABB y coloque suavemente la muestra en él. Ajuste el soporte de muestras para asegurarse de que la muestra esté perpendicular a la hoja de luz y se ilumine correctamente.
    4. Baje el objetivo para enfocar la muestra y ajuste la configuración de la pantalla mientras enfoca para ver la muestra correctamente. Seleccione la(s) hoja(s) de luz adecuada(s) en el software del microscopio y ajuste su anchura para iluminar uniformemente todo el campo de visión.
      NOTA: En un sistema de ultramicroscopio con iluminación láser en ambos lados, comience alineando y enfocando el láser en un lado. Una vez que ambos lados estén configurados, active ambos láseres laterales para observar una imagen de escaneo combinada de ambas iluminaciones.
    5. Seleccione un canal rojo lejano (680 nm) para obtener imágenes de estructuras neuronales teñidas con NF200 y un canal de autofluorescencia (488 nm) para obtener imágenes de la aorta y los tejidos conectivos sin teñir. Ajuste la potencia del láser en función de la intensidad de la señal fluorescente para obtener una relación señal-ruido óptima, el tiempo de exposición y la anchura de las láminas de luz.
    6. Seleccione el modo de escaneo x-y-z. Configure el escaneo de la pila z con un paso z de 2-8 μm y seleccione una superposición del 25%-60% a lo largo del eje y longitudinal de los escaneos de mosaico (16 bits) que cubren las superficies ventral y dorsal de las muestras para obtener imágenes de todo el volumen de la muestra (hasta 6-8 mm de profundidad).
    7. Asigne un nombre a la exploración con información detallada, incluida la fecha de la exploración, el nombre de la muestra, el anticuerpo utilizado, el objetivo, el factor de zoom, los pasos z y los láseres utilizados. Guarde los datos.
    8. Cambie a un aumento más alto (2x o 4x) a través de la función de zoom para obtener imágenes de regiones específicas del cuerpo de interés.
    9. Siga los pasos 2.4.4-2.4.7 anteriores para obtener imágenes y guarde los datos.

3. Procesamiento y análisis de imágenes

NOTA: Se necesita una estación de trabajo de procesamiento de alta potencia para el procesamiento. Garantice la copia de seguridad de los datos inmediatamente después del procesamiento debido al alto volumen de imágenes (5-100 GB por imagen).

  1. Procesamiento de imágenes CLSM y multifotón
    1. Cargue las imágenes en mosaico de la pila Z de los microscopios CLSM y multifotónicos en la estación de trabajo de procesamiento de imágenes equipada con el software Las X, Imaris (software de análisis de imágenes) o Fiji para la visualización, segmentación y cuantificación en 3D y bidimensional (2D).
    2. Para codificar por colores la profundidad del volumen de una celda o estructura, utilice un software de restauración de imágenes (consulte la Tabla de materiales) para deconvolucicar la imagen en bruto y generar una proyección de máxima intensidad de los datos deconvolutados utilizando la codificación de colores temporal en Las X o Fiji.
  2. Procesamiento de imágenes de láminas de luz
    1. Cargue la serie de imágenes TIFF en mosaico de la pila Z en el software de Fiji. Une imágenes con el plugin de costura de Fiji y guarda las imágenes cosidas en formato TIFF.
      NOTA: Si es necesario, comprima las imágenes unidas en formato LZW para permitir un procesamiento rápido con diferentes software.
    2. Cargue las imágenes unidas en el software de visualización 3D (consulte la tabla de materiales) para la segmentación de imágenes. Traza manualmente las estructuras neuronales y vasculares en el eje x-y-z. Para el trazado manual de pequeñas fibras nerviosas, seleccione manualmente las señales NF200+ píxel por píxel en cada plano z a lo largo de todo el trayecto de la fibra nerviosa entre la aorta y los ganglios.
    3. Cargue imágenes preprocesadas en el software de análisis de imágenes (consulte la tabla de materiales) para la generación de vídeo, la visualización en 2D y 3D de las imágenes.
    4. Utilice la autofluorescencia para segmentar la aorta y los tejidos conectivos, incluidos los ganglios linfáticos y los músculos, en el software de análisis de imágenes. Aplique pseudocolores separados en el software de análisis de imágenes para visualizar distintos segmentos aórticos, como la pared aórtica y la placa.
    5. Utilice la función de ecualización de histograma adaptativo limitado por contraste (CLAHE) del software Fiji para mejorar el contraste local sobre el fondo de las imágenes procesadas.

Resultados

Para demostrar la microanatomía de la aorta intacta, sana y enferma, y para revelar las conectividades físicas entre el sistema inmunitario, el sistema nervioso y el sistema cardiovascular en modelos murinos de aterosclerosis, utilizamos dos enfoques complementarios de limpieza de tejidos: la limpieza de TDE de la aorta aislada y la limpieza iDISCO de todo el ratón (Figura 1). Después de la inmunotinción de montaje completo, la aorta superficial se eliminó con una serie de soluciones de trabajo de TDE. El IR se ajusta a 1,4-1,5, dependiendo de la concentración de TDE del paso final, para lograr una transparencia óptima del tejido aórtico sin cambiar su volumen (Figura 1A). A diferencia del aclaramiento de TDE, el protocolo de aclarado iDISCO incluye pasos de decoloración y permeabilización antes de la inmunotinción de montaje completo, seguidos de desidipación y deshidratación con diferentes disolventes químicos, y la coincidencia de IR en 1,56 (Figura 1B). El claro iDISCO permite la visualización de tejido de gran tamaño e incluso de todo el cuerpo del ratón debido a la contracción del tejido.

Las imágenes 3D confocales y multifotónicas de la aorta facial de montaje completo con autorización de TDE permiten la visualización de estructuras, incluidas las placas intimal, la celularidad de la adventicia y las proyecciones neuronales de la adventicia, entre otras estructuras, mientras que las imágenes de lámina de luz del ratón despejado con iDISCO permiten la visualización y la reconstrucción del árbol arterial junto con el tejido adiposo perivascular, los ganglios linfáticos renales y los componentes neurales asociados, incluidos los nervios y los ganglios (Figura 1C). Por ejemplo, las imágenes confocales de la aorta aterosclerótica aclarada con TDE detectaron múltiples células T teñidas con CD3e en placa y una neogénesis extensa de fibras nerviosas teñidas con NF200 de diferentes diámetros en ATLO, mientras que las imágenes multifotónicas de la aorta abdominal enferma de montaje completo aclarada por TDE de ratones Apoe-/- envejecidos mostraron la territorialidad de la germinación de axones que expresan NF200 en áreas de células T B220 negativas dentro de ATLO (Figura 2A). Por el contrario, las imágenes de lámina de luz de todo el abdomen del ratón despejado con iDISCO visualizaron la relación espacial entre la aorta y los ganglios simpáticos adyacentes. La segmentación de imágenes en 3D y el trazado de axones individuales desde los ganglios hasta la superficie aórtica revelaron una reestructuración neuronal robusta, incluidos axones teñidos con NF200 recién formados en la aorta adyacente a la placa aterosclerótica (Figura 2B).

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Figura 1: Flujo de trabajo del estudio. (A) Aclaramiento acuoso de la aorta enfrentada . (B) Limpieza iDISCO a base de solvente de todo el mouse. (C). 3D imágenes volumétricas y procesamiento de imágenes de muestras aisladas de aorta o de ratón enteras aclaradas ópticamente. Esta figura ha sido modificada con permiso de Sun et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ejemplo de imágenes 3D de tejidos aclarados con TDE e iDISCO. (A) Imágenes 3D de TDE aclarado en la aorta facial. Panel superior: Las imágenes confocales mostraron linfocitos T CD3e+ (rojo, flecha) en la placa íntima y axones nerviosos NF200+ (verde) en la adventicia de la aorta aterosclerótica (ATLO); Panel inferior: Las imágenes multifotónicas mostraron axones nerviosos NF200+ (verde, puntas de flecha), células B B220+ (rojo, triángulo abierto), generación de segundos armónicos derivados del colágeno (SHG, blanco) en ATLO de ratones machos Apoe-/- de 78 semanas de edad. Sytox (azul) y DAPI (azul) mostraron los núcleos. (B) Imágenes reconstruidas y segmentadas en 3D de iDISCO despejado todo el abdomen del ratón. Reconstrucción, segmentación y trazado en 3D de los nervios y axones NF200+ (flechas, verde) y su relación espacial con los ganglios simpáticos (puntas de flecha) de la aorta abdominal intacta. El triángulo abierto indicaba un axón recién formado adyacente a las placas ateroscleróticas. Se utilizó la autofluorescencia (auto) para obtener imágenes de la aorta y el tejido conectivo, incluida la placa (cian) y el ganglio linfático renal (RLN, azul). CG, ganglios celíacos, SycG, ganglios de la cadena simpática. Esta figura ha sido modificada con permiso de Mohanta et al.6 y Sun et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La aterosclerosis puede considerarse como una enfermedad inflamatoria transmural de las arterias que afecta a las tres capas de la pared arterial. Además, las arterias están rodeadas por los tejidos perivasculares, adiposos y neuronales. Durante la progresión de la aterosclerosis, cada uno de estos tejidos sufre considerables alteraciones celulares y estructurales, lo que requiere métodos para adquirir acceso óptico subcelular a los tejidos intactos que rodean las arterias sanas y enfermas. Estos métodos se proporcionan aquí para comprender mejor las interacciones célula-célula y célula-tejido y para avanzar en la comprensión de la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares. La limpieza de tejido y la posterior obtención de imágenes microscópicas en 3D permiten obtener imágenes de compartimentos de tejido intactos a gran escala, hasta ahora inaccesibles, revelando reconstrucciones detalladas de las arterias. Aquí, presentamos protocolos para las técnicas de limpieza de tejidos TDE e iDISCO, destacando su efectividad y simplicidad para lograr una transparencia tisular casi completa, imágenes eficientes con microscopía confocal/multifotónica o de lámina de luz y, al mismo tiempo, mantener la integridad estructural.

El aclarado de TDE utiliza un reactivo soluble en agua para lograr la transparencia del tejido mediante el ajuste de la IR, preservando así eficazmente las señales de fluorescencia en el tejido. Representa un método eficiente de limpieza de tejidos para vasos sanguíneos de menor tamaño, es decir, un volumen de tejido de tamaño micrométrico a milímetro sin contracción del tejido. Sin embargo, requiere un tiempo de procesamiento más largo para tejidos más grandes, es decir, volúmenes de tejido de tamaño milimétrico a centímetro. Es importante destacar que el procedimiento se puede adaptar a las necesidades del usuario ajustando la concentración de los reactivos y el tiempo de incubación. Por otro lado, iDISCO utiliza una serie de disolventes orgánicos para eliminar los lípidos y el agua, lo que permite una mejor transparencia de los tejidos más grandes, órganos enteros o todo el ratón o tejidos humanos más grandes. Ofrece las ventajas únicas de tiempos de procesamiento cortos e idoneidad para grandes volúmenes de tejido. Sin embargo, conduce a la contracción de las muestras aclaradas, la extinción de las señales de fluorescencia y la eliminación de lípidos, que es una limitación importante para los tejidos ateroscleróticos ricos en lípidos. Además, la microscopía de lámina de luz, a diferencia de la microscopía confocal o multifotónica, no puede visualizar detalles subcelulares a nivel micrométrico y visualizar proyecciones neuronales de diámetro pequeño, como axones individuales y sus conexiones con otras células vasculares.

La inervación vascular juega un papel importante en el desarrollo de la aterosclerosis 6,7,18. Investigar la distribución de los nervios periféricos a lo largo del árbol arterial y sus cambios ayudará a comprender la progresión de la enfermedad. Debido a su eficiente capacidad de procesamiento, iDISCO se utiliza habitualmente para la obtención de imágenes de toda la red vascular en modelos de aterosclerosis en ratas y ratones 12,19,20,21, proporcionando imágenes tridimensionales de alta resolución. El TDE, por otro lado, es adecuado para estudios que requieren la preservación de etiquetas fluorescentes, como la observación de marcadores neuronales específicos, revelando así con precisión la estructura fina y los cambios en la inervación vascular6. Ambos protocolos de limpieza de tejidos son necesarios, ya que la limpieza de TDE no implica encogimiento y puede obtener imágenes de lípidos, mientras que iDISCO conduce a la contracción de los tejidos debido a la deshidratación y la delipidación. Además, el protocolo iDISCO modificado se puede utilizar para la limpieza de tejidos cardiovasculares humanos22,23. Ambas técnicas de aclaramiento ofrecen ventajas complementarias al estudio de la remodelación arterial en la aterosclerosis. Al combinar las fortalezas de ambos métodos, se puede lograr una comprensión más completa y profunda de los mecanismos patológicos de la aterosclerosis.

Divulgaciones

SKM, CJY y AJRH son cofundadores de Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) SFB1123/Z1, el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK) DZHK 81X2600282, y una subvención de la fundación Corona (S199/10087/2022) a SKM; y ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 y una subvención del gobierno a AJRH en Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2,2'-tiodietanol (TDE)Sigma 166782Reactivo de limpieza
AmiraThermo Fisher ScientificSoftware de visualización 3D; Software de procesamiento de imágenes utilizado para la segmentación manual y el trazado en imágenes 3D
Alcohol bencílicoSigma W213713Reactivo de aclaración
Benzoato de benciloSigmaB6630Reactivo de aclarante
CD16/32eBioscience14-0161-82Solución de bloqueo
Microscopio de barrido láser confocal Leica MicrosystemsTCS-SP8 3XDispositivo de imagen para la obtención de imágenes multidimensionales de alta resolución de tejidos biológicos intactos o secciones con alta especificidad a resolución subcelular.
DAPIInvitrogenD3571Marcador de núcleos
Diclorometano (DCM)Sigma 270997Reactivo de limpieza
Cera negra de disección Thermo Scientific S17432Disección y fijación de la aorta 
Microscopio estereoscópico de disecciónLeica Microsystems Stemi 2000Etanol de disección de órganos de ratón
 SigmaE7023Deserción 
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Roth 8040.1Tampón de perfusión 
Fiyi  (ImageJ, NIH)Software de procesamiento de imágenes de código abierto para imágenes 2D y 3D
Cabra anti-Hámster IgG, Cy3Dianova 127-165-099Anticuerpo secundario
IgG anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109Anticuerpo secundario 
Cabra anti-Rata IgG, Cy5Dianova712-175-150Anticuerpo secundario
Hámster Anti-CD3e BD Biociencia145-2C11 Marcador de células Pan-T
HuygensProfessional Scientific Volume Imaging, Países BajosVersión 19.10Software de restauración de imágenes; Software de procesamiento de imágenes utilizado principalmente para la deconvolución de imágenes 2D y 3D Estación de trabajo de
procesamientode imágenes MIFCOM MIFCOM X5Estación de trabajo de procesamiento de imágenes equipada con todo el software de procesamiento de imágenes, incluido el conjunto de aplicaciones Leica X, Fiji e Imaris para el procesamiento posterior de imágenes adquiridas por microscopios confocales, multifotónicos y de lámina de luz
ImarisBitplaneversión 8.4Software de análisis de imágenes; Software de procesamiento de imágenes utilizado para la segmentación automatizada de imágenes 3D
Incubadora y rotador Marshall Scientific Innova 4230Dispositivo de incubación y rotación durante el desbroce < tejidos>
iSpacerSunjin LabIS4020Rectangular así como el portamuestras
KetamineLivistoAnesthetic
Leica Application Suite X (LAS-X) Leica Microsystemsversión 3.5Software de procesamiento de imágenes para las imágenes adquiridas con el microscopio Leica Microscopio
Leica MicrosystemsDM LBDispositivo de imagen para imágenes de archivos brillantes
Microscopio de hoja de luzLaVision BioTechUltramicroscope IITécnica de imagen para la obtención rápida de imágenes de alta resolución de grandes muestras biológicas o ratones enteros con baja exposición a la luz mediante la adquisición rápida de imágenes de secciones ópticas delgadas.
Microscopía multifotónicaLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP Modalidad de imagen para la obtención de imágenes multidimensionales de alta resolución de tejidos biológicos intactos y viables a nivel subcelular y molecular durante períodos prolongados de tiempo, en profundidad en la muestra y con una invasión mínima.
Suero de cabra normal SigmaG9023Solución
de bloqueo Paraformaldehído (PFA) Sigma P-6148 y nbsp;Fijación 
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma P4417-100TAB Tampón de lavado
Gelatina de piel de cerdoSigma G1890Tampón de incubación
QuadrolSigma122262CUBIC reactivo de limpieza
Rabbit Anti-NF200SigmaN4142Marcador panneuronal
Rat Anti-B220 BD BioscienceRA3-6B2Marcador de células Pan-B
SacarosaSigma 90M003524V Deshidratación 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380Marcador de núcleos
TetrahidrofuranoSigma 401757Reactivo de limpieza 
Tritón X-100Roth 3051.1
Penetración Urea Sigma U5128Reactivo de limpieza CUBIC
Xileno Fisher Chemical X/0250/17 Anestésico 
óptico

Referencias

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  2. Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
  3. Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity. Front Immunol. 7, 387(2016).
  4. Mohanta, S. K., et al. Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis. Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).
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  6. Mohanta, S. K., et al. Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis. Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).
  7. Mohanta, S. K., et al. Cardiovascular brain circuits. Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).
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  10. Grabner, R., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice. J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).
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  12. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for disco tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
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  21. Todorov, M. I., et al. Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature. Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).
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  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

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