Este protocolo describe un método único para construir un modelo ortotópico del cáncer de vejiga superficial.
Artículo de método
Establecimiento de un modelo de cáncer de vejiga superficial murino mediante una técnica de administración de células intravesicales
En este artículo
Resumen
Resumen
Este estudio presenta un método innovador para establecer un modelo ortotópico de tumor de vejiga murina con alta eficiencia y localización precisa del tumor. Después de anestesiar a ratones hembra C57BL/6J en posición supina, se inserta una aguja intravenosa de 24 G en la vejiga para evacuar su contenido. A continuación, se introduce una aguja dispensadora de 34 G a través del catéter, se gira cinco veces para crear una lesión focal en la mucosa de la cúpula vesical y, posteriormente, se retira. La suspensión celular MB49 se aspira y se conecta a una aguja dispensadora de 30 G, que se inserta en la vejiga a través del catéter. Las células tumorales se inyectan por vía submucosa en la vejiga bajo presión. Esta técnica da como resultado un trauma mínimo en los ratones, una alta tasa de toma de tumores y una ubicación fija del tumor. Se caracteriza por su simplicidad y excelente reproducibilidad. Este modelo proporciona una plataforma experimental ideal para el desarrollo de terapias intravesicales para el cáncer de vejiga, facilitando el avance y la optimización de las estrategias de tratamiento para esta neoplasia maligna.
Introducción
El cáncer de vejiga representa una importante carga para la salud mundial, con notables disparidades específicas de sexo en la incidencia y el pronóstico. Esta neoplasia maligna se caracteriza por distintos subtipos moleculares, cada uno asociado con diversas vías patogénicas. Las características moleculares y patológicas difieren significativamente entre el cáncer de vejiga no músculo invasivo (NMIBC) y el cáncer de vejiga músculo-invasivo (MIBC)1,2. El NMIBC representa alrededor del 75 % de los casos, con tumores de origen epitelial transicional que permanecen localizados sin metástasis ni diseminación. Por el contrario, el MIBC se caracteriza por la infiltración de células cancerosas en la capa muscular de la vejiga, acompañada de un alto riesgo de diseminación, lo que frecuentemente requiere cistectomía en la práctica clínica3.
En la investigación preclínica, los modelos que representan con precisión la etapa superficial de la enfermedad son esenciales para evaluar las terapias farmacológicas. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo de carcinoma vesical superficial in situ es de suma importancia, ya que sirve como una herramienta de investigación crítica para el desarrollo de fármacos clínicos y terapias de instilación innovadoras.
El desarrollo de modelos de cáncer de vejiga ortotópico murino se ha enfrentado tradicionalmente a desafíos. Los modelos inducidos químicamente a menudo comienzan como tumores superficiales, pero pueden evolucionar a formas invasivas, con una variabilidad que limita su utilidad en experimentos a gran escala4. Los modelos tradicionales de implantación ortotópica, que se basan en la inyección de células tumorales a través de la pared vesical5, tienen dificultades para reproducir fielmente el cáncer de vejiga superficial. Se han intentado métodos alternativos, como la lesión de la mucosa combinada con la instilación de células tumorales 6,7,8,9,10, pero se ven limitados por las altas tasas de mortalidad y las bajas tasas de extracción tumoral, lo que dificulta su aplicación más amplia.
Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo método para construir un modelo de cáncer de vejiga superficial que demuestre una mayor estabilidad, menor mortalidad y posicionamiento fijo del tumor en comparación con los modelos existentes. Al lograr una representación más precisa de la enfermedad en sus primeras etapas, el modelo actual está preparado para mejorar la evaluación rigurosa de las intervenciones preventivas y terapéuticas, avanzando así en el tratamiento del cáncer de vejiga.
Protocolo
Todos los protocolos y procedimientos de experimentación con animales fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética para la Experimentación Animal de la Universidad Médica de Tianjin, Tianjin, China (número de aprobación SYXK: 2020-0010). Para este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de seis a ocho semanas de edad. Los animales se alojaron en condiciones ambientales controladas, incluido un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperaturas que oscilaban entre 21 y 25 °C, niveles de humedad ajustables entre el 30% y el 70% y acceso sin restricciones a alimentos y agua, a menos que se especificara lo contrario. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de la célula
- Cultive la línea celular de cáncer de vejiga murina MB49 en el medio Eagle Modificado (DMEM) completo de Dulbecco, suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) para apoyar un crecimiento óptimo.
- Mantener los cultivos celulares en condiciones estándar a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Actualice los medios cada 2-3 días para garantizar la salud y la viabilidad de las células.
- Recolecta las células utilizando un procedimiento estandarizado de digestión de tripsina. Pipetear suavemente para desalojar las células del matraz de cultivo después de aplicar tripsina e incubar durante un breve período.
- Cuente las células recolectadas con un hemocitómetro para determinar la densidad celular exacta. Prepare una suspensión unicelular resuspendiendo las células a 2 x 103/μL en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantenga esta suspensión en hielo para mantener la viabilidad de la célula.
2. Preparación animal
- El grupo aloja a los ratones (5 ratones por jaula) en jaulas de policarbonato ventiladas individualmente.
- Permita que los ratones se aclimaten durante 7 días antes del inicio del estudio.
3. Generación de modelos de tumores ortotópicos animales
- Administrar la anestesia a los ratones mediante inyección intraperitoneal utilizando una solución de Avertin al 2,5% (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
- Espere hasta que los ratones alcancen un nivel adecuado de anestesia para la cirugía, como lo indica una disminución de la frecuencia respiratoria con un aumento en la profundidad, la ausencia de reflejos palpebrales y corneales, disminución del tono muscular y las respuestas reflejas, y ninguna reacción a un pellizco de cola.
- Coloque el ratón anestesiado en posición supina para facilitar el procedimiento.
- Utilice un catéter intravenoso de 24 G con el estilete de la aguja retirado para el procedimiento de cateterismo uretral. Aplique abundante lubricación al catéter para minimizar las molestias y facilitar una inserción suave.
- Identificar la uretra, situada inmediatamente posterior a los pliegues vulvares y anterior a la vagina, manteniendo al ratón en posición supina.
- Comience el cateterismo acercándose a la uretra en un ángulo de 45 grados para navegar por debajo del hueso púbico. Ajústelo a un ángulo más poco profundo para guiar el catéter a través de la uretra y hacia la vejiga.
- Evite aplicar una fuerza excesiva contra la resistencia, ya que esto puede provocar la perforación de la uretra o la vejiga. Confirme la ubicación del catéter dentro de la luz de la vejiga verificando si hay orina dentro del catéter.
- Aplique suavemente presión en la parte inferior del abdomen del ratón para facilitar el drenaje de la orina de la vejiga. Asegúrese de que la vejiga esté completamente vacía para prepararse para los pasos posteriores del procedimiento.
- Empuje suavemente el catéter intravenoso de 24 g hacia la parte superior de la vejiga. Asegúrese de que la punta del catéter haga contacto con el ápice de la vejiga.
- Una vez confirmado el contacto, suelte el catéter, permitiendo que se retraiga ligeramente. Mantenga el catéter en una posición fija en relación con el ratón para garantizar la estabilidad y evitar el desplazamiento.
- Inserte la aguja dispensadora modificada de 34 G a lo largo del catéter de 24 G. Haga avanzar la aguja hasta que llegue a la parte superior de la vejiga.
- Una vez colocada, gire la aguja seis veces para crear una lesión mucosa localizada en el ápice de la vejiga. Después de completar la rotación, retire con cuidado la aguja a lo largo del catéter.
- Conecte la aguja dispensadora de 30 g a la parte superior de una jeringa de 1 ml. Asegúrese de que haya una conexión segura entre la aguja y la jeringa.
- Una vez conectada, introduzca la suspensión de celdas MB49 de 2 x 10 ³/μL preparada previamente en la jeringa tirando suavemente del émbolo hacia atrás. Verifique que la suspensión de celdas se aspire en la jeringa sin burbujas de aire.
- Inserte la aguja dosificadora de 30 G a lo largo del catéter de 24 G. Asegúrese de que la aguja esté correctamente alineada y asegurada dentro del catéter.
- Una vez colocado, aplique presión al émbolo de la jeringa de 1 mL para inyectar el contenido (preparado en el paso 1). Mantenga una presión constante sobre el émbolo durante 60 s para garantizar que el contenido se entregue sin una reducción significativa del volumen.
- Después de 60 s, retire con cuidado la jeringa y la aguja dispensadora de 30 g del catéter.
4. Seguimiento postoperatorio
- Coloque el ratón anestesiado en posición supina sobre una almohadilla térmica hasta que regrese el reflejo de enderezamiento.
- Asegúrese de que el animal no quede desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente.
- No devuelva el animal a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.
Resultados
La eficacia de las inyecciones submucosas se evaluó inicialmente mediante la administración de Trypan Blue. Después de la inyección, se visualizó claramente la distribución del colorante dentro de la capa submucosa, lo que confirmó la administración precisa y controlada de las sustancias inyectadas (Figura 1).
El desarrollo tumoral se rastreó meticulosamente. Aproximadamente 14 días después de la implantación, se observó una incidencia notable de hematuria, un síntoma crítico indicativo de neoplasia vesical. Los tumores se identificaron como firmemente establecidos dentro de la capa submucosa de la vejiga. El patrón de crecimiento temprano de estos tumores se caracterizó por una expansión expansiva y no invasiva, lo que concuerda con la clasificación de NMIBC. El examen histológico confirmó la ausencia de invasión muscular, con tumores confinados a la capa submucosa, alineándose así con los criterios de NMIBC (Figura 2).
Las observaciones macroscópicas corroboraron aún más el proceso de formación del tumor. Los tumores eran visualmente distintos, exhibiendo un crecimiento papilar con una variedad de tamaños y formas (Figura 3). Además, los tumores crecieron con relativa lentitud, lo que proporcionó tiempo suficiente para la investigación en el experimento (Figura 4).
En este estudio, para verificar la localización tumoral y la ausencia de siembra uretral, se utilizaron células MB49-luc para la implantación, seguidas de imágenes de pequeños animales. En la figura 5 se muestran las imágenes de bioluminiscencia in vivo tomadas 35 días después de la inyección de células tumorales, lo que demuestra claramente que el tumor se localiza en la vejiga sin evidencia de diseminación ectópica, como en la uretra.
Por lo general, el tejido tumoral se vuelve detectable 14 días después de la implantación. En nuestra experiencia, el 70% o más de los ratones exhiben hematuria a los 14 días. Por lo general, el procedimiento no produce mortalidad. Sin intervención, la eutanasia se hace necesaria a los 60 días. Los criterios de eutanasia incluyen letargo, caquexia, pelaje erizado, encorvamiento, comportamiento de falta de respuesta o una pérdida del ≥20% del peso corporal inicial.
Figura 1: Eficacia de la inyección submucosa con azul de tripano. Demostración de la eficacia de la inyección submucosa con Azul de Tripán. Las flechas indican los sitios de inyección donde el azul de tripano residual permanece visible incluso después de tres lavados con PBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Confirmación histológica de la implantación tumoral. Confirmación histológica de la implantación tumoral en la submucosa mediante tinción de H&E. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Visualización directa de tumores vesicales. Visualización directa de tumores vesicales, destacando la proliferación vascular evidente en la base tumoral. Barra de escala: 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estado tumoral a los 35 días post-implantación. Valoración del estado tumoral a los 35 días post-implantación. La pared de la vejiga en la base del tumor exhibe vasos sanguíneos agrandados y desorganizados, acompañados de una base tumoral ampliamente extensa. Barra de escala: 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes de bioluminiscencia in vivo de cáncer de vejiga e imágenes de bioluminiscencia in vivo de ratones 35 días después de la implantación con células de cáncer de vejiga MB49-LUC. Las imágenes están codificadas por colores para representar la intensidad de la fluorescencia: el rojo indica alta fluorescencia (alta actividad tumoral) y el azul indica baja fluorescencia (baja actividad tumoral). Se seleccionaron regiones de interés (ROI) en el área de la vejiga para cuantificar la señal de bioluminiscencia específica del tumor. Los resultados demuestran que los tumores se localizan en la vejiga sin evidencia de diseminación ectópica, como en la uretra. Las regiones de baja señal pueden deberse a señales dispersas de áreas de alta intensidad que penetran a través del tejido y no necesariamente indican la presencia de células tumorales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Diagrama de la administración intravesical de células cancerosas. Representación esquemática de la administración intravesical de células cancerosas para construir el modelo ortotópico del cáncer de vejiga superficial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Configuración de las agujas dispensadoras modificadas. Configuración de agujas dispensadoras modificadas dentro del catéter de 24 G. (A) Fotografía de la aguja dispensadora de 34 G dentro del catéter de 24 G. (B) Fotografía de la aguja dispensadora de 30 G dentro del catéter de 24 G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
La investigación sobre el cáncer de vejiga se basa en modelos animales, que son indispensables tanto para la investigación básica como para la aplicada. Para imitar mejor el entorno de crecimiento tumoral, los modelos de tumores ortotópicos de vejiga proporcionan un enfoque superior en comparación con los modelos de tumores subcutáneos11.
En la actualidad, los modelos ortotópicos de cáncer de vejiga se pueden clasificar con fines experimentales en dos tipos principales: los que utilizan ratones inmunodeficientes, como los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX)1 y los modelos de xenoinjerto derivado de líneas celulares (CDX)5, y los que utilizan ratones inmunocompetentes, como los modelos de injerto singénico12.
El modelo PDX consiste en implantar tejidos tumorales derivados del paciente en ratones inmunodeficientes, lo que permite una evaluación personalizada de la respuesta del tumor a los fármacos quimioterapéuticos. Sin embargo, la falta de un sistema inmune intacto en estos ratones presenta limitaciones significativas para el estudio de los mecanismos relacionados con el sistema inmunológico. Del mismo modo, el modelo CDX, que utiliza líneas celulares tumorales derivadas de humanos, ofrece altas tasas de formación de tumores, pero también sufre de la ausencia de un microambiente inmune5.
En el contexto de ratones inmunocompetentes, el método primario para construir tumores ortotópicos de vejiga implica inyectar líneas celulares MB49 derivadas de murinas en la pared de la vejiga para formar tumores de vejiga in situ 12. Este procedimiento requiere laparotomía e inyección intravesical de células tumorales, lo que plantea desafíos como la posible fuga de células tumorales y la siembra del tracto de la aguja. En consecuencia, es difícil crear tumores vesicales superficiales, lo que dificulta la replicación precisa de la progresión del cáncer de vejiga humano desde las etapas no invasivas musculares a las invasivas musculares13.
Para establecer tumores vesicales ortotópicos superficiales, las técnicas tradicionales de modelado suelen implicar la inducción de la lesión de la mucosa mediante agentes como soluciones ácido-base o electrocauterización, seguida de la instilación intravesical de suspensiones de células tumorales, con tiempos de retención de 2 h o más 8,14. Sin embargo, estas metodologías presentan varias limitaciones significativas. En primer lugar, no garantizan la uniformidad en el número y la ubicación de los implantes tumorales dentro de la vejiga, lo que compromete la reproducibilidad del modelo. Además, estas técnicas a menudo provocan daños graves en la vejiga, lo que conduce a altas tasas de mortalidad. La cicatrización de la vejiga resultante y la reducción de la capacidad plantean obstáculos sustanciales para los estudios sobre nuevos agentes terapéuticos que requieren instilaciones intravesicales repetidas. Esto no solo socava la fiabilidad de los resultados experimentales, sino que también plantea preocupaciones éticas con respecto al bienestar animal.
Por lo tanto, el desarrollo de un modelo animal que pueda simular con precisión el cáncer de vejiga humano superficial proporcionaría una mejor plataforma experimental para comprender la proliferación y progresión tumoral. Este modelo sería muy valioso para investigar nuevos agentes terapéuticos intravesicales y avanzar en nuestro conocimiento de la biología del cáncer de vejiga.
En este estudio se describe un método de implantación in situ que emplea una aguja dispensadora de punta roma para inyectar células tumorales por vía submucosa bajo presión (Figura 6). El estudio utiliza la línea celular MB49 y ratones hembra C57BL/6J para construir un modelo tumoral in situ .
Durante la construcción de este modelo, la capa protectora en la superficie mucosa normal de la vejiga presenta un desafío significativo para la instilación directa de células tumorales, a menudo impidiendo la formación efectiva de tumores8. En consecuencia, es necesario inducir una lesión localizada en la cúpula de la vejiga utilizando una aguja roma de 34 G para crear un "suelo" adecuado para la implantación de células tumorales.
Las agujas dispensadoras de 34 G y 30 G utilizadas en este estudio han sufrido modificaciones parciales. La punta de la aguja de 34 G se ha sujetado para crear un extremo ligeramente irregular, lo que mejora su capacidad para causar daños en la mucosa. Los puntos de conexión de las agujas de 34 G y 30 G se han recortado para garantizar que las partes expuestas del catéter de 24 G sean de 0,3 mm a 0,5 mm (Figura 7A) y de 1 mm a 1,5 mm (Figura 7B), respectivamente.
Todo este procedimiento se puede completar en 10 minutos, eliminando la necesidad de laparotomía o ligadura uretral prolongada para la instilación intravesical. Sin embargo, este enfoque también tiene limitaciones. Debido a los múltiples pasos técnicos involucrados en este método de modelado, como la inserción del catéter permanente a través de la uretra en la vejiga y la rotación de la aguja roma de 34 G para lograr el grado adecuado de lesión de la mucosa sin perforar la pared de la vejiga, los experimentadores deben practicar para mejorar la tasa de éxito de la implantación del tumor. Además, si se utiliza una fuerza excesiva durante una lesión de la mucosa o una inyección de células tumorales, puede provocar la perforación de la vejiga o la implantación de un tumor en la capa muscular.
En conclusión, esta técnica ofrece ventajas significativas sobre los métodos tradicionales, incluyendo la reducción del tiempo de procedimiento, la menor mortalidad y la mejora de la consistencia en la localización y el crecimiento del tumor, sin necesidad de procedimientos invasivos ni retención intravesical prolongada. Estos beneficios lo convierten en una herramienta valiosa para los estudios preclínicos destinados a evaluar nuevos agentes terapéuticos para el cáncer de vejiga.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el Fondo del Proyecto Clave de la Industria de la Salud Municipal de Tianjin (subvención no. TJWJ2022XK014), el fondo del Proyecto de Investigación Científica de la Comisión Municipal de Educación de Tianjin (subvención n.º 2022ZD069), el Programa de Financiación de Talentos del Instituto de Urología de Tianjin (subvención n.º. MYSRC202310), el fondo del Proyecto de Investigación en Medicina Clínica del Segundo Hospital de la Universidad Médica de Tianjin (subvención n.º 2023LC03), el Fondo Juvenil del Segundo Hospital de la Universidad Médica de Tianjin (subvención n.º 2022ydey15) y el Proyecto de Cultivo de Talento del Departamento de Urología, el Segundo Hospital de la Universidad Médica de Tianjin (subvención n.º. MNRC202313). Los patrocinadores desempeñaron un papel importante en la preparación, revisión y aprobación del manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| aguja dosificadora de 34 G | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China | SGL-362 | |
| Aguja dosificadora de 30 G | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China | SGL-362 | |
| Avertin | Sigma-Aldrich LLC | T48402 | |
| Azul de tripán | Sigma-Aldrich LLC 302643 |
Referencias
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