El estudio demuestra un ensayo cuantitativo basado en PCR para la activación de la vía de señalización de Sonic Hedgehog (SHH) mediada por cilios primarios utilizando el agonista SHH en un modelo celular de ciliogénesis.
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Artículo de método
Ensayo cuantitativo basado en PCR para medir la señalización sónica de erizo en un modelo celular de ciliogénesis
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Resumen
Resumen
La ciliopatía se refiere a una colección de enfermedades y trastornos humanos multisistémicos y poligénicos que surgen debido a la aberración de la estructura o función de los cilios móviles o no móviles (primarios) que son protuberancias celulares basadas en microtúbulos. Los cilios primarios (PC) están presentes en la mayoría de los tejidos epiteliales y endoteliales humanos y sirven como centro para la transducción de señales fisiológicas, incluida la señalización del erizo sónico (SHH). Diversas situaciones exigen examinar la función de la PC, lo que puede lograrse midiendo la vía de señalización SHH canónica que está mediada casi exclusivamente por la PC. Aquí, se desarrolla una técnica basada en PCR cuantitativa (qPCR) para medir el nivel transcripcional de los genes de la vía SHH en células inactivas hTERT-RPE1 (o RPE1) que contienen principalmente PC. La quiescencia en las células RPE1 se logra mediante la inanición del suero durante 48 h, mientras que la activación de la vía SHH es promovida por un agonista específico. Este ensayo basado en cultivos celulares es fácil de seguir y sensible. La demostración exitosa de este ensayo en células RPE1 ciliadas indica su inmenso potencial como ensayo in vitro para examinar la función adecuada de la PC ante la alteración genética o epigenética de uno o varios genes, que pueden estar asociados con diversas ciliopatías.
Introducción
Un cilio es una protuberancia de la superficie celular basada en microtúbulos y recubierta de membrana, que se ensambla en un cuerpo basal1. En los vertebrados, se observan dos tipos de cilios, a saber, móviles e inmóviles. Los cilios móviles se localizan en tejidos especializados y confieren motilidad. Los cilios primarios (CP) inmóviles están presentes en la mayoría de las células de vertebrados, realizan funciones sensoriales y transducen señales críticas desde el medio extracelular hasta el interior de las células2. Una vez ensamblado, la elongación ciliar es ayudada por maquinaria d....
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Protocolo
1. Cultivo celular
- Paso de un matraz de cultivo celular T-25 casi confluente de células RPE1 con una dilución 1:5 del cultivo original a un matraz de cultivo celular T-25 fresco que contiene 5 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de mezcla de penicilina y estreptomicina (concentración final: 100 U/mL de penicilina G y 100 μg/mL de estreptomicina). Este medio se conoce como el medio completo. Cultive las células a 37 °C en presencia de 5% de CO2.
NOTA: Las células RPE1 son células no transformadas que se utilizan habitualmente ....
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Resultados
La activación de la vía de transducción de señales SHH mediada por PC es una forma de comprender el correcto funcionamiento de PC7. Aquí, la expresión relativa de los genes diana de la vía SHH se mide mediante el ensayo RT-qPCR tras la activación mediada por SAG de la vía SHH en células RPE1 que en su mayoría están ciliadas. Las salidas transcripcionales directas de la vía SHH GLI1 y PTCH1 se emplean con frecuencia para medir la actividad de esta vía11. Este protocolo tambi.......
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Discusión
Examinar la funcionalidad del CP es un paso crucial hacia la comprensión de la dinámica de la ciliación y las enfermedades o trastornos asociados con la disfunción del CP. Además de examinar la ciliación por inmunotinción en busca de marcadores ciliares o componentes estructurales ciliares marcados con fluoróforos, la función de la PC se determina comúnmente mediante el ensayo de la activación canónica de la vía SHH mediante la medición de la translocación ciliar de Smo en tejidos y célu.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de la beca Ramalingaswami a SM del Departamento de Biotecnología (DBT) del Gobierno de la India, y la beca de investigación de la Junta de Investigación en Ciencia e Ingeniería (SERB) del Gobierno de la India a SM (CRG/2020/004042). La beca de PH está patrocinada por la Comisión de Becas Universitarias (UGC) del Gobierno de la India. Los autores agradecen sinceramente al Dr. Chandrama Mukherjee y al Sr. Avik Mukherjee del Laboratorio RNABio del Instituto de Ciencias de la Salud de la Universidad de la Presidencia por acceder al instrumento de qPCR y por capacitarse en el instrumento, respectivamente.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMSO, filtrado estéril | Sigma | D2650 | |
| Burro, anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A21202 | |
| Burro, anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | ThermoFisher Scientific | A10042 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 41965039 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de | DulbeccoGibco, ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Microscopio de | Himedia RM1112 | |
| equipado con objetivo 60X | Carl Zeiss | Axio observador colibri 5 | |
| células hTERT-RPE1 | ATCC | CRL-4000 | |
| iScript Kit de síntesis de ADNc | Bio-Rad Laboratories 1708891 | ||
| ratón, anticuerpo monoclonal anti-tubulina acetilada | Milipore Sigma-Aldrich | T7451 | Dilución final 1:1000 |
| Penicilina-Estreptomicina, 100X | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Máquina de PCR cuantitativa, CFX 96 | Bio-Rad Laboratories | ||
| Conejo, anticuerpo policlonal Arl13B | ProteinTech | 17711-1-AP | Dilución final 1:250 |
| Conejo, anticuerpo policlonal Cep135 | ProteinTech | 24428-1-AP | Dilución final 1:500 |
| SlowFade gold Antifade moutant | ThermoFisher Scientific | S36940 | |
| Suavizado Agonista (SAG) | Abmole | M4865 | Solución madre: en DMSO, 5 mM |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725271 | |
| TRIzol Reactivo | Invitrogen | 15596026 | |
| TrypLE | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12605028 |
Referencias
- Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
- Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
- Eguether, T., ....
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Reimpresiones y permisos
