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Artículo de método

Ensayo cuantitativo basado en PCR para medir la señalización sónica de erizo en un modelo celular de ciliogénesis

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DOI:

10.3791/67407

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31 de enero de 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

En este artículo

Resumen

El estudio demuestra un ensayo cuantitativo basado en PCR para la activación de la vía de señalización de Sonic Hedgehog (SHH) mediada por cilios primarios utilizando el agonista SHH en un modelo celular de ciliogénesis.

Resumen

La ciliopatía se refiere a una colección de enfermedades y trastornos humanos multisistémicos y poligénicos que surgen debido a la aberración de la estructura o función de los cilios móviles o no móviles (primarios) que son protuberancias celulares basadas en microtúbulos. Los cilios primarios (PC) están presentes en la mayoría de los tejidos epiteliales y endoteliales humanos y sirven como centro para la transducción de señales fisiológicas, incluida la señalización del erizo sónico (SHH). Diversas situaciones exigen examinar la función de la PC, lo que puede lograrse midiendo la vía de señalización SHH canónica que está mediada casi exclusivamente por la PC. Aquí, se desarrolla una técnica basada en PCR cuantitativa (qPCR) para medir el nivel transcripcional de los genes de la vía SHH en células inactivas hTERT-RPE1 (o RPE1) que contienen principalmente PC. La quiescencia en las células RPE1 se logra mediante la inanición del suero durante 48 h, mientras que la activación de la vía SHH es promovida por un agonista específico. Este ensayo basado en cultivos celulares es fácil de seguir y sensible. La demostración exitosa de este ensayo en células RPE1 ciliadas indica su inmenso potencial como ensayo in vitro para examinar la función adecuada de la PC ante la alteración genética o epigenética de uno o varios genes, que pueden estar asociados con diversas ciliopatías.

Introducción

Un cilio es una protuberancia de la superficie celular basada en microtúbulos y recubierta de membrana, que se ensambla en un cuerpo basal1. En los vertebrados, se observan dos tipos de cilios, a saber, móviles e inmóviles. Los cilios móviles se localizan en tejidos especializados y confieren motilidad. Los cilios primarios (CP) inmóviles están presentes en la mayoría de las células de vertebrados, realizan funciones sensoriales y transducen señales críticas desde el medio extracelular hasta el interior de las células2. Una vez ensamblado, la elongación ciliar es ayudada por maquinaria de transporte intraflagelar (IFT), que es un sistema de transporte bidireccional que transporta carga impulsada por cinesinas (movimiento anterógrado) y proteínas motoras de dineína-II (movimiento retrógrado)3,4. Los defectos estructurales o funcionales en los cilios móviles o primarios pueden conducir a una plétora de enfermedades humanas multisistémicas que se conocen colectivamente como ciliopatías 5,6.

El PC sirve como centro para varios procesos de señalización del desarrollo, como Wingless (Wnt), receptores acoplados a proteínas G (GPCR), receptores de tirosina quinasas (RTKs), factor de crecimiento transformante β (TGFβ) y señalización del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) 7,8. En los mamíferos, la señalización del erizo sónico (SHH) es crítica, ya que es transducida casi exclusivamente por PC en células que contienen PC 9,10,11. La estructura o función aberrante del CP conduce a vías de señalización atenuadas que se asocian con enfermedades como defectos cardíacos congénitos, enfermedad renal poliquística, anomalías craneofaciales, distrofia de retina y algunas enfermedades raras como el síndrome de Bardet-Biedl (BBS), el síndrome de Joubert (JBTS), el síndrome de Alström, la displasia torácica asfixiante de Jeune (JATD)12,13,14,15 . La mayoría de estas son enfermedades poligénicas de los tejidos epiteliales o endoteliales, lo que dificulta el diagnóstico y tratamiento precoz de estas enfermedades. Determinar cómo estas mutaciones contribuyen a la señalización atenuada mediada por PC en un modelo de cultivo celular no solo puede proporcionar información sobre la complejidad molecular de esa vía de señalización, sino que también facilita el diagnóstico de diversas ciliopatías y puede sugerir intervenciones terapéuticas. Con esta noción, se desarrolla un ensayo basado en PCR cuantitativa (qPCR) para determinar la alteración en la vía de señalización SHH mediada por PC en células epiteliales pigmentarias de la retina inmortalizadas con transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT) (hTERT-RPE1, denominado aquí RPE1). Las células RPE1 son células humanas casi diploides, no transformadas, que se utilizan ampliamente como modelo celular para la ciliogénesis, ya que aproximadamente el 75%-80% de estas células ensamblan PC tras la inanición del suero (incubando las células en medio libre de suero) durante 24-48 h, en comparación con solo el 15%-18% de ciliación en un cultivo de crecimiento asincrónico de células RPE116.

La señalización del erizo (HH) se conserva entre los vertebrados para el desarrollo embrionario17. En los mamíferos, se observan tres tipos diferentes de señalización del erizo: sónica (SHH), india (IHH) y desértica (DHH), de las cuales SHH e IHH muestran funciones superpuestas a nivel tisular11. La señalización de SHH desempeña un papel clave durante el desarrollo embrionario al regular el patrón de las extremidades y la especificación del tipo de célula en el sistema nervioso y mantener la homeostasis del tejido adulto 10,11,18. Aunque la señalización de SHH es compleja, cada vez hay más pruebas que sugieren que la señalización canónica de SHH depende de PC 7,11,19, que está mediada por funciones colectivas de los factores de transcripción Gli (Gli1, Gli2 y Gli3). Se ha sugerido que la señalización de HH y PC han coevolucionado, con componentes de señalización críticos concentrados en el volumen compacto en la punta del cilio para permitir respuestas efectivas a relaciones bajas de ligandos11.

En ausencia de ligandos SHH, Patched1 (Ptch1), que se localiza en la membrana de PC, inhibe la actividad de Smoothened (Smo) a través de un mecanismo poco conocido que probablemente involucra el transporte de lípidos, manteniendo así la vía reprimida 7,20. El GPR161 ciliar constitutivamente activo, que es un receptor de proteína acoplado a G y un regulador negativo del sistema, asegura que la represión se mantenga mediante la preservación de altos niveles de AMP cíclico ciliar (cAMP) que aumenta la actividad de la proteína quinasa A (PKA)21, y manteniendo la localización ciliar de PKA7. La actividad de PKA, junto con la caseína quinasa 1 (CK1) y la glucógeno sintasa quinasa 3 β (GSK3β), fosforila múltiples residuos de las proteínas Gli, Gli2 y Gli3, dentro de PC. Gli2 y Gli3 pueden actuar como activadores y represores de la transcripción de genes diana. La fosforilación mediada por PKA provoca la inhibición de la función activadora de Gli2, mientras que la Gli3 fosforilada es escindida por las proteasas para producir la forma represora Gli3R22. En general, la expresión de los genes diana SHH se reprime en tales condiciones.

Cuando el ligando SHH está presente, Ptch1 se une a él y GPR161 abandona el PC, y el Smo, al ser fosforilado por la quinasa 2 (GPRK2) y CK1 del receptor acoplado a proteínas G (GPCR), se trafica con PC, junto con la β-arrestina y el motor de microtúbulos KIF3A23. En conjunto, se promueve la localización de Gli2/3, supresor de fusión (SUFU) y Kif7 en la punta ciliar y se relaciona con una disminución de la escisión de Gli2/3, aumentando así la función activadora de Gli2/324,25. Una vez activado, Gli2/3 induce la expresión de Gli1, que solo puede funcionar como activador, y por lo tanto amplifica la respuesta de la vía SHH22. La unión de SHH a Ptch1 se ve facilitada por oncogenes (CDO), hermano de CDO (BOC), específico de detención del crecimiento 1 (GAS1) y proteína 2 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP2). Por el contrario, la proteína que interactúa con el erizo (HHIP) puede secuestrar SHH al interactuar directamente con ella y también compite con Ptch1 al interactuar con SHH26. Es importante destacar que GLI1, HHIP y PTCH1 se transcriben tras la activación de la vía SHH, mientras que las dos últimas participan en la regulación negativa de la vía SHH.

Estudios previos demostraron que los niveles de transcripción de los genes diana de SHH pueden medirse para evaluar la vía de SHH, aunque pueden variar significativamente en diferentes tipos de células27,28. Tal variación en la respuesta de la vía SHH puede atribuirse a diferentes combinaciones de señalización SHH mediada por PC y señalización SHH mediada por la membrana celular, probablemente en ausencia de PC. SAG es un agonista de Smo que se utiliza en este método para imitar la activación de la señalización de SHH en células RPE1 carentes de suero que están principalmente ciliadas. Los niveles de transcripción de los genes diana de SHH como HHIP, GLI1 y PTCH1 y un gen no diana SMO se midieron mediante qPCR en células de control y tratadas con SAG y se compararon para determinar la activación de la vía SHH. La demostración exitosa de este ensayo sensible basado en cultivos celulares para medir la señalización SHH mediada por PC sugiere su prometedora aplicación en la investigación biomédica asociada con la función de los cilios primarios.

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Protocolo

1. Cultivo celular

  1. Paso de un matraz de cultivo celular T-25 casi confluente de células RPE1 con una dilución 1:5 del cultivo original a un matraz de cultivo celular T-25 fresco que contiene 5 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de mezcla de penicilina y estreptomicina (concentración final: 100 U/mL de penicilina G y 100 μg/mL de estreptomicina). Este medio se conoce como el medio completo. Cultive las células a 37 °C en presencia de 5% de CO2.
    NOTA: Las células RPE1 son células no transformadas que se utilizan habitualmente para estudiar la regulación molecular del ensamblaje y desmontaje de PC en cultivos celulares. Aproximadamente el 80% de las células RPE1 ensamblan PC tras la inanición del suero, que se desensambla nuevamente al volver a agregar el suero16.
  2. Prepare los cubreobjetos de vidrio redondos de 12 mm incubándolos en 50 mL de HCl 1 N en un vaso de precipitados de vidrio cubierto durante la noche sin agitar a 60 °C en un baño de agua o incubadora.
  3. Al día siguiente, con una pipeta de 25 ml, pipetee la solución ácida y deséchela correctamente en un recipiente con peligro químico. A continuación, lave los cubreobjetos 3 veces en 100 ml de agua destilada incubándolos durante 15 minutos con agitaciones ocasionales, seguido de pipeteo.
  4. Repita los pasos de lavado con 70% de etanol y 95% de etanol. Seque los cubreobjetos colocándolos individualmente sobre un papel secante de laboratorio en una cabina de bioseguridad. Una vez seco, esterilizar con radiación UV durante 60 min.

2. Crecimiento celular, inanición de suero y tratamiento con SAG

  1. Vuelva a suspender las células en el matraz T-25 en un medio completo precalentado después de desalojar las células por la actividad enzimática de la solución precalentada de tripsina-EDTA al 0,25%. Determine la densidad celular de la suspensión contando las células con un hemocitómetro.
  2. Prepare dos placas de cultivo celular de 35 mm y coloque dos cubreobjetos estériles de 12 mm en cada una de ellas. Pase 2 x 105 células RPE1 en crecimiento asíncrono en cada placa de 35 mm que contenga cubreobjetos y crecimiento de las células en 2 mL de medio completo durante 24 h.
  3. Después de 24 horas, retire el medio de crecimiento de las células RPE1 y lave las células 1 vez con 1 ml precalentado de tampón DPBS. Añadir 2 mL de medio DMEM precalentado que contenga un 1% de penicilina-estreptomicina pero desprovisto de FBS (medio libre de suero) a cada placa e incubar las células durante 24 h a 37 °C en presencia de 5% de CO2.
  4. Después de 24 h, reemplace el medio con el medio libre de suero que contenga SAG hasta una concentración final de 250 nM o DMSO como solvente de control e incube las células durante otras 24 h. En la Figura 1A se muestra un diagrama de dibujos animados del protocolo de cultivo celular.

3. Recolección de células

  1. Transfiera los cubreobjetos a una placa de 24 pocillos con un cubreobjetos en cada pocillo. Añada 0,5 mL de metanol frío a cada pocillo e incube la placa a -20 °C durante 10 min para fijar las células en los cubreobjetos. Inmediatamente después, lave los cubreobjetos 3 veces con 0,5 mL de tampón de lavado (1x PBS que contiene 0,5 mM de MgCl2 y 0,05% de Triton-X 100).
  2. Deseche el medio y agregue 0,5 ml de reactivo de trizol directamente a cada plato. Déjalo distribuir uniformemente y conservar durante 5 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para hacer una mezcla homogénea y recogerla en tubos de microcentrífuga sin nucleasas de 1,5 mL.

4. Preparación de ARN total y ADNc

  1. Añadir 0,1 mL de cloroformo a cada tubo que contenga células lisadas e incubar durante 2-3 min. Centrifugar cada muestra durante 15 minutos a 12.000 x g a 4 °C. Transfiera la fase acuosa que contiene el ARN a tubos de microcentrífuga nuevos.
  2. Añadir 0,25 mL de isopropanol a la fase acuosa e incubar durante 10 min. Centrifugar durante 10 min a 12.000 x g a 4°C. El precipitado de ARN forma una bolita blanca similar a un gel. Con una micropipeta, deseche el sobrenadante.
  3. Vuelva a suspender el gránulo de ARN en 0,5 mL de etanol al 75% recién diluido. Agite las muestras brevemente y luego centrifugue durante 5 minutos a 7500 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante con una micropipeta.
  4. Secar al aire el pellet de ARN durante 10 minutos y volver a suspender en 25 μL de agua sin nucleasas. Determine la concentración de ARN total midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes.
  5. Utilice 1-3 μg de ARN total de ambas muestras para preparar ADNc siguiendo las instrucciones del fabricante para un kit de síntesis de ADNc. Almacene el ADNc a -20 °C.

5. PCR cuantitativa

  1. Ajuste las reacciones de qPCR (por triplicado, Tabla 1) utilizando ADNc diluidos 1:5 de cada muestra con juegos de cebadores de GLI1, PTCH1, HHIP, SMO y β-ACTINA (como gen de mantenimiento; Tabla 2) genes con una mezcla maestra de qPCR que contiene ADN polimerasa, dNTP y tampón adecuados, en una placa de PCR sensible a la fluorescencia y multipocillos adecuada.
  2. Cubra la placa con un sellador adecuado, colóquela en un instrumento de qPCR adecuado y ejecute un programa de qPCR estandarizado con 40 ciclos de amplificación y un paso de análisis de la curva de fusión al final del programa. El programa estandarizado de qPCR de 40 ciclos, que incluye un análisis de la curva de fusión, se muestra esquemáticamente en la Figura 1B.
  3. Cuando se complete el programa de qPCR, verifique la curva de fusión de cada amplicón para ver si hay un solo pico a la temperatura deseada.
    NOTA: Al final de los ciclos de amplificación, el análisis de la curva de fusión asociada mide la temperatura de fusión del amplicón aumentando la temperatura de cada pozo de 65 °C a 95 °C, con un incremento de 0,5 °C por paso de 5 s de duración.
  4. Exporte los datos de amplificación a una hoja de cálculo y calcule la expresión relativa (método 2-ΔΔCT) de cada transcripción normalizando con respecto a la del gen β-ACTIN para cada muestra. Traza el gráfico y calcula la significación estadística de los cambios en la expresión relativa de cada transcripción utilizando una prueba T no apareada.

6. Inmunotinción y adquisición de imágenes mediante microscopía de fluorescencia

  1. Incubar las células fijas en cubreobjetos en 200 μL de tampón de bloqueo (2% de BSA y 0,1% de TritonX-100 en 1x PBS) durante 30 min.
  2. Incubar las células con una mezcla de anticuerpos primarios (típicamente un anti-ratón contra la α-tubulina acetilada del axonema de PC y anticuerpos anti-conejo contra la membrana ciliar y el centriolo, respectivamente) diluidos en tampón de bloqueo (ver Tabla de Materiales para la dilución final) durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
    1. Haga una cámara humidificada colocando una toalla de papel húmeda en la mitad inferior de una caja vacía de puntas de pipeta de 1 ml. Coloque una tira de película transparente sobre la superficie de la gradilla y coloque una gota (20 -25 μL) de la solución de anticuerpos sobre la película, una por cada cubreobjetos que se incube. Coloque un cubreobjetos sobre las gotas para que las células queden sumergidas y cierre la tapa de la caja de puntas.
  3. Al día siguiente, invierta los cubreobjetos nuevamente y devuélvalos al plato de 24 pocillos. Lave los cubreobjetos con el tampón de lavado y luego incube en 150 μL de mezcla de anticuerpos secundarios con una dilución preestandarizada de anticuerpos (en este caso, anti-ratón conjugado con colorante verde-fluorescente y anti-conejo conjugado con colorante fluorescente rojo diluido en tampón de bloqueo) y reactivos de tinción de ADN nuclear durante 1 h a temperatura ambiente. Lave los cubreobjetos 3 veces.
  4. Localice una gota (aproximadamente 3-5 μL) de la solución de montaje que contiene reactivo antidecoloración en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Coloque un cubreobjetos, con el lado de la celda hacia abajo, sobre la solución de montaje. Limpie el exceso de líquido presionando suavemente una toallita limpia. Aplica esmalte de uñas transparente a lo largo del borde del cubreobjetos para sellarlo en el portaobjetos.
  5. Coloque un portaobjetos en el microscopio (ver Tabla de Materiales) conectado con una platina motorizada y una cámara capaz de tomar imágenes digitales. Utilice un objetivo de inmersión en aceite Plan Apo de 60x (con una apertura numérica de 1,4) para adquirir las imágenes de las células RPE1 hambrientas de suero a temperatura ambiente, para visualizar el PC en las células, según lo marcado por los anticuerpos mencionados.
  6. Adquiera imágenes de las diferentes muestras en cubreobjetos separados utilizando un tiempo de exposición idéntico para diferentes fluoróforos a lo largo del eje Z utilizando un paquete de software de imágenes de microscopía digital. Cuente el número de células que contienen PC de al menos 500 células para determinar el porcentaje de ciliación en 48 h de falta de suero.

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Resultados

La activación de la vía de transducción de señales SHH mediada por PC es una forma de comprender el correcto funcionamiento de PC7. Aquí, la expresión relativa de los genes diana de la vía SHH se mide mediante el ensayo RT-qPCR tras la activación mediada por SAG de la vía SHH en células RPE1 que en su mayoría están ciliadas. Las salidas transcripcionales directas de la vía SHH GLI1 y PTCH1 se emplean con frecuencia para medir la actividad de esta vía11. Este protocolo tambi...

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Discusión

Examinar la funcionalidad del CP es un paso crucial hacia la comprensión de la dinámica de la ciliación y las enfermedades o trastornos asociados con la disfunción del CP. Además de examinar la ciliación por inmunotinción en busca de marcadores ciliares o componentes estructurales ciliares marcados con fluoróforos, la función de la PC se determina comúnmente mediante el ensayo de la activación canónica de la vía SHH mediante la medición de la translocación ciliar de Smo en tejidos y célu...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo de la beca Ramalingaswami a SM del Departamento de Biotecnología (DBT) del Gobierno de la India, y la beca de investigación de la Junta de Investigación en Ciencia e Ingeniería (SERB) del Gobierno de la India a SM (CRG/2020/004042). La beca de PH está patrocinada por la Comisión de Becas Universitarias (UGC) del Gobierno de la India. Los autores agradecen sinceramente al Dr. Chandrama Mukherjee y al Sr. Avik Mukherjee del Laboratorio RNABio del Instituto de Ciencias de la Salud de la Universidad de la Presidencia por acceder al instrumento de qPCR y por capacitarse en el instrumento, respectivamente.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMSO, filtrado estérilSigmaD2650
Burro, anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Burro, anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) deDulbeccoGibco, ThermoFisher Scientific14190144
Suero fetal bovino (FBS)Microscopio deHimedia RM1112
equipado con objetivo 60XCarl Zeiss Axio observador colibri 5
células hTERT-RPE1ATCCCRL-4000
iScript Kit de síntesis de ADNcBio-Rad Laboratories 1708891
ratón, anticuerpo monoclonal anti-tubulina acetiladaMilipore Sigma-AldrichT7451Dilución final 1:1000
Penicilina-Estreptomicina, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
Máquina de PCR cuantitativa, CFX 96Bio-Rad Laboratories
Conejo, anticuerpo policlonal Arl13BProteinTech17711-1-APDilución final 1:250
Conejo, anticuerpo policlonal Cep135ProteinTech24428-1-APDilución final 1:500
SlowFade gold Antifade moutantThermoFisher ScientificS36940
Suavizado Agonista (SAG) AbmoleM4865Solución madre: en DMSO, 5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
TRIzol ReactivoInvitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisher Scientific12605028
fluorescencia

Referencias

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