Inmunización activa para inducir miastenia gravis autoinmune de la quinasa específica del músculo (MuSK) en ratones

Resumen

Este artículo presenta un protocolo completo para un modelo experimental de ratón de miastenia gravis autoinmune de quinasas específicas del músculo (MuSK), con el objetivo de investigar la fisiopatología y las posibles estrategias terapéuticas para la enfermedad.

Resumen

La miastenia gravis (MG) es un trastorno autoinmune que afecta a la unión neuromuscular. Si bien la mayoría de los pacientes con MG producen autoanticuerpos contra el receptor de acetilcolina (AChR), un subconjunto de pacientes exhibe autoanticuerpos dirigidos a la quinasa específica del músculo (MuSK). La MG MuSK se caracteriza por debilidad muscular grave, manifestaciones clínicas resistentes al tratamiento y crisis miasténicas, que a menudo requieren ventilación mecánica. En consecuencia, los pacientes requieren con frecuencia el uso prolongado de inmunosupresores, que se asocian con efectos adversos a largo plazo. Dada la gravedad y la rareza de MuSK-MG, el desarrollo de un modelo animal experimental es crucial para avanzar en nuevas modalidades de tratamiento y una comprensión más profunda de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. La miastenia gravis autoinmune experimental (EAMG) sirve como modelo animal para MuSK-MG, imitando de manera efectiva pero parcial las características clínicas e inmunológicas de la MG humana. La inducción de modelos animales autoinmunes puede lograrse mediante inmunización activa o pasiva. En el protocolo experimental aquí presentado, se empleó la inmunización activa mediante la administración subcutánea del dominio extracelular purificado de MuSK humano emulsionado en adyuvante completo de Freund con Mycobacterium tuberculosis matado por calor. La inmunización se llevó a cabo en cuatro sitios, seguida de una inyección de refuerzo de MuSK el día 28. Este adyuvante con M. tuberculosis permite la activación del sistema inmunitario a través de TLR4 y mejora la fagocitosis del antígeno administrado. Este artículo detalla exhaustivamente el desarrollo y la caracterización de MuSK-EAMG desde su inicio hasta su conclusión.

Introducción

La miastenia gravis (MG) es una enfermedad autoinmune que se desarrolla a través de mecanismos mediados por anticuerpos dependientes de células T. Es causada principalmente por anticuerpos contra los receptores nicotínicos de acetilcolina (AChR) en la membrana postsináptica de la unión neuromuscular (NMJ) en el 80-85% de los pacientes, y por anticuerpos contra la cinasa muscular específica (MuSK) en aproximadamente el 5% de los pacientes, así como otras proteínas NMJ. La MG se ha convertido en un prototipo de los trastornos autoinmunes y en un modelo para comprender^{la función} postsináptica. Los modelos animales de trastornos autoinmunes se pueden dividir en dos categorías principales: (1) modelos espontáneos, en los que los animales desarrollan naturalmente una enfermedad autoinmune, y (2) modelos inducidos, en los que la enfermedad autoinmune se imita y replica artificialmente. Los estudios sobre la miastenia gravis (MG) han demostrado que tanto la inmunización activa como la pasiva pueden inducir la enfermedad, contribuyendo significativamente a la comprensión de las enfermedades mediadas por anticuerpos².

La transferencia pasiva es un método muy eficaz para evaluar los efectos agudos de las enfermedades mediadas por autoanticuerpos y se ha utilizado ampliamente para estudiar los anticuerpos derivados de pacientes en la MG. Este enfoque ha sido beneficioso para ampliar la comprensión de los factores inmunológicos subyacentes a la enfermedad. Por ejemplo, los estudios de transferencia pasiva han demostrado el impacto patogénico de la IgG4 anti-MuSK en la reducción de los grupos de AChR³. Sin embargo, existen algunas limitaciones en el modelo de transferencia pasiva, como las diferencias funcionales entre la IgG humana y de roedores y los sistemas inmunitarios y la insuficiencia del modelo de transferencia pasiva para imitar los mecanismos de activación inicial de la autoinmunidad anti-MuSK que ocurre en los tejidos linfoides.

Por otro lado, una posible limitación de los estudios de inmunización es la variabilidad inmunogenética entre diferentes cepas de ratón⁴. Por ejemplo, mientras que los ratones C57BL/6 (B6) son susceptibles a la inmunización activa con AChR, los ratones AKR/J son resistentes. Por lo tanto, al crear un modelo animal de EAMG, es crucial seleccionar correctamente la especie animal, el método de inmunización y el contenido del protocolo para reflejar con precisión la enfermedad⁵.

Además, el uso del antígeno diana como una proteína completa a menudo da como resultado títulos altos de anticuerpos. Sin embargo, no todos los anticuerpos pueden reaccionar de forma cruzada con el antígeno del ratón o producir epítopos causantes de enfermedades. Por lo tanto, los modelos de inmunización activa no siempre reflejan con precisión la patología humana. Sin embargo, cuando crean con éxito un fenotipo clínico y fisiológico adecuado, estos modelos proporcionan una plataforma a largo plazo para probar terapias experimentales.

Los estudios clínicos indican mecanismos de enfermedad divergentes y requisitos terapéuticos para MuSK-MG, lo que pone de manifiesto la necesidad de una mayor identificación de las características patogénicas específicas de este subtipo de MG ^4,5,6. Los estudios previos de MuSK EAMG basados en la inmunización activa mostraron una participación predominante de la inmunidad de tipo Th2 y la IgG1 anti-ratón en la autoinmunidad de MuSK e identificaron una serie de posibles modalidades de tratamiento (p. ej., teriflunomida, células madre mesenquimales, fCRLB shRNA) para MuSK MG^{humano 7,8,9}. Esto demostró la importancia del modelo MuSK EAMG para probar nuevas dianas terapéuticas e investigar la fisiopatología de MuSK MG.

En este artículo, se han detallado los procedimientos para la inducción del modelo animal, el seguimiento de la progresión de la enfermedad y la validación de la inducción de EAMG. La evaluación clínica implicó el control del peso, la postura, la fuerza de agarre y las puntuaciones clínicas por parte de un observador. Los ratones fueron sacrificados 28 días después de la segunda inmunización, y se recolectaron varios tejidos, incluyendo sangre, músculo de las extremidades traseras, bazo y ganglios linfáticos axilares e inguinales, para confirmar el establecimiento de la enfermedad. Los anticuerpos anti-MuSK se cuantificaron en sueros mediante el método ELISA. Además, se realizó una tinción inmunofluorescente en los tejidos musculares para visualizar los depósitos en la unión neuromuscular. Para demostrar y comparar las respuestas clínicas e inmunitarias en grupos de ratones con diferente susceptibilidad a MuSK EAMG, los ratones tratados con KCNS3 shRNA mostraron acción proinflamatoria (no publicado), y FCRLB shRNA mostró acción antiinflamatoria⁹, según lo determinado en estudios previos.

Protocolo

El protocolo fue aprobado por el Comité Local de Ética para Experimentos con Animales de la Universidad de Estambul (HADYEK) con el número de decisión 2020/29. En nuestros estudios previos ^7,8,9, el modelo EAMG fue inducido en ratones BALB/c o B6 de 8-10 semanas de edad mediante inmunización activa con la proteína MuSK. En este artículo se presentan datos ejemplares obtenidos de diferentes experimentos con ratones BALB/C inmunizados con MuSK (4-8 ratones por grupo). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Producción y preparación de MuSK humano para la inmunización

1. Clonar los aminoácidos de dominio extracelular MuSK humano 24-495 (secuencia de referencia NCBI: NP_005583.1) en el vector pPIC9.
2. Expresión de segregación en el sistema de levaduras Pichia pastoris (cepa GS115).
3. Inducir la expresión mediante la adición de metanol (2,5% v/v) en el medio de crecimiento.
4. Agregue una etiqueta C-terminal 6xHIS para fines de purificación.
5. Expresa la proteína como una proteína glicosilada secretada y purifica en condiciones nativas. Diálisar el medio de cultivo contra tampón de fosfato 50 mM pH 8.0, 300 mM NaCl.
6. Continúe con la cromatografía de afinidad de iones de níquel utilizando Ni²⁺/nitrilotriacetato de agarosa (Ni-NTA). Almacene la proteína purificada después de la adición de glicerol al 10% a -80 °C, donde sea estable durante al menos dos años¹⁰.
   NOTA: Los niveles de expresión, estimados después de la purificación de Ni-NTA, son de aproximadamente 0,4 mg/L de cultivo. No se detectaron otras impurezas proteicas en las muestras analizadas por SDS-PAGE.
7. Antes de la inmunización, verificar la pureza del dominio extracelular aislado de la proteína MuSK mediante electroforesis en gel (Figura suplementaria 1).
8. Prepare el MuSK para cada ratón a una concentración de 45 μg/100 μL de PBS.
9. Homogeneizar (emulsionar) el MuSK en una proporción de 1:1 con PBS (100 μL) y el adyuvante completo de Freund (CFA-100 μL) que contiene Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 mg/10 mL) (el volumen total de la emulsión es de 200 μL por ratón).

2. Anestesia y procedimiento de inmunización

1. Antes de la inmunización, diluya el propofol en PBS (proporción 1:5).
2. Administrar por vía intraperitoneal a 50 mg/kg por ratón.
   NOTA: El isoflurano también se puede utilizar para la anestesia por inhalación (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). La concentración inicial suele establecerse en 3%-5% con un caudal de oxígeno de 1-2 L/min, mientras que la concentración de mantenimiento suele ser del 1%-3% con un caudal de oxígeno de 0,5-1 L/min.
3. Primera inmunización: Inyectar un total de 45 μg/200 μL de MuSK preparado en CFA por vía subcutánea en los hombros y la parte interna de las patas traseras (aproximadamente 11,25 μg/50 μL para cada parte).
4. Segunda inmunización: Inyectar un total de 45 μg/200 μL de MuSK preparado en CFA por vía subcutánea en los hombros y las caderas (aproximadamente 11,25 μg/50 μL para cada parte).
   NOTA: Administre las inyecciones dos veces en un intervalo de 28 días para establecer el modelo. La administración intramuscular se asocia con dolor muscular, que puede interferir con la evaluación de la debilidad clínica. Dado que la EAMG es una enfermedad muscular, la utilización de la inyección intramuscular puede inducir debilidad no miasténica relacionada con el dolor y, por lo tanto, actuar como un factor de confusión. Se recomienda un grupo de control inmunizado solo con CFA (sin MuSK).

3. Puntuación clínica

1. Ejercite a los ratones arrastrándolos suavemente 40 veces a través de la rejilla superior de una jaula mientras intentan agarrar la rejilla para inducir fatiga, ya que los síntomas de miastenia gravis en ratones se vuelven más pronunciados después del ejercicio y la fatiga.
2. Después de hacer ejercicio, observe cuidadosamente a los ratones para detectar cambios en la actividad, el peso y la fuerza muscular. Asigne puntuaciones apropiadas basadas en estas observaciones para guiar los criterios de evaluación.
   NOTA: Puntuación 0: Los ratones permanecen activos y continúan explorando su entorno; Puntuación 1: Se observa una postura encorvada después del ejercicio, pero los ratones vuelven a la actividad normal y a la sociabilidad. El aseo de la piel se mantiene en general. Puntuación 2: Una postura encorvada es visible incluso antes del ejercicio y se vuelve más pronunciada después del ejercicio. Se observa una disminución en el aseo personal y la actividad. Puntuación 3: Se observa una postura encorvada dramática antes y después del ejercicio. Hay una disminución significativa del movimiento, la sociabilidad y la fuerza muscular, acompañada de una pérdida de peso de 1-2 gramos cada 2-3 días. Se produce deshidratación, lo que dificulta que los ratones alcancen el agua y la comida. La deshidratación se identifica cuando la piel no regresa rápidamente después de ser pellizcada y cambios en las heces. Los ratones con dolor se caracterizan por entrecerrar los ojos y una postura encorvada. Se sacrifican ratones que muestran signos de dolor intenso y pérdida de peso superior al 20%. Puntuación 4: El ratón es encontrado muerto en la jaula. El ratón fallecido debe retirarse inmediatamente y la jaula debe cambiarse⁵.
3. Revise a los ratones diariamente, ya que los síntomas progresaron rápidamente aproximadamente 10 días después de la segunda inmunización. Realice puntuaciones y mediciones clínicas semanalmente durante los primeros 28 días y luego dos veces por semana.
4. Realizar la medición del peso.
   NOTA: La medición del peso proporciona un parámetro crucial para el seguimiento de la progresión de la enfermedad. Debido a las altas tasas metabólicas de los ratones, el peso corporal puede variar significativamente. Es importante utilizar la misma escala para todas las mediciones y realizar estas mediciones a la misma hora del día para mantener la consistencia.
5. Realizar la medición de la fuerza muscular. Use un dinamómetro horizontal con un cable de rejilla para medir la fuerza muscular.
   1. Ejercite a los ratones para obtener una puntuación clínica arrastrándolos suavemente sobre la jaula 40 veces para inducir la fatiga.
   2. Coloque inmediatamente cada ratón en la rejilla del dinamómetro y tire suavemente de la cola, asegurándose de que todas las patas estén firmemente agarradas a la rejilla. Considere solo las medidas en las que los ratones agarran la rejilla con las cuatro patas.
      NOTA: Trate de aplicar la misma cantidad de fuerza durante cada medición, y se recomienda que el mismo investigador realice todas las mediciones para mantener la confiabilidad y reducir la variabilidad. Dado que la fatigabilidad es el sello distintivo de la debilidad de la MG, se deben realizar una serie de pruebas de fuerza de agarre sin medir la fuerza de agarre. Posteriormente, se realizaron siete mediciones para cada ratón y se descartaron los valores máximo y mínimo. El promedio de las cinco mediciones restantes se calcula para garantizar resultados confiables.

4. Preparación de la muestra de tejido

NOTA: Sacrifique a los ratones 28 días después de la segunda inmunización siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente. La recolección de sangre, músculo, bazo y ganglios linfáticos de los ratones sacrificados será beneficiosa para futuras investigaciones.

1. Extracción de sangre cardíaca
   NOTA: Para recolectar sangre cardíaca, anestesiar a los ratones con un anestésico adecuado (por ejemplo, propofol) aprobado por el comité de ética. La punción cardíaca requiere anestesia y es un procedimiento terminal, lo que significa que los animales deben ser sacrificados inmediatamente después.
   1. Después de anestesiar profundamente a la rata, colóquela boca arriba, abra el abdomen y ubique el corazón, aproximadamente 1 cm por encima de la costilla más baja y ligeramente hacia la derecha.
   2. Con una aguja de 25-35 G, extraiga sangre cuidadosamente del ventrículo izquierdo en un ángulo de 45 grados sin mover la jeringa para evitar complicaciones¹¹.
   3. Transfiera las muestras de sangre a tubos secos para la separación del suero y/o a tubos de EDTA para el aislamiento del ARN, si está previsto.
   4. Separar el suero por centrifugación y mantener las muestras de suero a -20 °C hasta su uso.
2. Conservación y preparación de muestras musculares
   1. Recoger el músculo tibial anterior 11,12,13. Enjuague con PBS helado.
   2. Coloque las muestras en tubos criogénicos, sumérjalas inmediatamente en isopentano líquido enfriado por nitrógeno a -20 °C y guárdelas en un congelador de -80 °C.
      NOTA: Las muestras deben congelarse rápidamente para obtener resultados más precisos en los experimentos.
   3. Coloque los tejidos verticalmente en un soporte de sección; Se puede utilizar un corcho. Incruste las muestras para la tinción de inmunofluorescencia en OCT (compuesto de temperatura de corte óptima).
   4. Permita que el tejido flote sobre isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Almacenar en un congelador a -80 °C hasta el corte con un criostato.

5. Evaluación de las uniones neuromusculares mediante marcaje con inmunofluorescencia

1. Corte y fijación del criostato
   1. Seccionar los tejidos congelados embebidos en OCT a -24 °C hasta un espesor de 7 μm utilizando un criostato.
   2. Fijar las secciones en acetona enfriadas a -20 °C. Lavar con PBS durante 5 min.
   3. Lavar de nuevo PBS que contiene 0.4% Triton X (PBS-T) durante 10 min.
      NOTA: Se puede realizar una etapa de permeabilización para corregir la conformación de las moléculas afectadas por la fijación, asegurando una unión más precisa. La permeabilización implicó tratamiento con PBS que contenía 1% de FBS durante 10 min y PBS-T durante otros 10 min.
   4. Bloquee las secciones con PBS-T que contenga un 10% de FBS durante 30 minutos para evitar enlaces inespecíficos.
2. Tinción de inmunofluorescencia
   NOTA: Para la tinción, se pueden utilizar los siguientes anticuerpos: C3, IgG, marcador del receptor de acetilcolina α-bungarotoxina.
   1. Diluir los anticuerpos seleccionados en PBS-T que contenga un 1% de FBS.
   2. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2,5 h.
   3. Lave las secciones con PBS-T que contiene 1% de FBS.
   4. Contratinción con DAPI.
   5. Almacene las secciones hasta su examen bajo un microscopio de fluorescencia en un ambiente oscuro y húmedo a 4 °C.
   6. Realizar imágenes y análisis.
      NOTA: Las uniones neuromusculares positivas para bundarotoxina (BTX) en cada sección deben contarse con un microscopio de fluorescencia. Captura imágenes con un aumento de 20x. Para el análisis, las uniones neuromusculares BTX y C3 o IgG positivas se contaron manualmente bajo el microscopio. Para el análisis se debe utilizar el porcentaje de uniones dobles positivas en relación con el total de uniones etiquetadas con BTX en secciones seriales.

6. Western blot

1. Aislamiento y cuantificación de proteínas
   1. Use muestras de músculo que se congelen rápidamente.
   2. Prepare un tampón de lisis con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa.
   3. Agregue 0,5 mm de perlas de óxido de circonio iguales al peso de la muestra y 2 veces el volumen del tampón de lisis.
   4. Homogeneizar las muestras con un homogeneizador.
   5. Centrifugar el lisado a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
   6. Recoja el sobrenadante que contiene el lisado de proteínas.
   7. Utilice un kit de ensayo de BCA o un reactivo de Bradford para cuantificar la concentración de proteínas.
   8. Prepare las muestras de proteínas hasta la concentración deseada con tampón de lisis. 25 μg de proteína por pocillo es eficiente para mostrar AChR.
2. Electroforesis en gel SDS-PAGE
   1. Mezcle muestras de proteínas con 4x tampón Laemmli.
   2. Calentar las muestras a 95 °C durante 5 min para que se desnaturalicen.
   3. Cargue cantidades iguales de proteína y una escalera de proteínas en pocillos de un gel SDS-PAGE.
   4. Haga funcionar el gel a 200 V durante 30 minutos (el tiempo puede variar entre las diferentes fuentes de alimentación).
3. Transferencia de proteínas
   1. Para la transferencia semiseca con membrana de nitrocelulosa, humedezca todos los componentes con un tampón de transferencia en frío.
   2. Configure el sándwich de transferencia: esponja, papel de filtro, gel, membrana, papel de filtro, esponja.
      NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas entre las capas. El programa de transferencia debe seleccionarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
4. Bloqueo e incubación de anticuerpos
   1. Bloquee la membrana en leche en polvo descremada al 5% o BSA en TBST durante 1 h a temperatura ambiente con un balanceo suave.
   2. Incubar la membrana con anticuerpo primario (anti-AChR) diluido en tampón de bloqueo al 2,5% durante la noche a 4 °C con un balanceo suave.
   3. Lave la membrana 3 veces durante 10 minutos cada una en TBST.
   4. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con HRP (IgG HRP) diluido en tampón de bloqueo al 2,5% durante 1 h a temperatura ambiente.
   5. Lave la membrana 3 veces durante 10 minutos cada una en TBST.
5. Detección e imagen
   1. Aplique el sustrato ECL a la membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Capture la señal quimioluminiscente mediante un sistema de imágenes.
   3. Analice las bandas mediante software de generación de imágenes.
      NOTA: Mantenga siempre las proteínas y los reactivos en hielo para evitar su degradación. Asegure una carga equitativa mediante la aplicación de una proteína de mantenimiento (por ejemplo, beta-actina, alfa-tubulina o GAPDH) como control. Optimice las concentraciones de anticuerpos y los tiempos de incubación para obtener los mejores resultados. Es crucial demostrar que la proteína AChR se expresa menos en los ratones inmunizados con MuSK.

7. ELISA casero Anti-MuSK IgG

1. Preparar el antígeno MuSK a una concentración de 0,5 μg por pocillo en 100 μL de tampón de bicarbonato y carbonato (recubrimiento de placas).
2. Dispense 100 μL de la solución de antígeno en cada pocillo de una placa de inmunoensayo.
3. Incubar la placa durante la noche a 4 °C.
4. Lave la placa con PBS que contenga 0,5% de Tween 20 (solución de lavado).
5. Incubar la placa con PBS que contenga un 5% de FBS (solución de bloqueo) durante 90 min a 4 °C para bloquear los sitios de unión inespecíficos (Blocking).
6. Dado que los estudios de optimización mostraron altos niveles de MuSK-IgG, diluya las muestras de suero 1/50.000 en una solución bloqueante.
7. Sin lavar después del bloqueo, agregue las muestras de suero diluido a los pocillos.
8. Incubar la placa a 37 °C durante 90 min.
9. Lave la placa tres veces con la solución de lavado.
10. Anticuerpo secundario IgG anti-ratón conjugado con HRP diluido (ab97023) 1/5000 en solución de bloqueo.
11. Agregue 100 μL del anticuerpo secundario diluido a cada pocillo.
12. Incubar la placa a 37 °C durante 90 min.
13. Lave la placa tres veces con la solución de lavado.
14. Añadir 100 μL de sustrato TMB a cada pocillo y observar el cambio de color.
15. Detenga la reacción en el momento adecuado utilizando 2 M H₂SO_4.
16. Mida la densidad óptica a 450 nm utilizando un espectrofotómetro.
17. Realice todas las muestras por duplicado y en la misma placa para mantener la consistencia.
    NOTA: Se deben utilizar valores de densidad óptica para el análisis, ya que no se dispone de diluciones de muestra estándar. No debe haber cambio de color en los pocillos de control negativo (en blanco). Se espera un cambio de color rápido, por lo que la solución de parada debe mantenerse cerca para detener inmediatamente la reacción en los pocillos.

Resultados

Al evaluar y validar el modelo experimental de miastenia gravis autoinmune (EAMG) de MuSK, varios parámetros clave y resultados experimentales son críticos para demostrar el éxito de la inducción y caracterización del modelo de enfermedad. A continuación se muestran los resultados representativos que confirman el establecimiento del modelo MuSK EAMG.

Puntuación clínica
Los ratones son monitoreados y evaluados para detectar síntomas clínicos de miastenia gravis utilizando un...

Discusión

Murine MuSK-EAMG imita al MuSK-MG humano tanto en sus aspectos clínicos como inmunopatogénicos en términos de debilidad muscular, pérdida de peso debido a la debilidad del músculo bulbar, anticuerpos circulantes anti-MuSK y reducción de la AChR muscular. En cuanto a los hitos y el cronograma anticipado para este modelo MuSK-EAMG, los signos clínicos de debilidad muscular deberían aparecer dentro de la primera semana después de la segunda inmunización. Aproximadamente el 5% de los ratones...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
125I-&alfa;-bungarotoxina	Invitrogen	BTX T1175
2-metilbutano	Sigma-Aldrich	M32631
40 μ m Filtro de células	NEST	258369
96 pocillos Placa de maxisorp	Sigma-Aldrich	M9410
Adyuvante incompleto	Becton Dickinson & Co.	263910
Anti-AChR alfa1	Alomone	ANC-001
Anti-ratón IgG HRP	Abcam	ab97023
Bullet Blender Storm	Next Advance		Homogeneizador de tejidos
C3	Novus	NB200-540G
Tampón de carbonato-bicarbonato	Merck	C3041
Cryostat	Leica	CM1860
Dinamómetro Imada DST-50N	Muromachi	MK380Si
Microscopio de fluorescencia	Leica	DM4M
Jeringa de vidrio con bloqueo luer	ISOLAB	094.92.005
IgG	Abcam	ab96871
Fotómetro de microplacas, Multiskan FC	Thermo Scientific	51119000
	Kent Scientific Corporación	INSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Becton Dickinson & Co.
de agar compuesto OCT	Scientific	AGR1180
, 1 ml	Becton Dickinson & Co.
Jeringas 309625, 2 mL	B. Braun	7389
Sujetador universal de animales	Merck	Z756911-1EA
WesternBright Kit de detección de transferencia	Advansta	K-12043-D10	ECL