Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

Resumen

Este artículo presenta un método para el monitoreo cuantitativo en tiempo real de las concentraciones de iones de calcio (Ca²⁺) en células utilizando imágenes de Ca²⁺ de una sola célula con el colorante Fura-2 / AM. Esta técnica permite una carga eficiente de colorante y un cálculo preciso de los niveles de Ca²⁺ a través de las relaciones de intensidad de fluorescencia, lo que la convierte en un enfoque simple y rápido para aplicaciones de investigación.

Resumen

Las imágenes de Ca²⁺ de una sola célula son esenciales para el estudio de los canales de Ca²⁺ activados por diversas estimulaciones como la temperatura, el voltaje, el compuesto nativo y los productos químicos, etc. Se basa principalmente en la tecnología de imágenes de microscopía y el indicador Ca²⁺ relacionado Fura-2/AM (AM es la abreviatura de acetoximetil éster). Dentro de las células, Fura-2/AM es hidrolizado por las esterasas en Fura-2, que puede unirse reversiblemente con el Ca²⁺ citoplasmático libre. La longitud de onda de excitación máxima cambia de 380 nm a 340 nm (cuando está saturada con Ca²⁺) al unirse. La intensidad de fluorescencia emitida está cuantitativamente relacionada con la concentración de Ca²⁺ unido. Al medir la relación 340/380, se puede determinar la concentración de Ca²⁺ en el citoplasma, eliminando los errores causados por las variaciones en la eficiencia de carga de la sonda fluorescente entre diferentes muestras. Esta tecnología permite el monitoreo en tiempo real, cuantitativo y simultáneo de los cambios de Ca²⁺ en múltiples celdas. Los resultados se almacenan en formato ". XLSX" para análisis posteriores, que es rápido y genera curvas de cambio intuitivas, mejorando en gran medida la eficiencia de detección. Desde diferentes perspectivas experimentales, en este artículo se enumera el uso de esta tecnología para detectar señales de Ca²⁺ en células con proteínas de canal endógenas o sobreexpresadas. Mientras tanto, también se mostraron y compararon diferentes métodos para activar las células. El objetivo es proporcionar a los lectores una comprensión más clara del uso y las aplicaciones de las imágenes de Ca²⁺ de una sola célula.

Introducción

El Ca²⁺ desempeña un papel crucial en la transducción de señales celulares, regulando diversas funciones celulares como la contracción muscular¹, la conducción nerviosa², la secreción³ y la expresión génica⁴, influyendo así en múltiples procesos fisiológicos. Las concentraciones anormales de Ca²⁺ pueden provocar enfermedades como arritmias⁵, trastornos de la coagulación⁶ y desequilibrios hormonales⁷. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos de los cambios en la concentración intracelular de^Ca2+ es de suma importancia.

Varios canales iónicos están involucrados en la regulación de la concentración de Ca²⁺ en las células, incluidos los canales⁸ de calcio activado por liberación de calcio (CRAC) altamente selectivos de Ca²⁺ y los canales catiónicos no selectivos de la familia TRP⁹. Estos canales iónicos pueden ser activados por estímulos como la temperatura¹⁰, los compuestos y los ingredientes activos que se encuentran en la medicina tradicional china¹¹, desempeñando un papel crucial en varios procesos fisiológicos relacionados con el Ca²⁺.

El control eficaz de los cambios en la concentración intracelular de^Ca2+ es esencial para estudiar los canales iónicos relacionados con el^Ca2+, especialmente en el campo de la medicina tradicional china, donde la regulación de la señalización del calcio desempeña un papel central en muchos enfoques terapéuticos. Actualmente, los principales métodos para medir el Ca²⁺ intracelular se pueden clasificar en dos tipos: mediciones eléctricas y ópticas. El enfoque de medición eléctrica utiliza la técnica de patch-clamp para evaluar los cambios en el potencial de la membrana celular debido a la afluencia de Ca^{2+ 12}.

En la medición óptica, las sondas fluorescentes se unen específicamente al Ca²⁺, lo que permite a los investigadores rastrear los cambios en la intensidad de la fluorescencia celular. Los métodos ópticos comunes incluyen técnicas basadas en proteínas fluorescentes y colorantes fluorescentes. En los métodos basados en proteínas fluorescentes, los investigadores pueden sobreexpresar proteínas fluorescentes sensibles al Ca²⁺ como Cameleon¹³ y GCaMP¹⁴ en las células y monitorear los cambios en la señal de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo para observar cambios en las concentraciones citoplasmáticas de Ca²⁺ . Además, los investigadores pueden sobreexpresar estas proteínas en ratones y utilizar la microscopía de fluorescencia de dos fotones para la monitorización en tiempo real in vivo o a nivel tisular de las concentraciones intracelulares de Ca²⁺ , proporcionando una alta resolución y una penetración^{profunda en los} tejidos.

Para los métodos basados en colorantes fluorescentes, las sondas Ca²⁺ comúnmente utilizadas incluyen Fluo-3/AM, Fluo-4/AM y Fura-2/AM¹⁰. Los investigadores incuban las células en una solución que contiene estas sondas fluorescentes, que atraviesan la membrana celular y son escindidas por las esterasas intracelulares para formar compuestos activos (por ejemplo, Fluo-3, Fluo-4 y Fura-2) que permanecen dentro de la célula. Estas sondas exhiben una fluorescencia mínima en su forma de ligando libre, pero emiten una fuerte fluorescencia cuando se unen al Ca²⁺ intracelular, lo que indica cambios en las concentraciones citoplasmáticas de Ca²⁺ . En comparación con otras proteínas y tintes fluorescentes, Fura-2 se excita normalmente a longitudes de onda de 340 nm y 380 nm. Cuando se une al Ca²⁺ libre intracelular, Fura-2 experimenta un cambio de absorción, moviendo el pico de la longitud de onda de excitación de 380 nm a 340 nm, mientras que el pico de emisión cerca de 510 nm permanece sin cambios. Existe una relación cuantitativa entre la intensidad de fluorescencia y la concentración de Ca²⁺ unida, lo que permite calcular la concentración intracelular de Ca²⁺ midiendo la relación de intensidad de fluorescencia en estas dos longitudes de onda de excitación. Las mediciones de la relación reducen los efectos del fotoblanqueo, la fuga de la sonda fluorescente, la carga desigual y las diferencias en el grosor de las células, lo que produce resultados más fiables y reproducibles (Figura 1).

Los sistemas de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula utilizan principalmente técnicas de microscopía y el indicador de Ca²⁺ Fura-2/AM para detectar concentraciones intracelulares de Ca²⁺ . Estos sistemas comprenden un microscopio de fluorescencia, una fuente de luz de imagen de Ca²⁺ y un software de imágenes de fluorescencia, que permite el monitoreo cuantitativo en tiempo real de los cambios de Ca²⁺ en el citoplasma de múltiples células simultáneamente (hasta 50 células por campo de visión). Los resultados se guardan en formato ".xlsx" para su posterior análisis. El sistema ofrece una velocidad de análisis rápida (aproximadamente 1 minuto para analizar un grupo de celdas dentro de un campo de visión) y genera curvas de cambio intuitivas, lo que mejora significativamente la eficiencia de la detección. La obtención de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula es un enfoque técnico esencial para estudiar los canales relacionados con el Ca²⁺ y tiene un valor considerable en la investigación biomédica relacionada con los canales iónicos. Se espera que su aplicación en la tecnología de imágenes de calcio de una sola célula avance en gran medida la investigación sobre los mecanismos subyacentes a la medicina tradicional china.

Protocolo

Los métodos experimentales fueron aprobados y siguieron las directrices de la IACUC de la Universidad de Tsinghua y la Universidad de Medicina China de Beijing. Este protocolo introduce métodos de imagen de Ca²⁺ de una sola célula para varios tipos de células, incluidos los queratinocitos primarios aislados de la piel de varios ratones recién nacidos (dentro de los tres días posteriores al nacimiento, con compañeros de camada aleatorios por sexo, ratones C57BL/6). Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la célula

NOTA: Las células primarias, las líneas celulares con genes diana endógenos o las transfectadas con plásmidos sobreexpresados son adecuadas para la obtención de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula. Los plásmidos utilizados en este estudio se obtuvieron del laboratorio del profesor Xiao Bailong en la Universidad de Tsinghua. Estos plásmidos se construyeron incorporando secuencias de proteína fluorescente GFP con STIM1 humano, proteína fluorescente DsRed con Orai1 humano, proteína fluorescente mRuby con TRPV1 de conejo, así como la proteína fluorescente roja mCherry en vectores de plásmidos de fagos¹⁰.

1. Prepare portaobjetos de vidrio estéril de 8 mm de diámetro en una placa de 24 pocillos. Agregue 500 μL de tampón de poli-D-lisina (PDL) (50 μg/mL en DPBS) a cada pocillo.
2. Incubar los portaobjetos a 37 °C durante 1 h para permitir el recubrimiento y, a continuación, desechar la solución de recubrimiento con una pipeta.
3. Lave los portaobjetos una vez con DPBS y déjelos a un lado para su uso posterior.
4. Cultivar células primarias y líneas celulares por separado de acuerdo con sus métodos de cultivo específicos¹⁰.
5. Las células de siembra se colocan en la placa preparada de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 1,5 x 10⁵ células por pocillo. Utilice las células para la obtención de imágenes de Ca²⁺ una vez que se hayan adherido al cubreobjetos.
6. En el caso de las células que sobreexpresan plásmidos, transfecte^10,15 el plásmido objetivo (1 μg/pocillo) utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (o Lipofectamine 3000) en una proporción de 1:1 e incube en una incubadora de cultivo celular durante unas 24 h.
   NOTA: Puede ser necesario un tiempo de incubación más largo para las proteínas expresadas más grandes.

2. Preparación de la solución de trabajo Fura-2/AM

1. Añadir 50 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a un tubo que contenga 50 μg de Fura-2/AM en polvo y mezclar bien para preparar una solución madre de 1 μg/μL de Fura-2/AM.
2. Mezcle la solución madre de Fura-2/AM y Pluronic F-127 en el tampón de Hank que contiene 1,3 mM de Ca²⁺.
   NOTA: La concentración final de Fura-2/AM y Pluronic F-127 en la solución de trabajo es de 2,5 μg/mL. El tampón de Hank se prepara añadiendo 10 mM HEPES a 1x tampón HBSS.
3. Utilice papel de aluminio para proteger la solución de trabajo Fura-2/AM de la luz.

3. Pretratamiento celular para imágenes de Ca²⁺ de una sola célula

1. Transfiera los portaobjetos de vidrio con celdas a una nueva placa de 24 pocillos que contenga tampón de Hank para lavar.
2. Deseche el tampón con una pipeta y añada 500 μL de tampón de trabajo Fura-2/AM a cada pocillo.
3. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos para permitir la carga de la sonda.
4. Retire el tampón de trabajo Fura-2/AM y lave las células tres veces con el tampón de Hank para eliminar el exceso de Fura-2/AM. Las celdas ya están listas para su uso.

4. Puesta en marcha del sistema de imágenes Ca²⁺

NOTA: En este estudio, se utiliza un microscopio de fluorescencia para la obtención de imágenes de Ca²⁺ .

1. Inicie los siguientes componentes en secuencia: luz DG4 (lámpara de xenón), cámara, fuente de luz blanca, controlador de etapa de microscopio, microscopio, computadora y software de imágenes de fluorescencia.
   NOTA: Si detecta la activación de canales iónicos por temperatura, encienda también los siguientes componentes: sistema de perfusión, sistema de calefacción, controlador de temperatura y dispositivo de calefacción / enfriamiento de circulación de líquido.

5. Procedimiento de respuesta celular Ca²⁺

1. Abra el software de imágenes de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).
   1. Elija Protocolo, luego seleccione Archivo, seguido de Protocolo de carga. Seleccione el protocolo y haga clic en Aceptar.
   2. Configure el experimento (en la lista de menús).
   3. Seleccione Nuevo experimento.
2. Monte la cámara de perfusión en el microscopio.
   NOTA: Siempre baje el objetivo por completo cuando monte o retire las cámaras usando la perilla de enfoque aproximado para evitar daños al objetivo.
3. Retire los portaobjetos de células tratadas con Fura-2/AM y colóquelos en la cámara que contiene el tampón de Hank.
4. Poner en marcha el sistema de perfusión.
5. Selecciona el objetivo DIC 20x y ajusta el enfoque bajo luz blanca.
6. Haga clic en Cfg Exp en la barra de tareas.
   1. Seleccione los fluor deseados para la obtención de imágenes.
   2. Determine la frecuencia de adquisición y la configuración de visualización en la pantalla (Adquisición: verifique 340, 380, GFP; Intervalo de adquisición: 1 s; Intervalo de guardado: 1 s).
7. Centro de atención
   1. En el panel de control del experimento, haga clic en el botón Enfoque .
   2. Ajuste el tiempo de adquisición (generalmente 100 ms) y la ganancia según sea necesario, luego "guarde para esta onda".
      NOTA: Para la luz ultravioleta, use la ganancia en lugar del tiempo de exposición.
   3. Elija la longitud de onda deseada para enfocar (por ejemplo, 380) y haga clic en Iniciar enfoque.
   4. Cambie la vista de los binoculares a la computadora.
   5. Asegúrese de que un tenue color verdoso sea visible a través de los binoculares.
   6. Concéntrese en las celdas, usando primero el enfoque aproximado para acercar el objetivo, luego el enfoque fino.
      NOTA: El microscopio emitirá un pitido si se acerca demasiado a la plataforma. Si esto sucede, baje el objetivo, vuelva a alinear la placa en el escenario y vuelva a enfocar. Minimice el tiempo dedicado a enfocar para reducir el daño celular inducido por el láser.
   7. Compruebe la intensidad de fluorescencia de las células durante el proceso de enfoque.
   8. Ajuste la intensidad de fluorescencia de las células modificando el tiempo de exposición y la ganancia.
      NOTA: El tiempo de exposición y la ganancia para 340 y 380 deben ser consistentes.
   9. Una vez que se logra un buen enfoque, presione el botón en el microscopio para cambiar la vista a la computadora.
   10. Vuelva a enfocar según sea necesario para obtener la imagen más nítida en la computadora, luego haga clic en Detener enfoque.
8. Procedimiento alternativo para encontrar células GFP positivas
   1. Utilice primero el procedimiento 340/380 para lograr un buen enfoque en las células.
   2. Seleccione FITC y luego haga clic en Comenzar a enfocar.
   3. Utilice el controlador de etapa para encontrar celdas positivas para GFP.
   4. Cambie la vista a la computadora y luego haga clic en Dejar de enfocar.
9. Selección de región
   1. Haga clic en el botón Región en la barra de menú.
   2. Seleccione el tipo de iluminación de su elección (340/380/FITC/TRITC). Los filtros FITC y TRITC se seleccionan para GFP y mCherry/DsRed/mRuby, respectivamente, para las células que sobreexpresan los plásmidos objetivo; de lo contrario, seleccione Fura-2.
      NOTA: Evite seleccionar células que estén en mal estado o muertas, como las que están obviamente redondeadas o tienen proteínas fluorescentes sobreexpuestas.
   3. Haga clic en Adquirir imágenes, luego en Aceptar.
   4. Aparecerá una nueva ventana; Seleccione las celdas haciendo clic en la herramienta Óvalo y luego haciendo clic sobre la celda.
   5. Seleccione las células deseadas bajo la fluorescencia transportada por la proteína objetivo (FITC o TRITC). Seleccione las células de control que no expresan la proteína objetivo en la condición de 380 nm.
   6. Para deshacer una región, haga clic con el botón derecho en el círculo y, a continuación, seleccione Eliminar región.
   7. Seleccione una muestra de fondo como última región y registre su número de identificación.
   8. Haga clic en Guardar y luego en Listo.
10. Sustracción de fondo
    1. Haga clic en el botón de menú Referencias.
    2. Indique el número de la región de fondo.
       NOTA: Si el fondo fue la última región seleccionada, al introducir un número muy alto se cambiará automáticamente a la última región seleccionada.
    3. Marque la casilla Restar referencias y luego haga clic en Aceptar.
11. Datos de registro
    1. Haga clic en el botón Registrar datos en el panel de control del experimento.
       NOTA: Las imágenes se guardan solo si existe el deseo de repetir el experimento más tarde; Normalmente, basta con marcar la casilla de datos.
    2. Asegúrese de que aparezca un mensaje solicitando el tipo de archivo de datos preferido; Seleccionar. Se recomienda el formato XLSX .
    3. Se abrirá una hoja de cálculo de tipo ".xlsx". Minimizar la hoja de trabajo evitará que ocupe espacio en la pantalla.
12. Adquisición de datos
    1. En la sección Lapso de tiempo del panel de control, establezca el intervalo de adquisición de datos en 1 s.
       NOTA: Esto se puede ajustar de acuerdo con las necesidades reales.
    2. Haga clic en Reloj cero y Adquirir en el panel de control del experimento para iniciar el experimento. Las líneas de base serán visibles en un gráfico que indica cada una de las regiones de celda seleccionadas.
    3. Realizar una serie de tratamientos sobre las células de acuerdo con los requerimientos experimentales.
    4. Para observar la respuesta a la temperatura de las células, caliente el tampón en el sistema de perfusión a una temperatura adecuada utilizando un controlador de temperatura.
    5. Para observar los efectos de los medicamentos en las células, perfunde o agrega manualmente un tampón que contenga medicamentos y registra los cambios celulares.
    6. Una vez completada la adquisición de datos, haga clic en Pausa.
       NOTA: La adquisición de datos se puede pausar y el reloj se puede reiniciar en cualquier momento durante el experimento.
    7. Guarde y analice los datos.
13. Haga clic en Archivo y Cerrar experimento para finalizar el experimento y seleccione No en el cuadro de diálogo para guardar el protocolo.
14. Abra un nuevo experimento haciendo clic en Nuevo en el menú y repita el proceso.
15. Apaga
    1. Cierre el software y transfiera los datos desde la computadora.
    2. Invierta el procedimiento de inicio.
    3. Registre las horas en la hoja de registro y limpie cualquier desorden.
16. Análisis de datos
    1. Represente la concentración intracelular de Ca²⁺ mediante la relación Fura-2 340/380 o conviértala a la concentración de Ca²⁺ correspondiente.

Resultados

Detección de respuesta a la temperatura
Queratinocitos primarios
Los queratinocitos primarios se aislaron de ratones recién nacidos y se prepararon de acuerdo con los protocolos establecidos¹⁰. Estas células se sembraron en placas de 24 pocillos que contenían portaobjetos de vidrio. Después de la carga de la sonda Fura-2, el enfoque se ajustó bajo el microscopio a una longitud de onda de 380 nm para lograr una visualización clara de la morfología celular, como se ilustra en la Figura 2A. Si la sonda no se cargó correctamente durante el proceso, las celdas no serían visibles. El tampón extracelular en la cámara se reemplazó continuamente a través de un sistema de perfusión, asegurando condiciones óptimas para las células. El sistema de control de temperatura se conectó al sistema de perfusión, lo que permitió la detección de respuestas térmicas celulares mediante el control de los cambios de temperatura en el tampón extracelular. Este proceso consistió en calentar gradualmente el tampón extracelular y luego enfriarlo gradualmente.

Se utilizó el sistema de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula para monitorear los cambios en la concentración intracelular de Ca²⁺ en diversas condiciones experimentales. Como se muestra en la Figura 2B, los queratinocitos mostraron una respuesta térmica distinta cuando se sometieron al calentamiento, así como una respuesta notable durante la fase de enfriamiento. Cabe destacar que esta respuesta a la temperatura desapareció cuando se eliminó el gen STIM1, que es el principal responsable de esta respuesta (Figura 2C)¹⁰. Las imágenes de Ca²⁺ de una sola célula permiten la observación de cambios en tiempo real en la concentración intracelular de Ca²⁺ en respuesta a diversos estímulos externos, lo que permite un análisis detallado del comportamiento y la señalización celular.

HEK293T células que sobreexpresan los plásmidos diana
HEK293T células se sembraron en una placa de 24 pocillos que contenía portaobjetos de vidrio de acuerdo con el método experimental. A continuación, las células se sobreexpresaron con STIM1/Orai1 y su respuesta térmica mediada se detectó utilizando el mismo método descrito anteriormente para las células primarias. En el caso de las células que sobreexpresaban el plásmido objetivo, el éxito de la transfección se confirmó seleccionando las células que expresaban el plásmido correspondiente, según lo indicado por las proteínas fluorescentes rojas o verdes transportadas por el plásmido en longitudes de onda TRITC o FITC. Para este experimento, se utilizaron plásmidos STIM1-GFP/Orai1-DsRed, con GFP detectado bajo FITC, emitiendo fluorescencia verde, y DsRed detectado bajo TRITC, emitiendo fluorescencia roja. Las células que sobreexpresan mCherry vacía (TRITC) se utilizaron como controles negativos. Como se muestra en la Figura 3A, las células fluorescentes observadas bajo FITC indicaron una expresión exitosa de STIM1, lo que permite la selección y el registro de su respuesta térmica durante los procesos de calentamiento y enfriamiento. Las células que no fueron transfectadas sirvieron como control negativo. La Figura 3B demuestra que STIM1/Orai1 exhibió una respuesta térmica significativa durante el proceso de enfriamiento, en contraste con el control negativo que se muestra en la Figura 3C.

Detección de la respuesta a fármacos
La tecnología de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula también se puede utilizar para detectar las respuestas celulares a los compuestos. La preparación de la celda para la detección de la respuesta térmica es la misma que la descrita anteriormente. La diferencia entre la respuesta farmacológica y la respuesta térmica radica en que la respuesta térmica suele requerir la activación de las células cambiando la temperatura del tampón extracelular a través de un sistema de perfusión, mientras que los compuestos pueden administrarse bien por perfusión o bien añadiéndolos directamente mediante una pipeta. La adición directa con una pipeta puede conservar eficazmente la cantidad de compuesto utilizado; Sin embargo, la curva resultante no siempre puede ser tan atractiva visualmente como la obtenida a través de la perfusión.

Tomando la Figura 4 como ejemplo, la Figura 4A muestra la respuesta de entrada de calcio operada por almacén (SOCE) de STIM1/Orai1, donde la concentración extracelular de Ca²⁺ y el contenido de ácido ciclopiazónico (CPA) se cambian secuencialmente a través de un sistema de perfusión para inducir SOCE. En la Figura 4B, el agonista de TRPV1 capsaicina se añade directamente mediante una pipeta a las células que sobreexpresan el plásmido TRPV1. La capsaicina puede activar TRPV1 e inducir la afluencia extracelular de Ca²⁺.

Figura 1: Diagrama esquemático de Fura-2 AM. Fura-2 es una sonda de fluorescencia de Ca²⁺ comúnmente utilizada en biología celular que se une selectivamente a Ca²⁺ en una proporción de 1:1 y emite fluorescencia. Debido a su naturaleza altamente polar como compuesto ácido, Fura-2 no puede entrar en las células. Para mejorar la permeabilidad celular, se conjuga con acetoximetilo (AM) en su grupo negativo para formar Fura-2/AM. Esta modificación aumenta su solubilidad en éster y elimina la carga negativa. Dentro de las células, Fura-2/AM es hidrolizado por las esterasas en Fura-2, que puede unirse reversiblemente con el Ca²⁺ citoplasmático libre. Al unirse, la longitud de onda de excitación máxima cambia de 380 nm a 340 nm (cuando está saturada con Ca²⁺). La intensidad de fluorescencia emitida está cuantitativamente relacionada con la concentración de Ca²⁺ unido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Detección de respuesta a la temperatura de queratinocitos primarios. (A) Tinción de Fura-2 de queratinocitos de ratones recién nacidos, observada bajo una lente de objetivo de 20x. (B,C) Respuesta a la temperatura de los queratinocitos WT (B) y los queratinocitos knockout STIM1 (C) mediante un sistema de imagen Ca²⁺ unicelular. Ampliación: 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Detección de respuesta a la temperatura de STIM1-GFP/Orai1-Dsred sobreexpresada en células HEK293T. (A) Una figura representativa que muestre células positivas que expresan STIM1-GFP según FITC. (B,C) Respuesta a la temperatura de las células HEK293T que expresan el plásmido respectivo detectado por un sistema de imágenes Ca²⁺ de una sola célula. Ampliación: 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Detección de la respuesta a fármacos mediante imágenes de Ca²⁺ de una sola célula. (A) Respuesta SOCE de las células HEK293T que sobreexpresan STIM1/Orai1. El tampón extracelular se cambia de Ca²⁺ a Ca²⁺ libre mediante un sistema de perfusión. En ausencia de Ca²⁺, se añade CPA para agotar el Ca²⁺ del retículo endoplásmico. A continuación, el tampón extracelular se sustituye por un tampón que contiene Ca²⁺ para inducir la afluencia extracelular de Ca²⁺ , lo que representa la entrada de Ca²⁺ operada por la tienda. Las imágenes de Ca²⁺ de una sola célula se utilizan para registrar dinámicamente los cambios en la concentración citosólica de Ca²⁺ inducidos por estos procesos. (B) células HEK293T que sobreexpresan TRPV1-mRuby, donde mRuby es una proteína fluorescente utilizada para comprobar la condición de transfección de la proteína TRPV1. La capsaicina se añade mediante una pipeta, mientras que la afluencia de Ca²⁺ se registra mediante imágenes de Ca²⁺ de una sola célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La aplicación de los sistemas de imagen de Ca²⁺ de una sola célula es extensa, lo que permite el estudio de las señales de Ca²⁺ en varios tipos de células, incluidos queratinocitos, células madre¹⁶, células hepáticas, células cardíacas¹⁷, podocitos¹⁸, células inmunitarias y líneas celulares que sobreexpresan proteínas diana^10,19. Esta técnica mide los cambios y los valores absolutos de las concentraciones celulares de Ca²⁺ y desempeña un papel crucial en la investigación de los canales iónicos relacionados con el Ca²⁺, lo que la convierte en uno de los instrumentos esenciales en los laboratorios de investigación de canales iónicos.

A medida que avanza la investigación, la importancia de los canales iónicos relacionados con la señal de Ca²⁺ ha ganado cada vez más reconocimiento entre los investigadores de la medicina tradicional china. Su objetivo es decodificar los problemas centrales de la medicina tradicional china a través de la lente de los canales iónicos. Por ejemplo, las propiedades frías y calientes de la medicina china informan el principio de "tratar el calor con frío y tratar el frío con calor". Muchos canales iónicos sensibles a la temperatura que median las señales de Ca²⁺ están estrechamente relacionados con este principio. Además, numerosos medicamentos chinos ejercen efectos terapéuticos a través de acciones antiinflamatorias, con múltiples canales iónicos relacionados con el Ca²⁺ que desempeñan un papel importante en la regulación de la inflamación²⁰.

Es esencial estudiar los efectos de componentes importantes de la medicina tradicional china sobre las características de los canales iónicos para revelar las propiedades farmacológicas de estos medicamentos a nivel molecular. Actualmente, los investigadores de la medicina tradicional china se centran principalmente en detectar la expresión de canales iónicos relevantes. Sin embargo, todavía hay un seguimiento relativamente limitado en tiempo real de los efectos de la medicina tradicional china sobre los canales iónicos relacionados con el^Ca2+, y muchos mecanismos subyacentes siguen sin estar claros.

Este grupo de investigación se ha dedicado a la investigación de canales iónicos relacionados con Ca²⁺, como STIM1 / Orai1, STIM1 / Orai3, TRPA1¹⁰ y TRPV1, y está bien versado en la aplicación y el uso detallado de sistemas de imágenes de Ca²⁺ de una sola celda. Este estudio demuestra el uso específico de las imágenes de Ca²⁺ de una sola célula para diferentes fines de investigación, con el objetivo de proporcionar a los lectores una comprensión completa de sus amplias aplicaciones y su uso detallado. En comparación con los estudios relacionados publicados anteriormente²¹, esta investigación ofrece una nueva perspectiva y metodología para la aplicación de imágenes de Ca²⁺ unicelular desde varios ángulos y en conjunto con otros sistemas. Por ejemplo, las células primarias o las líneas celulares con expresión endógena de genes diana pueden cargarse directamente con la sonda Fura-2 para monitorizar los cambios en las señales intracelulares de^Ca-2+ en tiempo real bajo diversos factores estimulantes utilizando el sistema de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula. Además, se puede realizar una sobreexpresión de plásmidos que contienen proteínas fluorescentes en líneas celulares. Inicialmente, las celdas se cargan con la sonda Fura-2, como se describió anteriormente. A continuación, se seleccionan las células con una expresión exitosa de la proteína diana en función de las señales FITC o TRITC, que luego se resaltan para el posterior seguimiento en tiempo real de las señales de Fura-2 Ca²⁺ .

La imagen de Ca²⁺ de una sola célula es un sistema de detección que se puede integrar con varias otras configuraciones experimentales de acuerdo con los objetivos experimentales. Por ejemplo, si es necesario detectar la respuesta de los canales iónicos sensibles a la temperatura a los cambios de temperatura, el sistema se puede combinar con un sistema de operación de control de temperatura y un dispositivo de perfusión para monitorear simultáneamente los cambios en las señales intracelulares de Ca²⁺ controlando la temperatura de la solución tampón extracelular¹⁹. Este enfoque confirma la respuesta de los canales iónicos relevantes a la temperatura. Además, las imágenes de Ca²⁺ de una sola célula también se pueden combinar con dispositivos de administración de fármacos relevantes u otros dispositivos de estimulación celular para experimentos relacionados.

De hecho, el sistema de imagen Ca²⁺ de una sola célula no solo permite la monitorización en tiempo real de la relación 340/380, sino también los valores de FITC o TRITC a través de ajustes específicos. Además, la tecnología de imágenes de calcio unicelular es aplicable para detectar cambios en la concentración de iones de calcio no solo en el citoplasma sino también en el retículo endoplásmico (RE), lo que demuestra sus amplias aplicaciones¹⁹. Los datos obtenidos por este sistema se guardan uniformemente en un formato ".xlsx", que se puede analizar rápidamente para obtener resultados. La curva de cambio facilita una rápida comprensión del estado de activación y las características de las células, estableciendo un conveniente sistema de monitoreo de señal de Ca²⁺ . Se anticipa que este informe de investigación promoverá de manera efectiva la aplicación generalizada del sistema de imágenes de Ca²⁺ de una sola célula en el campo de la investigación de la medicina tradicional china y contribuirá a decodificar la medicina tradicional china.

Sin embargo, la aplicación de la tecnología de imágenes de calcio de una sola célula tiene ciertas limitaciones, como la incapacidad de lograr un cribado de alto rendimiento. Por ejemplo, en algunos experimentos, cuando es necesario detectar agonistas o antagonistas de un canal específico, las imágenes de calcio requieren un cribado uno por uno, lo que lleva mucho tiempo. En tales casos, puede ser necesario combinar esta técnica con otras tecnologías, como FLIPR²², para realizar un cribado de alto rendimiento antes de seguir validando los resultados con imágenes de calcio de una sola célula. Además, las imágenes obtenidas a partir de imágenes de calcio unicelular se generan a partir de microscopía de fluorescencia convencional, que tiene una resolución más baja en comparación con la microscopía confocal¹⁵. Por lo tanto, la combinación efectiva de la tecnología de imágenes de calcio de una sola célula con otras técnicas para aprovechar sus respectivas ventajas es un enfoque importante para abordar los desafíos en este campo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cámara	Nikon
Capsaicine	Sigma 211275
CL-100 controlador de temperatura	Warner Instruments
Ácido ciclopiazónico (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 luz	Sutter Instrument Company
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Software de imágenes de fluorescencia (MetaFluor, software de pago)	Dispositivos
moleculares Microscopio de fluorescencia	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
Tampón HBSS	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamina 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lisina	Beyotime	ST508
SC-20 dispositivo de calefacción / enfriamiento de circulación de líquidos	Aparato de Harvard Fuente
de luz blanca	Nikon