Artículo de método

Formulación de Nanomateriales a Base de Zinc utilizando el Extracto de Corteza de Eucommia ulmoides y su Potencial Cicatrizante de Heridas

DOI:

10.3791/67416

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27 de diciembre de 2024

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1Biological Experiment Center, School of Life Sciences, Central South University, 2Department of Cell Biology, School of Life Sciences, Central South University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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En este trabajo se presenta un protocolo para sintetizar las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO) utilizando el extracto acuoso rico en poliisopreno obtenido de la corteza del árbol Eucommia ulmoides . El potencial de cicatrización de heridas exhibido por las nanopartículas de ZnO sintetizadas en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se evaluó mediante un ensayo de rasguño, un método simple, rentable y eficiente.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El extracto acuoso de la corteza de Eucommia ulmoides es una rica fuente de compuestos bioactivos con numerosos beneficios para la salud. El protocolo aquí tiene como objetivo explorar la preparación de nanopartículas de óxido de zinc (ZnO) utilizando el extracto acuoso rico en poliisopreno mediado por corteza de Eucommia ulmoides . Por su parte, el protocolo propuesto se asocia a la preparación de material cicatrizante de heridas facilitando el proceso. Además, se evaluó el potencial de cicatrización de las nanopartículas sintetizadas (Eu-ZnO-NPs) mediante un simple ensayo de rasguño en una monocapa de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Después de 24 h de tratamiento con Eu-ZnO-NPs, se evaluó la proliferación celular y la migración de las células HUVEC. Al final del estudio, se observó proliferación y migración celular en monocapa rayada tratada con diferentes concentraciones de Eu-ZnO-NPs, mientras que en las células de control se observaron tasas pobres de migración y proliferación celular. De las concentraciones elegidas, 20 μg/mL de nanomateriales de Eu-ZnO mostraron una mejor migración celular y un mayor potencial de cicatrización de heridas.

Introducción

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Se ha demostrado que las plantas medicinales y los compuestos derivados de plantas presentan numerosos beneficios para la salud1. La Organización Mundial de la Salud (OMS) informó que el 80% de la población mundial depende de las plantas medicinales tradicionales para la atención primaria de la salud. China es muy reconocida y popular por sus prácticas de Medicina Tradicional China (MTC). Se ha informado que las hierbas medicinales chinas tratan diversas enfermedades y se utilizan por su potencial biológico. Las plantas medicinales sirven como reservorios de compuestos bioactivos y múltiples funciones terapéuticas. También se han utilizado plantas medicinales para tratar las heridas. Existen varios tipos de abordajes aplicados para tratar las heridas crónicas2. Una investigación reciente reveló que las plantas medicinales estaban involucradas en el proceso de cicatrización de heridas, proporcionando condiciones favorables para la cicatrización, libres de infecciones, y fijando la regeneración de los tejidos3. Mientras tanto, las propiedades antibacterianas y antifúngicas de los compuestos bioactivos presentes en las plantas medicinales pueden ayudar a curar heridas y acelerar la eficiencia de la cicatrizaciónde heridas.

Los nanomateriales basados en metales están ganando atención debido a sus propiedades biocompatibles y biodegradables. Eucommia ulmoides, comúnmente llamado árbol de caucho chino, es una especie nativa de China. Las hojas y la corteza del árbol se utilizan en prácticas medicinales. Lo más importante es que la especie de planta se cultivó en las provincias centrales y occidentales de China5. Peng et al.6informaron que las hojas, cortezas y flores estaminadas eran comestibles con potencial terapéutico. Además, E. ulmoides es la mejor fuente de lignanos, fenilpropanoides, iridoides, flavonoides, aminoácidos y oligoelementos. Además, la corteza se ha utilizado para diversas aplicaciones biomédicas, como el control de la presión arterial, la reducción de la grasa y la promoción de la antiosteroporosis y la actividad hipoglucémica7. De ahí que, sin duda, se haya comprobado que el extracto de corteza de E. ulmoides tiene una larga historia en la medicina tradicional china. Informes anteriores sugirieron que el poliisopreno polimérico natural es rico en las cortezas de Eucommia ulmoides8. Con base en la información anterior, el presente trabajo tiene como objetivo fabricar nanomateriales utilizando extractos de corteza de Eucommia ulmoides . La combinación de zinc con extracto de corteza es una opción atractiva para la preparación de nanomateriales. En general, el objetivo final de la presente investigación fue fabricar un nuevo nanomaterial híbrido para aplicaciones de cicatrización de heridas.

Protocolo

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NOTA: Antes de preparar el extracto, el material de corteza obtenido se lavó dos veces con agua desionizada y se secó en un lugar sombreado. Las cortezas secadas a la sombra se almacenaron en un recipiente hermético.

1. Preparación del extracto de corteza de Eucommia ulmoides.

  1. Picar la corteza recogida del árbol Eucommia ulmoides en trozos pequeños con unas tijeras.
  2. Lave los materiales de corteza picados dos veces con agua destilada doble.
  3. Secar los trozos de corteza a menos de 37 °C durante 24 h en condiciones de sombra.
    1. Ajuste la duración del proceso de secado en función de la cantidad de corteza utilizada para el estudio. Asegúrese de que las cortezas estén completamente secas antes de cortarlas en trozos pequeños. Evite la luz solar directa.
  4. Transferir 20 g de cortezas secadas a la sombra a un matraz cónico que contenga 220 ml de agua bidestilada estéril y calentar a 130 °C durante 20 min.
    1. El color de la solución de reacción cambia a amarillo claro. Los cambios en el color de la solución ocurren después de 10 min. Deje que la solución se caliente durante otros 10 minutos. Ajuste el volumen de agua destilada doble en función de la cantidad de muestra.
  5. Almacene el extracto crudo que contiene poliisopreno a 4 °C para su uso posterior. La formación de una estructura filiforme indica la presencia de poliisopreno en los extractos.

2. Biosíntesis de nanopartículas de ZnO mediadas por la corteza de E. ulmoides

  1. Añadir 1 M de nitrato de zinc dihidratado Zn (NO3)2 a 50 mL de agua desionizada en un matraz cónico de 500 mL. Revuelva continuamente con agitación magnética (60 RPM). El Zn (NO3)2 tarda 30 minutos en disolverse por completo.
  2. Añadir 15 mL de extracto de corteza de E. ulmoides gota a gota a 20 mL de solución 1 M de nitrato de zinc dihidratado (Zn (NO3)2).
  3. Coloque la mezcla de reacción cubierta en un agitador magnético, encienda el agitador y gire a (60 RPM) durante 3 h.
  4. Agregue 1 solución de hidróxido de sodio NaOH (3 mL) gota a gota a la mezcla de reacción para ajustar el pH a 9. Agregue NaOH hasta que la mezcla de la solución se vuelva de color blanco lechoso y el pH no sea superior a 9. La solución adquiere un color blanco lechoso cuando se forman nanopartículas de ZnO.
    1. La preparación de 1 M de volumen de solución de nitrato de zinc dihidratado Zn (NO3)2 puede variar en función de las necesidades experimentales. Asegúrate de usar los extractos de corteza recién preparados. Si el pH supera 10, se producirá la agregación de nanopartículas.
  5. Transfiera las Eu-ZnO-NP sintetizadas a un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifuérelo a 100 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: Las impurezas se pueden evitar mediante un lavado inmediato.
  6. Recoja los Eu-ZnO-NPs lavados en una placa de vidrio y séquelos a 45-50 °C durante 1 h en un horno de aire caliente.
    NOTA: Si las Eu-ZnO-NPs se mantienen durante más de 30 min pueden afectar a la naturaleza fisicoquímica de las nanopartículas

3. Confirmación de tamaño mediante TEM

  1. Prepare 1 mg/mL de nanopartículas en DDH2O y cargue 5 μL de muestra de Eu-ZnO-NP en la rejilla de cobre y espere hasta que se seque por completo. Agite la muestra antes de cargarla en la rejilla de cobre.
  2. Cargue la rejilla de cobre que contiene Eu-ZnO-NPs en el portamuestras TEM y adquiera imágenes con aumentos de 50x y 100x.
    NOTA: Las rejillas deben recogerse con pinzas durante este paso.

4. Evaluación de la citotoxicidad

  1. Siembre 1 × 104 HUVECs en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y colóquelo en una incubadora de 5% de CO2 a 37 °C.
  2. Añadir 10 μL de varias concentraciones 0, 10, 20, 30, 40 y 50 μg/mL de Eu-ZnO-NPs en las células confluentes al 90% e incubar durante 24 h.
  3. Después de la incubación, retire el medio viejo sin alterar las células, agregue 10 μL de solución CCK-8 a cada pocillo que contenga 90 μL de medio DMEM fresco e incube en una incubadora de 5% de CO2, 37 °C.
  4. Mida la absorbancia de las células tratadas con solución de CCK8 a 450 nm utilizando un espectrofotómetro.
    NOTA: La absorbancia se midió inmediatamente dentro de los 15 minutos para evitar los cambios en la absorbancia.

5. Preparación de células HUVEC para el ensayo de arañazos

  1. Siembre una cantidad adecuada (1 × 105) de HUVECs en placas de cultivo de 12 pocillos que contengan medio Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de estreptococo en pluma e incube en una incubadora con 5% de CO2 a 37 °C.
    1. Antes de realizar el ensayo de arañazo, compruebe la confluencia con el microscopio invertido.
      NOTA: Para realizar el ensayo de rayado, se utilizarán placas de 6 pocillos o 12 placas según los requisitos, y la densidad celular variará para diferentes placas de cultivo. El uso de 70%-80% de células confluentes es ideal y se recomienda para el ensayo de rasguño. El volumen del medio DMEM puede variar en función de las placas de cultivo utilizadas en el estudio. Por ejemplo, las placas de 6 pocillos requieren 1-1,5 mL de medio de cultivo, y las placas de 12 pocillos requieren 0,5-1,0 mL de medio de crecimiento.
  2. Rasque suavemente con una punta de pipeta estéril de 200 μL en la herida representativa con una anchura de herida de 200 μm.
  3. Asegúrese de que la punta utilizada para hacer arañazos en la monocapa de la célula entre en contacto con la superficie de las células.
    NOTA: Cada vez que se haga un rasguño, use la punta estéril.
  4. Retire el medio completo y lave la monocapa HUVEC con 1 mL de 1x PBS para eliminar las células desprendidas.
    NOTA: Asegúrese de que las celdas monocapa separadas se eliminen por completo de los pocillos respectivos. Confirme que no se haya producido ningún daño en el área creada por la herida.
  5. Para evaluar el potencial de cicatrización de heridas de Eu-ZnO-NPs sintetizadas, agregue concentraciones de 0 (Control), 10 y 20 μg/mL de nanopartículas de Eu-ZnO combinadas con un medio completo con 10% de FBS en los pocillos. Mantener las placas experimentales a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 .
    NOTA: No moleste la monocapa de celda mientras agrega el medio fresco y completo. Asegúrese de que las células monocapa permanezcan inalteradas durante la incubación.
  6. Adquisición de microfotografía a las 0 h y a las 24 h con un microscopio invertido. Utilice la herramienta de anotación para medir el cierre de la herida en diferentes intervalos de tiempo.
    1. Calcule el porcentaje de cierre de la herida utilizando la siguiente fórmula: Cierre de la herida (%) = [(migración celular (en μm) a 0 h - migración celular (en μm) a 24 h)/ migración celular (en μm) a 0 h] x 100.

Resultados

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La presente investigación tiene como objetivo sintetizar nanopartículas utilizando las cortezas del árbol Eucommia ulmoides . El material de la corteza se secó completamente en un ambiente sombreado (Figura 1). Los materiales de corteza se utilizaron para preparar el extracto crudo acuoso de agua caliente calentando las muestras a 130 °C durante 20 min. Una ligera alteración en la temperatura y la duración puede alterar los fitocompuestos y hacerlos inadecuados para preparar el extracto acuoso. Los extractos acuosos de corteza cruda de E. ulmoides se prepararon y utilizaron para la síntesis de nanopartículas (Figura 2). El extracto preparado se puede utilizar de inmediato. El extracto almacenado durante un período prolongado puede influir en el proceso de síntesis. Por lo tanto, se recomienda un extracto recién preparado para la preparación de nanopartículas.

La síntesis exitosa de NPs de ZnO mediadas por extracto crudo de corteza fue confirmada por la aparición de un color blanco lechoso y un cambio en el pH (Figura 3). El pH está estrechamente relacionado con el tamaño de las nanopartículas, y un pH superior a 9 da como resultado una aglomeración y un tamaño desigual. La estructura del nanomaterial sintetizado se confirmó mediante análisis TEM, y las nanopartículas sintetizadas mostraron un tamaño de partícula de 80-90 nm, como se representa en la Figura 4. El NaOH debe añadirse gota a gota para evitar un cambio brusco en la mezcla de reacción. Las nanoformulaciones a base de metales son adecuadas, baratas y menos tóxicas. Sin embargo, los nanomateriales basados en metales son bien conocidos por sus funciones biológicas.

La citotoxicidad de Eu-ZnO-NPs frente a células HUVECs se determinó mediante el ensayo CCK-8 con la exposición de diferentes concentraciones de Eu-ZnO-NPs durante 24 h. Los resultados indicaron que las Eu-ZnO-NPs no mostraron cambios notables en la citotoxicidad de las células HUVECs a la concentración más alta de 50 μg/mL (Figura 5). Se cargó la cantidad adecuada de células y se realizó un tamaño uniforme de las heridas con una punta de pipeta estéril de 200 μL. El volumen celular que excede el límite puede causar un cambio en el pH y una tasa de proliferación más lenta. Las migraciones de células y el cierre de la herida se observaron en el grupo de tratamiento después de 24 h de tratamiento, mientras que no se observaron cambios similares en el control. Los resultados de la actividad de cicatrización de heridas revelaron que las Eu-ZnO-NPs sintetizadas mostraron propiedades cicatrizantes en las líneas celulares de HUVECs. Una concentración de 20 μg/mL de nanomateriales de Eu-ZnO promueve una migración celular más rápida y mejores propiedades de cicatrización de heridas. Y lo que es más importante, las nanopartículas de Eu-ZnO sintetizadas mostraron un modo de acción dependiente de la concentración. Además, después de 24 h de tratamiento, se observó proliferación y migración celular en la monocapa rayada y, mientras que la tasa de migración y proliferación celular pobre se observó en las células control (Figura 6). El porcentaje de cierre de la herida se observó en un 16% para el control, seguido del 51% para los grupos tratados de 10 μg/mL y del 81,5% para los grupos tratados con 20 μg/mL después de 24 h (Figura 7).

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Figura 1: Colección de trozos de corteza de Eucommia ulmoides . Imagen de la corteza de Eucommia ulmoides utilizada para preparar el extracto acuoso de agua caliente. Antes de la extracción, las cortezas deben lavarse a fondo para eliminar las impurezas y secarse completamente a la sombra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Preparación del extracto de corteza de Eucommia ulmoides : Imagen de los extractos de corteza de Eucommia ulmoides utilizados para sintetizar las nanopartículas. El extracto de corteza de Eucommia ulmoides de 200 mL se preparó utilizando 20 g de trozos de corteza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Síntesis de nanopartículas de ZnO mediadas por la corteza de Eucommia ulmoides . La imagen muestra la formación de nanopartículas de Eu-ZnO y la solución de color blanco lechoso representa la formación de nanopartículas de Eu-ZnO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis de microscopía electrónica de transmisión: La imagen muestra diferentes aumentos de nanopartículas de ZnO mediadas por corteza de Eucommia ulmoides (A) con un aumento de 100 nm y (B) con un aumento de 50 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Ensayo de viabilidad celular CCK-8. Los gráficos de barras representan la viabilidad de las células después de ser tratadas con diferentes concentraciones de 0-50 μg/mL, mientras que las células sin tratamiento sirven como control negativo. Los datos representan la media y la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Ensayo de arañazo para la evaluación del cierre de heridas. Las células se trataron con NPs de EU-ZnO sintetizadas (10 μg/mL y 20 μg/mL) y sin NPs de EU-ZnO (grupo control) y se incubaron durante 24 h. Se observó proliferación y migración celular en las células tratadas con NPs de ZnO EU. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Porcentaje de cierre de heridas. Los gráficos de barras representan el porcentaje de cierre de la herida en la monocapa HUVEC con y sin tratamiento con NP de ZnO UE a las 0 h y a las 24 h. Los datos representan la media y la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Se cree que la corteza, la semilla y las hojas de E. ulmoides exhiben numerosos beneficios para la salud. Nuestros resultados han demostrado que la síntesis de nanopartículas de ZnO de EU-se logró utilizando un enfoque sencillo y rentable. El extracto acuoso se utilizó para sintetizar las nanopartículas. El calentamiento del material de la corteza a altas temperaturas puede causar la degradación de algunos fitoconstituyentes y disminuir la eficiencia de extracción. Los fitoconstituyentes presentes en el extracto acuoso de hierbas pueden reducir los iones metálicos para formar nanopartículas. El nitrato de zinc dihidratado se utiliza para la preparación de nanopartículas de ZnO por sus propiedades biocompatibles y altamente estables9. El uso de elementos metálicos causantes de toxicidad mínima a alta para sintetizar o diseñar los nanomateriales es arriesgado y no se puede utilizar para declaraciones biomédicas. Esta síntesis se puede realizar en un día (24 h). Sin embargo, los metales libres de tóxicos y los materiales biocompatibles se consideran seguros y se utilizan para evaluar la eficacia de la cicatrización de heridas. La razón principal detrás de la aglomeración de nanopartículas sintetizadas son los enlaces fitoquímicos. La aglomeración de nanopartículas se debió a la naturaleza atractiva de las interacciones de Van der Waal y a las fuerzas de atracción entre la superficie10,11. La aglomeración de nanopartículas puede influir en las propiedades físicas y ópticas. El tamaño y la forma de las nanopartículas pueden modificarse mediante calcinación y recocido12. La resuspensión de nanomateriales en agua desionizada y la sonicación pueden ayudar a evitar la aglomeración de nanopartículas. Es probable que la presencia de compuestos bioactivos o grupos funcionales en el extracto acuoso intervenga en el proceso de reducción. El rendimiento de nanopartículas depende únicamente del volumen de la mezcla de reacción utilizada para el proceso de síntesis. La síntesis de nanopartículas a gran escala tiene varias limitaciones, incluida la aglomeración y el tamaño de partícula no uniforme.

De manera similar a nuestros hallazgos, Aydin Acar et al.13 informaron que las nanopartículas de ZnO mediadas por extracto de flor de Calendula officinalis exhibieron propiedades cicatrizantes en células L929 con un cierre de herida del 69,1%. Además, las nanopartículas de ZnO mediadas por hojas de Crotalaria verrucosa mostraron potencial de cicatrización de heridas a una concentración de 5 μg/mL en líneas celulares HeLA con un cierre de heridas del 40,45%14. Zhang et al.15informaron que las nanopartículas de ZnO sintetizadas con Euphorbia fischeriana mostraron propiedades cicatrizantes significativas a concentraciones de 10 y 15 μg/mL. Estos estudios han demostrado que la nanoformulación sintetizada podría utilizarse como agente cicatrizante de heridas. Los resultados de la investigación de estos estudios mostraron que los compuestos sintetizados pueden reparar la herida y ayudar en la reepitelización en los grupos de tratamiento.

La hemostasia y la migración celular se consideran procesos importantes en la cicatrización de heridas. El rasguño creado en la monocapa de HUVEC se hizo utilizando puntas de pipeta para imitar heridas artificiales. Además, crear heridas con los mismos anchos es bastante complicado y complicado. Por otro lado, este es un método menos costoso. En este ensayo, se observó que las nanopartículas diseñadas mostraron excelentes propiedades de cicatrización de heridas en los HUVEC a concentraciones de 10-20 μg/mL en comparación con el control. Además, las Eu-ZnO-NPs sintetizadas tienen la potencia de reparar la herida creada en la monocapa celular sin causar ningún efecto tóxico. Estos experimentos in vitro podrían utilizarse para identificar la eficacia de los nanomateriales sintetizados basados en polímeros utilizando modelos animales.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer sinceramente al Departamento de Biología Celular de la Universidad Central del Sur, Changsha, China, por proporcionar las instalaciones de instrumentación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 12 pocillosNEST703011Se utiliza para el cultivo y el ensayo
celular CentrífugaSCILOGEXSC1406Se utiliza para separar las nanopartículas de la mezcla coloidal
Tubo de centrífuga – 15 mLBIOFILCFT-312150Para centrifugar la solución sintetizada 
Tubo de centrífuga – 5 mLBiosharp BS-50-CM-SPara almacenar las nanopartículas
CO2incubadora Thermo scientific3010Para cultivar las células HUVEC
Agua sin ruidoMilliporeNo aplicable Para la preparación del extracto 
Medio DMEMCytivaSH30243.01Utilizado para el trabajo de cultivo celular
EmbudoTermo científico42600060 Para sujetar el papel de filtro durante la filtración
Vasos de precipitados de vidrioBorosilicato 1102-50Se utiliza para preparar el extracto acuoso
Horno de aire caliente Frecuenciasno aplicables Se utiliza para secar las nanopartículas y recogerlas en forma de polvo
Agitador magnéticoKYLIN-BELLGL-5250-AUtilizado para la síntesis de nanopartículas
MicroscopioNikon EclipseTs2Utilizado para tomar microfotografías 
Placa de PetriNEST 753001Se utiliza para recoger las nanopartículas 
Pipeta 1 mLLab Science YEA17AD0055580Para tomar/añadir el volumen específico de solución/extracto
Puntas de pipeta 1 mLSAINING 3014200-TPara tomar/agregar el volumen específico de solución/extraer
Mezclador magnético de PTFE Barras de agitación LANRANNo aplicable Se utiliza para el proceso de síntesis de nanomateriales
Hidróxido de sodioSigma Alrich71690Se utiliza para ajustar el pH durante la síntesis
Tijera de acero inoxidableDeli6034Se utiliza para picar los materiales de la corteza
Matraz de cultivo de tejidos T25NEST707001Se utiliza para mantener las células 
Balanza de pesaje Radwag AS220R2Se utiliza para pesar los productos químicos 
Papel de filtro Whatman No.1NewstarGB/T1914-2017Se utiliza para filtrar el extracto para la síntesis
Nitrato de zinc Sigma Alrich13778-30-8Utilizado como precursor de la nanopartícula' S síntesis

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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