Se presenta un protocolo para la instalación y preparación de electrodos intramusculares, junto con un dispositivo de medición miniaturizado montable en animales para el análisis de electromiografía (EMG) en estudios de locomoción. Este sistema permite la transmisión inalámbrica de datos EMG en tiempo real para investigar la recuperación de la locomoción en ratas modelo de accidente cerebrovascular.
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Artículo de método
Un sistema de medición de electromiografía portátil en tiempo real para animales pequeños
En este artículo
Resumen
Resumen
El método de medición de electromiografía intramuscular (EMG) para animales de experimentación se ha implementado de varias maneras. Entre estos métodos, la conexión de cables a dispositivos de medición externos puede restringir el movimiento de los animales de experimentación, mientras que los dispositivos implantables pueden causar efectos secundarios no deseados debido a la presencia constante de un dispositivo con un tamaño y peso considerables. Para abordar estos problemas, proponemos un sistema de medición de EMG de bajo costo, inalámbrico y desmontable y un procedimiento experimental. Este artículo se centra en la instalación quirúrgica de electrodos de alambre intramuscular con conectores pequeños y el desarrollo del sistema inalámbrico. Cabe destacar que en este sistema, solo los electrodos de alambre se insertan en el cuerpo del animal. Con este sistema, las mediciones de EMG se pueden realizar fácilmente conectando el sistema de circuito a un conector instalado en la espalda del animal, con un monitoreo en tiempo real que se puede lograr en una computadora portátil. El método propuesto se explica de manera detallada, paso a paso, seguido de una demostración que implica la inserción de electrodos intramusculares en las extremidades traseras de una rata. Se realiza un experimento en cinta rodante para un estudio de locomoción, y posteriormente se obtienen y analizan las señales electrofisiológicas resultantes.
Introducción
La electromiografía consiste en registrar los potenciales eléctricos generados por las fibras musculares durante la contracción. Estas propiedades están determinadas por las señales de activación neuronal enviadas desde las neuronas motoras a los músculos individuales. La EMG es ampliamente utilizada en estudios relacionados con la rehabilitación, motores, cerebrales y nerviosos, y los métodos de medición se pueden clasificar ampliamente en EMG de superficie (sEMG) y EMG intramuscular (iEMG)1. Los electrodos de superficie ofrecen varias ventajas, especialmente en aplicaciones portátiles, ya que no son invasivos y requieren un proceso de preparación sencillo2. En la sEMG implantada, el proceso quirúrgico es más sencillo en comparación con la iEMG, en la que no es necesario que el electrodo penetre en el músculo. A pesar de estas ventajas, la sEMG es propensa a la contaminación de la señal, como las perturbaciones en la interfaz músculo-electrodo, los artefactos de movimiento, la calidad del contacto del electrodo y la diafonía de la señal de los músculos adyacentes1. Estos desafíos son particularmente problemáticos cuando los electrodos se colocan muy cerca, como suele ser el caso en estudios con animales pequeños. Por otro lado, la iEMG requiere un procedimiento quirúrgico adicional para la penetración del electrodo. A pesar de los pasos adicionales del procedimiento, este método proporciona registros EMG específicos del músculo con mayor precisión y menos diafonía, ya que los electrodos están permanentemente incrustados en el tejido muscular3. En los estudios motores de animales pequeños, se prefiere la iEMG, ya que la información de EMG específica del músculo con una instalación fiable del electrodo es fundamental4.
Se han reportado varios enfoques para adquirir registros de EMG a partir de electrodos en animales pequeños. Los cables de sujeción se usan comúnmente para conectar electrodos a equipos de medición externos5,6,7,8,9,10,11, los dispositivos se pueden implantar dentro del cuerpo12, o se puede colocar una plataforma portátil inalámbrica en el animal13. Los cables de amarre son el método más ampliamente reportado debido a la disponibilidad de equipos comerciales compatibles para este propósito; Sin embargo, los cables de sujeción causan molestias a los animales, y su movimiento a menudo se ve limitado por los cables, lo que puede afectar el estudio. Los dispositivos implantables ofrecen soluciones inalámbricas, pero la duración limitada de la batería puede restringir la duración de los experimentos. Además, el tamaño y el peso de los dispositivos instalados permanentemente pueden causar estrés e incomodidad a los animales, lo que podría afectar el estudio. Se han propuesto técnicas de transferencia de energía inalámbrica para abordar los problemas de los dispositivos implantables, pero mantener un enlace de energía fiable a un dispositivo pequeño suele ser muy difícil14. Además, la exposición a altos campos electromagnéticos puede tener consecuencias imprevistas, como la reducción de la función inmune y posibles cambios neurodegenerativos en el cerebro15,16.
El sistema de adquisición también se puede implementar como una plataforma inalámbrica y portátil que maneja el procesamiento de señales y transmite de forma inalámbrica las grabaciones EMG a una estación base. Aunque este es el método preferido, presenta un desafío técnico para los usuarios, y los detalles experimentales a menudo no se abordan completamente en la literatura.
En este trabajo, presentamos un método de adquisición de EMG simple, de bajo costo y confiable para estudios de locomoción en animales pequeños. Un par de electrodos iEMG se implantan en los músculos de las extremidades traseras de una rata, mientras que el resto del sistema de adquisición de señales, incluida la amplificación, un convertidor de analógico a digital y la telemetría inalámbrica, se monta en la espalda del animal. Los datos de EMG se transmiten a una computadora personal para su monitoreo en tiempo real, con datos registrados localmente. Se lleva a cabo un experimento de locomoción en cinta rodante para demostrar el sistema en un estudio de recuperación de accidente cerebrovascular.
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Protocolo
La aprobación de todos los procedimientos y protocolos éticos y experimentales fue otorgada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales bajo la Solicitud No. CGU1-2021-IA0041. En este estudio se utilizó una rata Sprague-Dawley macho de 7 semanas de edad. Los detalles de los reactivos y el equipo se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación animal
- Prepare las ratas a la edad de 7 semanas. Por seguridad, aloje ratas de pesos similares juntas, con un máximo de tres ratas por jaula.
- Asegúrese de que las ratas se adapten sin estrés antes de la cirugía. Proporcione agua y alimentos de manera constante, y reemplace la ropa de cama periódicamente.
- Durante el período de adaptación (unos 7 días), entrene a los animales para que corran en una cinta de correr a una velocidad de 16-25 m/min durante 5 minutos cada día para ayudarles a aclimatarse a la cinta.
NOTA: Si una rata se detiene o se niega a moverse como se pretende, golpee suavemente sus nalgas para animarla.
2. Preparación de electrodos
- Prepare cinco alambres de acero inoxidable recubiertos con politetrafluoroetileno, cuatro de ellos de 140 mm de longitud y uno de 60 mm de longitud.
- Ate tres nudos simples en un alambre de 140 mm de largo, colocándolos a 40 mm y 100 mm en relación con el nudo (Figura 1A).
NOTA: Durante la inserción del electrodo de alambre en el músculo, puede ser un desafío garantizar un contacto preciso y mantener la parte expuesta del electrodo correctamente colocada. Para solucionar esto, se crea un nudo de bloqueo en el alambre para evitar una mayor inserción cuando se tira, lo que garantiza que el electrodo permanezca estable dentro del músculo. - Para los cables de 140 mm, deje un espacio de 2 mm desde el nudo en el lado corto, luego retire parcialmente el aislamiento con un soldador durante 2 mm. Pele completamente el aislamiento desde el extremo del lado largo por 2 mm. Para los electrodos de 60 mm, retire completamente el aislamiento en un extremo en 2 mm y en el otro extremo en 10 mm (Figura 1).
NOTA: La punta del soldador debe limpiarse a fondo para evitar la contaminación. - Fije el cable soldándolo al accesorio del conector después de quitar completamente el aislamiento (Figura 2B,C).
- Ensamble la parte metálica a la que está conectado el cable en la carcasa de plástico (Figura 2D,E).
- Conecte el conector a una guía de plástico impresa en 3D (consulte la Tabla de materiales) que incluye orificios para asegurarlo a la piel. Para evitar que la pieza soldada entre en contacto con el sitio de la incisión, aplique cianoacrilato biocompatible (Figura 2F).
- Corte una placa de níquel de 0,2 mm de grosor y dóblela para envolver el conector, protegiéndolo para evitar posibles daños por parte del animal.
3. Cirugía
- Coloque la rata en una cámara de inducción (fabricada a medida con una resina sintética transparente) y administre anestesia usando una mezcla de 70% de óxido nitroso y 30% de oxígeno, con una concentración de isoflurano de 2%-3%. Prepare el instrumental quirúrgico necesario (Figura 3).
- Retire el pelaje con un cortapelos eléctrico y prepare la piel con clorhexidina y alcohol para prevenir infecciones durante la cirugía (Figura 4A).
- Realizar una incisión de unos 10-15 mm con unas tijeras quirúrgicas sobre la piel donde se encuentra el músculo objetivo que se va a medir. Dado que la fascia se encuentra debajo de la piel y los músculos debajo de ella, primero use unas tijeras para cortar la piel, luego retire la fascia limpiándola suavemente con un paño limpio.
- Haga una incisión de 5-10 mm alrededor de la región lumbar donde se conectará el conector.
- Utilice trochar estéril para crear un pasaje debajo de la piel para que el cable pase desde el conector hasta la posición del músculo objetivo (Figura 4B).
- Pase el trochar desde la posición muscular, debajo de la piel, hacia el sitio de la incisión en el lado lumbar.
- Prepare el electrodo y el conector de la etapa anterior. Apriete los electrodos de alambre en el sitio de la incisión en el lado lumbar con las pinzas y tire de ellos con cuidado a través de la incisión en el músculo objetivo. Una vez que se haya extraído el alambre hasta la ubicación del músculo objetivo, consulte Figura 4C.
- Como se muestra en Figura 4D, utilice una aguja de sutura para penetrar el alambre del electrodo en el músculo objetivo.
NOTA: El músculo objetivo de este experimento es el gastrocnemio medial (MG), que es uno de los músculos clave para analizar las tareas motoras17. Dado que la longitud de la MG es de aproximadamente 18 mm en ratas de 7 semanas de edad, se deben colocar electrodos alrededor del centro del músculo, con un espaciado de aproximadamente 5 mm, para minimizar el daño muscular y garantizar mediciones precisas de EMG. Se recomienda que la longitud del alambre que penetra en el músculo supere los 5 mm para garantizar que la parte a la que se le ha quitado el aislamiento esté en buen contacto con el músculo. - Guíe el alambre que ha pasado y salido del músculo de regreso a su punto de inserción y asegúrelo con un nudo simple. Corta el alambre restante (Figura 4E).
- Después de instalar el electrodo de alambre en el músculo objetivo, suturar el sitio de la incisión con una sutura de monofilamento 4-0.
- Suturar la incisión debajo del conector. Asegúrese de que todo el alambre esté insertado en el cuerpo y suturado de forma segura (Figura 5A).
- Fije el conector a la piel dorsal del animal con un hilo de sutura, como se muestra en Figura 5B.
NOTA: Asegúrese de que el protector esté bien sujeto para evitar que el animal muerda el conector. Para la analgesia, se administró carprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea. - Una vez finalizada la operación quirúrgica, suspenda la anestesia y prepare una jaula para la recuperación del animal.
- Encienda una lámpara de calor para evitar que la temperatura corporal del animal baje y controle el sitio quirúrgico para detectar cualquier anomalía, como signos de infección, inflamación o hinchazón. Desinfecte bien el sitio de la incisión y aplique ungüento si es necesario. Una vez que la rata se haya recuperado de la anestesia, retire la lámpara de calor.
- Vigile el comportamiento de la rata, incluyendo el apetito, la bebida y la micción.
NOTA: Después de la cirugía, deje que el animal descanse durante unos 2 días antes de realizar cualquier prueba.
4. Diseño y fabricación de placas de circuito impreso (PCB)
- Diseñe el circuito para la medición y digitalización de EMG para incluir dos circuitos integrados (IC) de amplificador analógico y una unidad de microcontrolador (MCU). Asegúrese de que el amplificador tenga un ancho de banda de 5 a 740 Hz y una ganancia de 1300 V/V.
NOTA: Modifique la ganancia del amplificador y el ancho de banda de acuerdo con los requisitos específicos del animal si es necesario18. - Incluye un módulo Bluetooth integrado en la MCU para la comunicación inalámbrica para transmitir los datos medidos al dispositivo host. Para este experimento se utilizó una antena de chip que funciona a 2,4 GHz.
- Utilice una batería Li-po recargable de 3,7 V junto con un circuito integrado de administración de energía dedicado para este estudio.
- Fabrica una placa de circuito impreso para los circuitos integrados anteriores en un sustrato FR4. Cree la PCB en varias formas para cumplir con requisitos específicos. Consulte la Figura complementaria 1, la Figura complementaria 2 y la Figura complementaria 3.
- Rellene los componentes electrónicos en la PCB soldando o usando una pistola de calor.
5. Configuración del software
- firmware
- Prepare el firmware (archivo de codificación suplementario 1) para configurar un ADC de 2 canales con una resolución de 8 bits y una frecuencia de muestreo de 2 kSP. Formatee los datos convertidos digitalmente en una matriz y transmítalos a través de Bluetooth Low Energy (BLE) utilizando la herramienta de desarrollo de software designada.
- Cargue el firmware en la MCU antes de la implementación.
- Programa de monitoreo en tiempo real
- Prepare un programa para trazar los datos recibidos a través de BLE en tiempo real. Para este estudio, se desarrolla una aplicación de trazado basada en Python, que también almacena los datos brutos en una ubicación especificada (Supplemental Coding File 2).
NOTA: El sistema puede experimentar un retardo de búfer de muestreo de un máximo de 50 ms y un retardo de comunicación inalámbrica de aproximadamente 10 ms19,20.
- Prepare un programa para trazar los datos recibidos a través de BLE en tiempo real. Para este estudio, se desarrolla una aplicación de trazado basada en Python, que también almacena los datos brutos en una ubicación especificada (Supplemental Coding File 2).
6. Prueba de cinta de correr
- Conecte la batería al circuito preparado y conecte la PCB al conector, como se muestra en Figura 6A.
- Ejecute el programa de monitoreo en la PC y establezca la conectividad inalámbrica con el circuito PCB.
- Coloque la rata en la cinta de correr y controle la forma de onda EMG. Para este estudio, la cinta de correr se ajusta a una velocidad de 25 m/min (Figura 6B).
7. Análisis de datos
- Cargue los datos EMG almacenados en archivos . Formato CSV.
- Aplique métodos de procesamiento de señales para eliminar el ruido no deseado y las señales de interferencia.
NOTA: La detección de envolvente y el análisis espectral se pueden realizar más para analizar la fatiga muscular y la simetría en la actividad motora.
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Resultados
En este estudio, se presenta un método inalámbrico sencillo para la adquisición de EMG. Aunque es necesaria una intervención quirúrgica, solo se realiza una incisión parcial en la zona específica para la inserción del electrodo y la fijación del conector, reduciendo significativamente la carga para el animal. En esta demostración, los electrodos se insertaron en las extremidades inferiores, pero se pueden realizar estudios electrofisiológicos similares en diversas áreas adicionales utiliz...
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Discusión
Este trabajo presenta un sistema de adquisición de electromiografía (EMG) que es pequeño, fácil de implementar, de bajo costo e inalámbrico. El sistema evita eficazmente la degradación de la señal causada por los cables, ya que no depende de ningún equipo de medición externo cableado. Al montar el conector en la parte posterior en lugar de en la cabeza, el proceso quirúrgico se vuelve significativamente más fácil, lo que reduce el riesgo de complicaciones. Esta configuración también minimiza las posibilidades de que la p...
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Divulgaciones
Todos los autores no tienen conflicto de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2020M3A9E4104385) y el Proyecto de Desarrollo de Dispositivos Nanomédicos del National Nano Fab Center (número de subvención: 1711160154).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de níquel de 0,2 mm de espesor | Cualquier vendedor | ||
| Filamento de impresión 3D | cubicon | A-100 | |
| 7 semanas RAT | JABIO | SD (DBL) [7W M] | |
| Adhesivo | Okong | 1028453 | para asegurar el escudo |
| ANT1 | Johanson Technology Inc. | 2450AT07A0100001T | |
| C1, C15, C16, C20 | Vishay | 1n | 0201(0603)métrico |
| C10, C13 | Vishay | 100p | 0201(0603)métrico |
| C11, C12 | Vishay | 4p | 0201(0603)métrico |
| C14, C19 | Vishay | 0.39n | 0201(0603)métrico |
| C2, C17 | Vishay | 22n | 0201(0603)métrico |
| C3, C5, C6 | Vishay | 0.1u | 0201(0603)métrico |
| C4, C18 | Vishay | 2.2u | 0201(0603)métrico |
| C7 | Vishay | 4.7u | 0402(1005)métrico |
| C8, C21 | Vishay | 1u | 0201(0603)métrico |
| C9 | Vishay | 1p | 0201(0603)métrico |
| Jaula | JEUNG DO B& P | JD-C-02 | |
| Paño limpio | kimberly | 41112 | |
| Accesorio conector | Harwin | M20-1060400 | Carcasa de plástico |
| Accesorio conector | Harwin | M20-1180042 | Pieza metálica |
| Cortapelos eléctrico | Buzz | RFC-928 | |
| Pistola de calor | QUICK | 861DW | |
| IC1, IC3 | Dispositivo analógico | AD8232 | para la medición de EMG AFE |
| IC2 | Semiconductor nórdico | nRF52832-CIAA | |
| Isoflurano | Hana Pharm | 657801261 | |
| L1 | Vishay | 3.3n | 0201 (0603) batería |
| Li-po | TheHan | TW402025 13 mm * 10 mm * 4 mm, 30mAh | |
| Cabezal de pin | Harwin | M22-2530505 | |
| R1, R2, R9, R10, R13, R14, R21, R22 | Vishay | 10M | 0201(0603)métrico |
| R11, R23 | Vishay | 100k | 0201(0603)métrico |
| R12, R24 | Vishay | 1M | 0201(0603)métrico |
| R3, R4, R5, R7, R15, R16, R17, R19 | Vishay | 180k | 0201(0603)métrico |
| R6, R18 | Vishay | 160k | 0201(0603)métrico |
| R8, R20 | Vishay | 768k | 0201(0603)métrico |
| Alambre de soldadura | Alfa metal SACX0307 | ||
| Soldador | Hakko | FX-951 | |
| Alambres de acero inoxidable recubiertos con teflón | A-M Systems | 793200 | |
| Aguja de sutura | AILEE | 301289 | |
| Alambre de sutura | Ethicon | 604G | |
| Cinta de correr | Daejong Bio | DJ2-243 | |
| U1 | Torex Semiconductor | XC6204B332DR-G | |
| Y1 | Murata Electronics XRCTD32M000N1P1AR0 |
Referencias
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