Este protocolo describe un método de análisis integral de citometría de masas (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]) para evaluar las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el carcinoma hepatocelular (CHC). El enfoque tiene como objetivo proporcionar información sobre el panorama inmunitario del CHC, ofreciendo una comprensión más profunda del microambiente tumoral y los mecanismos inmunitarios asociados.
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Artículo de método
Análisis por citometría de masas de las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el carcinoma hepatocelular
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El carcinoma hepatocelular (CHC) es una de las formas más comunes y mortales de cáncer de hígado en todo el mundo. A pesar de los avances en el tratamiento, el pronóstico para los pacientes con CHC sigue siendo precario debido a la compleja interacción de factores genéticos, ambientales e inmunológicos que impulsan su progresión. Comprender el panorama inmunitario del CHC es crucial para desarrollar terapias eficaces, especialmente en el campo de la inmunoterapia, que es muy prometedora para mejorar los resultados de los pacientes. En este estudio se emplea la tecnología de citometría masiva (citometría por tiempo de vuelo [CyTOF]) para investigar las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en pacientes con CHC. Mediante el análisis de muestras de sangre periférica y tumores, la investigación tiene como objetivo identificar poblaciones únicas de células inmunitarias y sus estados funcionales asociados con la progresión del CHC. Los hallazgos proporcionan una visión completa del panorama inmunitario en el CHC, destacando los posibles biomarcadores y dianas terapéuticas. Este enfoque ofrece información valiosa sobre los mecanismos inmunitarios subyacentes al CHC y allana el camino para el desarrollo de inmunoterapias más eficaces para esta neoplasia maligna.
Introducción
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el cáncer primario de hígado más común y un importante problema de salud mundial debido a sus altas tasas de incidencia y mortalidad1. Según la Organización Mundial de la Salud, el CHC es el quinto cáncer más común y la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo2. Es particularmente prevalente en regiones con altas tasas de infecciones crónicas por hepatitis B y C, como Asia Oriental y África Subsahariana3. Los principales factores de riesgo incluyen hepatitis viral, cirrosis y síndrome metabólico
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Protocolo
En el siguiente plan se describen los pasos para la recolección de muestras de sangre y CHC, el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), la disociación de células individuales y la tinción. Los reactivos y materiales experimentales se enumeran en la Tabla de Materiales. Todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, asegurando que la recolección de muestras tumorales no interfiriera con el diagnóstico patológico. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos humanos.<....
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Resultados
Para dilucidar las características inmunológicas asociadas con el CHC, se realizó un análisis exhaustivo de las poblaciones de células inmunitarias. Se recolectaron muestras pareadas de PBMC y tejido de CHC de 4 pacientes con CHC. Se realizó un perfil de citometría masiva para examinar las poblaciones de células inmunitarias a nivel proteómico de una sola célula, utilizando dos paneles de anticuerpos para muestras de tejido de PBMC y CHC.
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Discusión
Este estudio aprovecha la tecnología de citometría masiva para proporcionar un análisis en profundidad de las respuestas inmunitarias sistémicas y locales en el CHC. La aplicación de la citometría de masas en este contexto permite la detección simultánea de múltiples marcadores a nivel de una sola célula, lo que ofrece una caracterización inmunofenotípica detallada que es crucial para comprender el complejo panorama inmunitario del CHC. La citometría de masas ha revolucionado los estudio.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (subvención 2019YFA0803000 a J.S.), la Fundación Juvenil Excelente de Zhejiang Scientific (subvención R22H1610037 a J.S.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención 82173078 a J.S.), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (subvención 2022C03037 a J.S.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1×PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 10×PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 1000 mL pipette tips | Rainin | 30389218 | |
| 15 mL centrifuge tube | NEST | 601052 | |
| 200 mL pipette tips | Rainin | 30389241 | |
| 40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL centrifuge tube | NEST | 602052 | |
| 70 μm syringe fifilter | Sangon Biotech | F613462-9001 | |
| Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2) | BioLegend | 357224 | |
| Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8) | BioLegend | 310724 | |
| Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7) | BioLegend | 353240 | |
| Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8) | BioLegend | 350202 | |
| Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4) | BioLegend | 347314 | |
| Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2) | BioLegend | 313201 | |
| Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) | BD | 562721 | |
| Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) | BD | 563026 | |
| Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6) | BioLegend | 306002 | |
| Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5) | BioLegend | 351337 | |
| Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19) | BioLegend | 301701 | |
| Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15) | BioLegend | 356535 | |
| Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14) | BioLegend | 325604 | |
| Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80) | BioLegend | 344102 | |
| Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61) | BioLegend | 376302 | |
| Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) | BD | 561313 | |
| Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10) | BioLegend | 339902 | |
| Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61) | BioLegend | 333603 | |
| Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239) | BioLegend | 346002 | |
| Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19) | BioLegend | 302226 | |
| Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161) | BioLegend | 331501 | |
| Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7) | BioLegend | 302301 | |
| Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2) | BioLegend | 321151 | |
| Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5) | BioLegend | 311129 | |
| Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96) | BioLegend | 302624 | |
| Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) | BD | 555916 | |
| Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D) | BioLegend | 375902 | |
| Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2) | BioLegend | 303232 | |
| Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A) | BioLegend | 369812 | |
| Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53) | BioLegend | 303402 | |
| Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) | BD | 563094 | |
| Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) | BD | 563716 | |
| Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1) | BioLegend | 304220 | |
| Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11) | BioLegend | 362510 | |
| Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C) | BioLegend | 399502 | |
| Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c) | BioLegend | 392917 | |
| Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A) | BioLegend | 333808 | |
| Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50) | BioLegend | 310902 | |
| Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7) | BioLegend | 395602 | |
| Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) | BD | 557750 | |
| Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D) | BioLegend | 375402 | |
| Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63) | BioLegend | 374202 | |
| Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D) | BioLegend | 320101 | |
| Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32) | BioLegend | 311426 | |
| Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243) | BioLegend | 307650 | |
| Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2) | BioLegend | 348211 | |
| Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67) | BioLegend | 350501 | |
| Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2) | BD | 567783 | |
| Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7) | BioLegend | 329951 | |
| Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2) | BioLegend | 393602 | |
| Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) | BD | 74 |
Referencias
- Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
- Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-2....
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Reimpresiones y permisos
