Artículo de método

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

DOI:

10.3791/67436

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1 de noviembre de 2024

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1Department of Integration of Chinese and Western Medicine, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 2Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Resumen

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Los pericitos retinianos son esenciales para el desarrollo vascular y la estabilidad de la retina, desempeñando un papel clave en el mantenimiento de la integridad de la vasculatura retiniana. Para proporcionar una visión detallada de las características morfológicas de los pericitos, este estudio describió un nuevo enfoque que combina la inyección retroorbitaria de un agente fluorescente, la tinción inmunofluorescente y el tratamiento de limpieza de tejidos. En primer lugar, la lectina fluorescente de tomate se inyectó en el seno retroorbitario del ratón vivo para marcar la vasculatura de la retina. Después de 5 minutos, el ratón fue sacrificado y su retina intacta se extrajo cuidadosamente de la copa de la retina y se tiñó inmunofluorescentemente con el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β para revelar los pericitos. Además, la retina teñida se trató con un reactivo de limpieza de tejidos y se montó entera en el portaobjetos del microscopio. A través de estos enfoques, la vasculatura retiniana y los pericitos se observaron claramente en la retina transparente. Bajo un microscopio confocal, obtuvimos más oportunidades de tomar imágenes de alta resolución para reconstruir y analizar las características morfológicas de los pericitos a lo largo del árbol vascular de la retina en una vista tridimensional. Metodológicamente, este protocolo ofrece un enfoque eficaz para visualizar los pericitos dentro de la vasculatura de la retina, proporcionando información valiosa sobre su papel tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.

Introducción

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Los pericitos de la retina están incrustados dentro de la membrana basal a lo largo del lado abluminal de las células endoteliales vasculares, mostrando un patrón en forma de malla de procesos de corto alcance envueltos alrededor delos vasos sanguíneos de la retina. Este contacto íntimo entre los pericitos y la vasculatura retiniana contribuye al mantenimiento de la homeostasis ambiental de la retina2. Aunque numerosos estudios han proporcionado evidencia morfológica de los pericitos en la vasculatura retiniana, la mayor parte de nuestra comprensión de las características morfológicas de los pericitos retinianos proviene de técnicas histológicas convencionales3.

En línea con estos estudios, diseñamos este estudio para mostrar de manera efectiva más detalles morfológicos de los pericitos en la microvasculatura de la retina mediante la combinación de técnicas histológicas tradicionales con métodos científicos modernos de vanguardia. El enfoque aquí integra tres técnicas clave: inyección retroorbital de lectina fluorescente de tomate en ratones vivos, tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β (PDGFR-β) y la estrategia de limpieza de tejidos basada en solventes. La inyección retroorbital de lectina fluorescente de tomate ha demostrado ser eficaz y fiable para observar la vasculatura de la retina del ratón tanto in vivo como in vitro 4,5. El PDGFR-β sirve como un biomarcador comúnmente utilizado para la tinción inmunofluorescente de pericitos6. Para capturar imágenes de alta resolución de los pericitos dentro de las retinas más gruesas y de montaje completo, la estrategia de limpieza de tejidos mejora la transparencia histológica 2,7,8.

Si bien cada una de estas técnicas se ha aplicado individualmente en estudios de retina, su compatibilidad combinada para investigar pericitos en la vasculatura de la retina de ratones sigue siendo incierta. Dado que el grosor promedio de la retina del ratón es de aproximadamente 180-220 μm9, el marcaje de anticuerpos y la obtención de imágenes confocales en este tejido grueso sin tratamiento de aclaramiento a menudo resultan en señales de fondo altas, lo que complica la observación de la relación espacial entre los pericitos y los vasos sanguíneos10. A través de los enfoques descritos aquí, nuestro objetivo es proporcionar un método sencillo para visualizar los pericitos dentro de la vasculatura de la retina en una vista tridimensional (3D) bajo un microscopio confocal. Esta información celular mejorada de los pericitos en la vasculatura de la retina podría mejorar nuestra comprensión de la homeostasis ambiental de la retina y subrayar las estrategias potenciales para la protección vascular, mejorando así los resultados funcionales en los trastornos vasculares de la retina.

Protocolo

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Para este estudio, se utilizaron tres ratones machos C57BL/6 adultos jóvenes (de 8 a 10 semanas de edad, con un peso de 20 a 25 g). Se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con temperatura y humedad controladas y se les permitió el libre acceso a alimentos y agua. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas (aprobación No. 2023-03-14-04) y se realizó de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).

1. Inyección retroorbital in vivo de lectina fluorescente de tomate

  1. Inyectar 50 mg/kg de pentobarbital por vía intraperitoneal para anestesiar al ratón. Evalúe la profundidad de la anestesia evaluando la ausencia de una respuesta a un estímulo de pellizco en el dedo del pie.
  2. Coloque el ratón en la decúbito lateral derecho con la cabeza hacia la izquierda.
  3. Presione dos dedos suavemente sobre el área periorbitaria para exponer el ojo izquierdo del ratón y permitir la administración más fácil de la inyección en el seno retroorbitario izquierdo del animal11.
  4. Utilice una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 27G para perforar suavemente unos 2-3 mm en el seno venoso orbitario del ratón con el bisel de la aguja hacia adelante en un ángulo de 45°.
  5. Inyecte 0,1 mL (1 mg/mL) de lectina fluorescente de tomate en el seno venoso orbitario del ratón.

2. Perfusión y enucleación de los ojos

  1. A los 5 min después de la inyección retroorbitaria, inyectar la solución de tribromoetanol (250 mg/kg) por vía intraperitoneal para anestesiar profundamente al ratón. Posteriormente, se practica la eutanasia del animal mediante exanguinación y perfusión cardíaca. Una vez que se detenga la respiración, abra la cavidad torácica con unas tijeras quirúrgicas12.
  2. Una vez que se detenga la respiración, abra la cavidad torácica con unas tijeras quirúrgicas. Esterilice los instrumentos quirúrgicos con anticipación y opere con una campana extractora. Utilice una aguja de 24G e insértela 2 mm en el ventrículo cardíaco izquierdo a través del vértice ventricular izquierdo. Realizar la perfusión a una velocidad de 3 mL/min con 20 mL de solución salina fisiológica al 0,9% seguido de 20 mL de formaldehído al 4% en tampón de fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).
  3. Coloque el ratón sacrificado de lado y retire la piel cubriendo los ojos con unas tijeras. Enuclear los ojos con tijeras y fórceps.
  4. Corte el nervio óptico y los tejidos circundantes, luego levante el ojo y transfiéralo a una placa de 12 pocillos para su posterior fijación en formaldehído al 4% en PB 0,1 M durante 2 h.
  5. Crioproteger el tejido en sacarosa al 25% en 0,1 M PB (pH 7,4) a 4 °C hasta que se hunda hasta el fondo de la solución.
    NOTA: Dado que el tejido ocular se deshidrata bien en una solución de sacarosa, la retina se puede desprender más fácil y completamente, lo que facilita estudios exhaustivos posteriores.

3. Disección de retinas

  1. Transfiera los ojos a una placa de Petri que contenga 0,1 M PB (pH 7,4) con una pipeta Pasteur de plástico.
  2. Perfore el borde de la córnea con unas tijeras afiladas, corte alrededor de la córnea y el iris y deséchelo.
  3. Use fórceps para extraer el cristalino y el humor vítreo. Luego, aleje la retina en forma de copa del centro del ojo con pinzas finas. Enjuague la retina con 0,1 M PB (pH 7,4) en una placa de Petri limpia.

4. Tinción inmunofluorescente y limpieza de tejidos de retina

  1. Retire con cuidado la retina en forma de copa e incubela en una solución de Triton X-100 al 2% en 0,1 M PB (pH 7,4) durante la noche a 4 °C.
  2. Transfiera la retina a la solución de bloqueo (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% azida sódica + 10% suero de burro normal) y gire a 72 rpm en el agitador durante la noche a 4 °C.
  3. Transfiera la retina a la solución que contiene los anticuerpos primarios de cabra anti-PDGFR-β (10 μg/mL) en tampón de dilución (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100 + 0,2% azida sódica + 1% suero de burro normal) en un tubo de microcentrífuga y gire en el agitador durante 2 días a 4 °C.
  4. Lave la retina 2 veces con tampón de lavado (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) a temperatura ambiente, luego manténgala en tampón de lavado durante la noche a 4 °C en el agitador.
  5. Al día siguiente, transfiera la retina a la solución mezclada que contiene el anticuerpo secundario de 1 mg/mL de burro anti-cabra 488 y 0,2 ng/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) nuclear fluorescente en un tubo de microcentrífuga y gire a 72 rpm en el agitador durante 5 h a 4 °C.
  6. Lave la retina en una placa de 6 pocillos con tampón de lavado durante 1 h, 2 veces, a temperatura ambiente. Mantenga la retina en tampón de lavado en el agitador durante la noche a 4 °C. Realice imágenes y análisis según el paso 5 para obtener las vistas de aclarado de tejido antes de la aclaración.
  7. Transfiera la retina al reactivo de limpieza de tejidos y gírela suavemente a 60 rpm en el agitador durante 1 h a 37 °C.
  8. Después del tratamiento de limpieza de tejidos, enjuague la retina en forma de copa con 0,1 M PB (pH 7,4) en una placa de Petri limpia.
  9. Haga 4 incisiones radiales que alcancen aproximadamente 2/3 del radio de la retina con unas tijeras de resorte para crear una forma de pétalo.
  10. Aplana y monta la retina en un portaobjetos de microscopio, y luego retira el exceso de PB con un pequeño trozo de papel absorbente. Mantenga el interior de la retina hacia arriba en el portaobjetos.
  11. Rodea la retina montada con un espaciador y rellena el espacio con un reactivo para limpiar tejidos y un cubreobjetos.

5. Imágenes y análisis

  1. Obtenga las vistas externas de la retina antes (después de completar el paso 4.6) y después del tratamiento de limpieza de tejidos.
  2. Escanee las vistas de montaje de la retina etiquetada con el escáner panorámico de corte de tejido. Utilice un objetivo 2x con un NA de 0,08.
  3. Tome las imágenes de mayor aumento mediante un sistema de imágenes confocal equipado con las siguientes lentes de objetivos: lente de 10x con NA de 0.40 y lente de 40x con NA de 0.95. Ajuste el orificio confocal a 152 μm (lente de objetivo de 10x) y 105 μm (lente de objetivo de 40x). Establezca la resolución espacial de la captura de imágenes en 1024 x 1024 píxeles (lente de objetivo de 10x) y 640 x 640 píxeles (lente de objetivo de 40x).
  4. Capture 50 imágenes (pila Z) en fotogramas de 2 μm desde la retina etiquetada. Integre todas las imágenes en un solo enfoque bajo el modo de proyección/topografía. Para la configuración, haga clic en Establecer plano focal inicial > Establecer plano focal final > Establecer tamaño de paso > Elegir patrón de profundidad > Captura de imagen > serie Z.
  5. Capture imágenes utilizando las siguientes longitudes de onda de excitación y emisión para diferentes señales de fluorescencia: Señales de fluorescencia verde a 499 nm y 519 nm; señales de fluorescencia roja a 591 nm y 618 nm; y señales de fluorescencia azul a 401 nm y 421 nm.
  6. Reconstruya las imágenes en el patrón tridimensional importando imágenes confocales de pila Z a un software de análisis seleccionando Agregar nuevas superficies > Elegir configuración de volumen > Elegir canal de origen > Ajustar visualización > Ajustar ángulo de superficie > instantánea.

Resultados

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A partir de las vistas externas de la retina de montaje completo, la transparencia del tejido de la retina de montaje completo aumentó con el tratamiento de limpieza de tejidos en comparación con la de la retina sin limpieza de tejidos (Figura 1).

Para el examen histológico de la retina de montaje completo, la vasculatura de la retina se marcó en rojo con lectina fluorescente de tomate a través de la inyección retroorbitaria, y los pericitos de la retina se muestran en verde con PDGFR-β (Figura 2, Figura 3 y Figura 4). Aunque se pudo observar este marcaje en la muestra antes y después del aclaramiento del tejido, a modo de comparación, el ruido de fondo de la muestra de retina se redujo con el tratamiento de aclarado del tejido (Figura 2). El tratamiento también hizo que los pericitos y la vasculatura de la retina marcados fueran más claros bajo el escáner panorámico de corte de tejido (Figura 2) y el microscopio confocal de barrido láser (Figura 3).

La distribución gradacional de los pericitos retinianos también se demuestra aquí a lo largo del árbol vascular retiniano (Figura 3). Desde la parte central de la retina hasta su región periférica, los pericitos se localizan en la membrana basal de la vasculatura retiniana, incluyendo el tronco y las ramas vasculares y los capilares (Figura 3).

Sobre la base de la observación anterior, la correlación espacial de los pericitos y la vasculatura de la retina se evaluó más a fondo con las imágenes de la pila Z de mayor aumento de la muestra de retina aclarada (Figura 4). Con la ayuda del sistema de procesamiento de imágenes, proporcionamos además las vistas 3D para demostrar que los pericitos estaban firmemente envueltos alrededor de la vasculatura de la retina en diferentes diámetros (Figura 4). La figura 4A0-D0 representa la ramificación jerárquica de los vasos de la retina de mayor a menor. Dado que los pericitos se distribuyen más abundantemente en los capilares, la tinción de PDGFRβ en la Figura 4D0 muestra una intensidad y señal más fuertes en comparación con la Figura 4A0-C0.

A diferencia de la retina de ratón sin tratamiento de limpieza de tejidos (Figura 1A, Figura 2A, Figura 3A0-D0), el enfoque actual ha reducido eficazmente las señales de fondo de la retina para demostrar la relación espacial entre los pericitos y los vasos sanguíneos de la retina de montaje completo (Figura 1B, Figura 2B, Figura 3A1-D1).

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Figura 1: Comparación de la transparencia óptica de toda la retina del monte sin y con el tratamiento de limpieza de tejidos. (A, B) Las vistas externas de toda la retina del monte antes (A) y después de (B) el tratamiento de limpieza de tejidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Comparación de las características de marcaje de los pericitos y la vasculatura de la retina de toda la montura de la retina sin y con el tratamiento de limpieza de tejidos. (A, B) Se tomaron vistas de montaje representativas de toda la retina de la montura antes de (A) y después de (B) tratamiento de limpieza de tejidos bajo el sistema de portaobjetos virtual. La vasculatura está en rojo (lectina fluorescente de tomate), los pericitos en verde (PDGFR-β) y el núcleo celular está en azul (DAPI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Comparación de la resolución de imagen de los pericitos retinianos gradacionalmente a lo largo del árbol vascular de la retina antes y después del tratamiento de limpieza de tejidos. (A-D) Las imágenes representativas de la retina marcada antes del tratamiento de limpieza de tejidos (A0-D0) y después del tratamiento de limpieza de tejidos (A1-D1) muestran la distribución de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina en orden de tronco vascular (A0, A1), las ramas de primer orden (B0, B1), las ramas de segundo orden (C0, C1) y el capilar (D0, D1). La vasculatura está en rojo (lectina fluorescente de tomate), los pericitos en verde (PDGFR-β) y el núcleo celular está en azul (DAPI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Correlación espacial de pericitos con vasculatura retiniana en diferentes diámetros. (A-D) Imágenes representativas de alta resolución de la retina marcada a lo largo del árbol vascular de la retina que muestran la distribución de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina en diferentes diámetros, incluyendo el tronco vascular (A0, A1), las ramas de primer orden (B0, B1), las ramas de segundo orden (C0, C1) y el capilar (D0, D1). A1-D1: Las imágenes correspondientes de los paneles A0-D0 se reconstruyeron para mostrar la correlación espacial de los pericitos con la vasculatura de la retina en diferentes diámetros en las vistas tridimensionales y demostrar aún más las vistas ampliadas de las regiones locales en los paneles A1-D1 (flechas) con inserciones. La vasculatura está en rojo (lectina fluorescente de tomate), los pericitos en verde (PDGFR-β) y el núcleo celular está en azul (DAPI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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En este estudio, detallamos el proceso técnico para demostrar la morfología de los pericitos en la vasculatura de la retina mediante inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate, examen inmunofluorescente con PDGFR-β y aclaramiento de tejidos a base de solventes. Los resultados muestran que estas técnicas son altamente compatibles para resaltar pericitos en la retina de montaje completo. La combinación de estas metodologías ofrece un enfoque eficaz para visualizar las características morfológicas de los pericitos en la vasculatura de la retina desde una perspectiva 3D detallada.

Una de las técnicas clave, la inyección retroorbital en ratones, ha demostrado ser un método simple y óptimo para administrar agentes de marcaje vascular, superando a los métodos de inyección intraperitoneal y de vena de cola para observar la vasculatura de la retina del ratón13,14. Aunque el principio y el mecanismo detrás del marcaje vascular a través de la inyección retroorbitaria no se comprende completamente, es evidente que este método marca de manera robusta la vasculatura de la retina con lectina fluorescente de tomate. El marcaje fluorescente permanece estable tanto a través del procesamiento histoquímico como del aclarado de tejidos. Por lo tanto, más allá de su uso en imágenes in vivo, la inyección retroorbital con lectina fluorescente de tomate marca eficazmente la luz de los vasos sanguíneos, ofreciendo una visión clara de la vasculatura de la retina para el examen histológico in vitro y ex vivo.

Para el marcaje de los pericitos retinianos se utilizó la tinción inmunofluorescente con PDGFR-β15. Teniendo en cuenta que la retina teñida se sometió a un tratamiento adicional con reactivo de limpieza de tejidos para reducir la dispersión de la luz tisular bajo un examen morfológico microscópico, la retina se incubó en la solución de tinción durante más tiempo para mejorar la penetración del anticuerpo16,17.

La retina de montaje completo es relativamente transparente, lo que permite una visión general de la vasculatura retiniana18. Sin embargo, debido a la dispersión de la luz con su grosor, limita la penetración de la luz y la obtención de imágenes de alta resolución19. Con la ayuda de técnicas de limpieza de tejidos, se ha hecho posible ver los pericitos en la retina de montaje completo desde una perspectiva de alta resolución 19,20. Sin embargo, estos métodos aún no se han aplicado ampliamente a la investigación de los pericitos retinianos de ratón. En este estudio, el enfoque de limpieza de tejidos basado en solventes mejoró significativamente nuestra capacidad para visualizar pericitos en la vasculatura de la retina, lo que nos permitió obtener imágenes de alta resolución de la pila Z utilizando un microscopio confocal de barrido láser.

Los pericitos, distribuidos a lo largo del árbol microvascular, desempeñan un papel esencial en la compleja distribución espacial y temporal de la sangre dentro de la red capilar de la retina22. Su morfología altamente plástica y sus capacidades contráctiles adaptativas hacen que los pericitos sean ideales para regular el flujo sanguíneo capilar en respuesta a la actividad neuronal local en condiciones fisiológicas y patológicas23. Como actor clave de la barrera hemato-retiniana o del acoplamiento neurovascular retiniano, los pericitos retinianos también son destacados en el mantenimiento de la neovascularización, angiogénesis y transmigración de leucocitos24.

Como limitación técnica, hay que tener en cuenta que, además del PDGFR-β, también se han utilizado otros marcadores como NG-2 y CD13 para identificar pericitos 22,24,25. Por lo tanto, la selección de un marcador específico de pericitos adecuado para demostrar los pericitos sin ambigüedades sigue siendo un desafío. Este estudio proporciona más evidencia de que el PDGFR-β es un mejor candidato para revelar las características morfológicas de los pericitos.

En resumen, demostramos que la combinación de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate, la tinción inmunofluorescente y el aclaramiento de tejidos permitió la adquisición de imágenes de alta resolución, revelando la morfología detallada de los pericitos en la vasculatura de la retina del ratón en condiciones fisiológicas. Estos hallazgos sugieren que este método podría ser valioso para futuras investigaciones sobre las alteraciones de los pericitos de la retina en condiciones patológicas.

Divulgaciones

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Sin conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este estudio contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (No. 7244480), el Fondo de Innovación CACMS (No. CI2021A03407), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82004492) y los Fondos de Investigación Fundamental para los Institutos Centrales de Investigación de Bienestar Público (Nos. ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571Proteger de la luz
Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11055Proteger de la luz
C57BL/6 ratón BeijingVital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK (Jing) 2021-0006
Sistema de imágenes confocalesOlympusFV1200
Cabra anti-PDGFR-βInvestigación y DesarrolloAF104225 µ g 
Software ImarisOxford Instrumentsv.9.0.1
Lycopersicon esculentum (tomate) lectina, DyLight594Thermo Fisher ScientificL32471
Tubo de microcentrífugaAxygenMCT-150-C1,5 ml
Suero de burro normalJackson ImmunoResearch017-000-12110 ml
Escáner panorámico de corte de tejidoOlympusVS120-S6-W
Photoshop y  IlustraciónAdobeCS6
RapiClear 1.52 SoluciónSunJin LabRC15200110 mL
Placa de seis pocillosTijeras3335
Fine Science Tools15003-08
Portaobjetos de microscopio Superfrost PlusThermo Fisher Scientific4951PLUS-00125 mm x 75 mm x 1 mm
de 1 mg de resorte Costar

Referencias

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