Aislamiento enzimático de vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo aislar y purificar vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético (SkM-EVs) de tejidos musculares de roedores mediante desprendimiento mecánico, disociación enzimática, filtración y ultracentrifugación diferencial. Demuestra consistencia y confiabilidad. Los SkM-EV aislados proporcionan información sobre la homeostasis muscular y las enfermedades, con posibles aplicaciones como biomarcadores de diagnóstico o vehículos terapéuticos.

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) son nanopartículas encerradas en bicapas lipídicas liberadas por las células para transportar carga bioactiva, como proteínas, ARN y ADN, para la comunicación intercelular. La investigación de la diafonía mediada por EV entre las células de la homeostasis y las enfermedades musculares ofrece un potencial significativo para mejorar nuestra comprensión del desarrollo, la regeneración y la atrofia muscular. Sin embargo, los protocolos actuales para aislar los VE derivados del músculo esquelético (SkM-EV) enfrentan desafíos para lograr una alta pureza y rendimiento, principalmente debido a las dificultades para liberar los EV de los tejidos musculares sin comprometer las membranas celulares. Este artículo presenta un protocolo eficiente para el aislamiento de SkM-EV, que comprende desprendimiento mecánico, disociación enzimática, filtración y ultracentrifugación. Estos pasos están optimizados para mejorar la liberación de EV de los tejidos musculares, produciendo SkM-EV de alta pureza. Posteriormente, se realizan citometría de nanoflujo, ensayo BCA y ensayo Western blot para caracterizar la cantidad y calidad de los SkM-EV aislados. Este protocolo es prometedor para establecer una plataforma fiable para obtener VE derivados de tejidos para avanzar en la investigación básica, el diagnóstico de enfermedades y la administración de fármacos.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son partículas de tamaño nanométrico unidas a la membrana liberadas por las células en el entorno extracelular. Estos VE transfieren ácidos nucleicos, proteínas y lípidos para modular múltiples vías de señalización al ser absorbidos por las células receptoras. En concreto, las VE aisladas del músculo esquelético (SkM-EV) se han implicado en la degeneración, regeneración y crecimiento muscular mediante la transferencia de microARN reguladores miogénicos o factores de transcripción 1,2,3,4. A medida que nuestra comprensión de las subpoblaciones y características de SkM-EV continúa evolucionando, estas vesículas se muestran prometedoras como biomarcadores para el diagnóstico temprano ^5,6 y como objetivos terapéuticos para los trastornos neuromusculares. Este campo en expansión ofrece oportunidades interesantes tanto para la investigación patológica como para las aplicaciones clínicas.

La investigación actual sobre los SkM-EV se centra principalmente en los obtenidos a partir de sobrenadantes de cultivo celular tras el cultivo ex vivo ^2,7,8, lo que plantea preocupaciones sobre la fidelidad de las líneas celulares objetivo después de sucesivos pasos y la susceptibilidad de las características de los EV a la alteración en entornos artificiales. Esto pone de manifiesto la necesidad de aislar los SkM-EV directamente de los tejidos musculares para evitar las influencias del cultivo ex vivo y representar mejor las condiciones in vivo. A pesar de que se han desarrollado varios enfoques para aislar las VE de los tejidos musculares ^9,10, los estudios aún varían significativamente en los detalles del protocolo, lo que afecta la consistencia y la comparabilidad. Se necesita urgentemente un protocolo estandarizado para el aislamiento y la caracterización de SkM-EV a fin de garantizar la fiabilidad de los estudios relacionados.

Teniendo en cuenta las características fisiológicas del músculo esquelético, desarrollamos un protocolo para aislar y purificar SkM-EVs a partir de muestras de músculo esquelético de roedores utilizando desprendimiento mecánico, disociación enzimática, filtración y ultracentrifugación diferencial. A través de un análisis exhaustivo utilizando citometría de nanoflujo, ensayo BCA y ensayo Western blot, descubrimos que este protocolo produce consistentemente SkM-EV de alta pureza y cantidad dentro de un período de tiempo limitado. Se puede aplicar a muestras de músculo esquelético en diversas afecciones, incluidas lesiones musculares agudas y crónicas. Además, con los ajustes adecuados, este método se puede adaptar a los tejidos musculares de pacientes humanos u otros modelos animales. La estandarización del proceso de aislamiento de SkM-EV es esencial para garantizar la consistencia en la calidad de SkM-EV, facilitar las comparaciones de las características de los EV, como el rendimiento, el tamaño, la composición de la carga y la función, y avanzar en sus posibles aplicaciones como biomarcadores de diagnóstico, así como mejorar nuestra comprensión de sus funciones en diversos procesos fisiológicos y patológicos.

Protocolo

Este protocolo aísla vesículas extracelulares (VE) del tejido muscular esquelético mediante desprendimiento mecánico, disociación enzimática, filtración y ultracentrifugación diferencial. Permite el aislamiento de EV de grupos musculares de extremidades de roedores individuales o combinados, incluidos el tibial anterior (TA), el extensor largo de los dedos (EDL), el sóleo (SOL), el gastrocnemio (GAS) y el cuádriceps (QUA). El uso de animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia, y el estudio cumplió con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales en investigación. Los animales fueron alojados en las instalaciones de animales del Departamento de Ciencia Animal y Lechera de la Universidad de Georgia. En este estudio se utilizaron ratones machos adultos de tipo salvaje (C57BL/6J), con tejido extraído de ratones sacrificados a los 3 meses de edad. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Desprendimiento mecánico de grupos musculares del ratón

1. Eutanasia de los ratones con CO₂, seguido de luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Afeita ambas extremidades traseras.
2. Asegure la pata del ratón en una placa estéril con la cara anterior de la pata hacia arriba (Figura 1A).
3. Realice una pequeña incisión (5 mm) en la piel en el lado lateral del tobillo del ratón con unas tijeras de disección.
4. Inserte una hoja de las tijeras con cuidado en la incisión, colocándola debajo de la piel pero no en el tejido muscular subyacente. Luego, corte la piel hacia arriba, hacia la rodilla, para extender la longitud de la incisión.
5. Agarre la piel a lo largo de la incisión con pinzas de punta áspera y expanda la abertura hasta que el músculo sea visible.
6. Ubique el músculo TA, que va desde la rodilla hasta el tobillo en el lado lateral del hueso tibia¹¹, y use pinzas afiladas para agarrar y despegar la capa delgada de tejido conectivo que cubre el músculo (Figura 1B).
7. Cerca del tobillo, identifique los dos tendones en el extremo del TA, uno conectado directamente al músculo TA y el otro, el tendón EDL, que es más pequeño y se encuentra junto al tendón TA en el lado lateral. Corta ambos tendones con unas tijeras de disección.
8. Agarra ambos tendones con unas pinzas ásperas. A continuación, utilice otro par de pinzas rugosas o afiladas para separar los tendones, separando así el TA del EDL (Figura 1C).
9. Levante el TA por el tendón recién cortado con pinzas ásperas. Luego, corte el tendón TA cerca de la rodilla con tijeras de disección, eliminando así el músculo. Repita este proceso para eliminar el EDL y almacene ambos músculos en PBS en hielo.
10. Suelta la pierna y dale la vuelta al ratón para que la cara posterior quede hacia arriba.
11. Con la piel de la pierna ahora parcialmente retirada, corte la piel cerca del tobillo con unas tijeras de disección. Luego, use pinzas de punta áspera para agarrar y pelar la piel hacia arriba hacia la parte posterior de la rodilla, exponiendo el GAS.
12. Corte el tendón GAS cerca del tobillo con unas tijeras de disección (Figura 1D).
13. Sujete el tendón del GAS con pinzas ásperas y levántelo hacia arriba para exponer la parte inferior del GAS.
14. Ubique el pequeño tendón SOL en la parte inferior del GAS, cerca de la rodilla (donde el GAS aún está conectado). Corte el tendón SOL con unas tijeras de disección, haciendo que el SOL se contraiga hacia arriba (Figura 1E).
15. Agarre el tendón SOL cortado con pinzas afiladas y levántelo suavemente, separando así el SOL de la parte inferior del GAS.
16. Corta el extremo del SOL donde se une al extremo cortado del GAS con unas tijeras de disección, separando así los dos músculos. Conserve el SOL en PBS con hielo.
17. Corte el extremo del GAS cerca de la rodilla y colóquelo en PBS sobre hielo.
18. Después de quitar los cuatro músculos enumerados por debajo de la rodilla, voltee el mouse para que la cara anterior quede hacia arriba.
19. Si es necesario, pela más la piel con pinzas ásperas para exponer el QUA. Coloque la pata del ratón en un ángulo de 90° para forzar la flexión del QUA. Corta el tendón más cercano a la rodilla con unas tijeras de disección.
    1. Separe el QUA del fémur cortando entre el músculo y el hueso hasta que el QUA solo esté conectado por el tendón proximal (Figura 1E). A continuación, corte el tendón proximal y retire el QUA. Coloque el QUA en PBS sobre hielo.
20. Asegúrese de que después de los desprendimientos musculares, la tibia y el peroné estén claramente expuestos (Figura 1F).
21. Enjuague los músculos varias veces con PBS para eliminar contaminantes como el pelo y la sangre (Figura 1G). Luego, seca los músculos suavemente con toallas de papel. Utilice una balanza analítica para medir el peso muscular, que se utilizará más adelante para calcular el EV recogido por gramo de músculo.

2. Disociación enzimática de trozos musculares desprendidos

1. Retire suavemente los tendones musculares de la muestra muscular con pinzas afiladas, pinzas para astillas, bisturíes o tijeras (Figura 2A).
2. Después de la extracción del tendón, corte el músculo longitudinalmente a lo largo de las fibras musculares (de tendón a tendón) en trozos de músculo de 1 mm de grosor con unas tijeras o un bisturí para aumentar la relación entre el área de superficie y el volumen (Figura 2B, C).
   NOTA: Trate de limitar el daño de las miofibras durante el corte. En el caso de los músculos más grandes, como el TA, el GAS y el QUA, realice cortes adicionales en comparación con los músculos más pequeños, como el EDL y el SOL, para garantizar una relación superficie-volumen aproximadamente igual en todas las muestras de músculo (Figura 2D).
3. Prepare 10 ml de tampón de enzimas digestivas (DEB) fresco para cada ratón y manténgalo en hielo hasta su uso.
   1. Para preparar DEB, mezcle 2 mg de enzima colagenasa II por 1 mL de Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM) con una solución de penicilina-estreptomicina al 1%. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 μm después de mezclar.
   2. Asegúrese de que el DEB tenga una actividad enzimática de más de 250 unidades. Agite el DEB hasta que la solución esté completamente mezclada y el polvo de la enzima colagenasa II ya no sea visible.
4. Separe el tejido muscular en alícuotas, cada una de las cuales contiene 20 mg de tejido muscular. A continuación, añada 1 mL de DEB a cada alícuota para la disociación enzimática.
5. Incubar la mezcla de DEB y músculo en un agitador en la incubadora a 37 °C durante 12 h a una velocidad de agitación de 100 rotaciones por minuto (rpm) (Figura 2E).

3. Filtración y centrifugación a baja velocidad para enriquecer SkM-EV

NOTA: Ajuste la centrífuga refrigerada a 4 °C y hágala funcionar hasta que alcance la temperatura establecida. Mantenga todos los tubos y muestras necesarios en hielo hasta que estén listos para usar.

1. Siguiendo los procedimientos de digestión enzimática, asegúrese de que no se vean trozos de músculo discernibles (Figura 3A). Antes de la centrifugación refrigerada, extraiga 10 μL de solución de la mezcla DEB-músculo y transfiérala a un tubo de 0,2 mL para realizar pruebas de viabilidad celular si es necesario.
2. Prepare y etiquete los nuevos tubos de microcentrífuga vacíos de 1,5 ml. Configure un filtro de 0,45 μm y una jeringa de 5 ml quitando el émbolo (no lo deseche) y enroscando el cubo en el extremo superior del filtro de 0,45 μm. Coloque el filtro de modo que el extremo inferior se coloque en un tubo vacío recién etiquetado (Figura 3D). Filtre el 1x PBS a través de un filtro de 0,2 μm.
3. Centrifugar la mezcla durante 10 min a 1.000 x g y 4 °C para pellet cualquier residuo (Figura 3B). Transfiera el sobrenadante (alrededor de 1 mL) a la jeringa con una micropipeta P200 (Figura 3C,E).
4. Vuelva a insertar el émbolo de la jeringa y empuje lentamente el sobrenadante a través del filtro, permitiendo que pase y se acumule en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml recién etiquetado (Figura 3F).
5. Vuelva a retirar el émbolo y pipetee aproximadamente 200 μL de 1x PBS en la jeringa.
6. Vuelva a insertar el émbolo y empuje lentamente los 200 μL de PBS 1x a través del filtro (Figura 3G) para eliminar cualquier sobrenadante restante del filtro y dentro del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetado.
7. Repita el proceso de filtración para otros tubos, utilizando un nuevo filtro para cada muestra de tejido.
8. Después de la filtración, asegúrese de que la solución sea transparente y esté desprovista de trozos de músculo residuales (Figura 3H).

4. Ultracentrifugación diferencial para la purificación de SkM-EV

NOTA: Ajuste la centrífuga refrigerada a 4 °C y hágala funcionar hasta que alcance la temperatura establecida. Mantenga todos los tubos y muestras necesarios en hielo y listos para usar.

1. Transfiera la solución filtrada a nuevos microtubos de 1,5 mL (adecuados para hasta 200.000 x g). Equilibre todos los microtubos con 1x PBS adicional para garantizar el mismo volumen antes de colocarlos en la micro-ultracentrífuga.
2. Después de asegurarse de que el volumen de todos los tubos sea igual, cierre los tubos y colóquelos en el rotor de la micro-ultracentrífuga para equilibrarlos (Figura 4A).
3. Encienda la microcentrífuga y configúrela para que funcione durante 1 h a 100.000 x g y 4 °C (Figura 4B).
4. Coloque el rotor cargado con los tubos en la micro-ultracentrífuga, cierre la tapa y encienda el vacío (Figura 4C).
5. Una vez que el vacío alcance el nivel 2, presione el botón de inicio y espere hasta que se complete el proceso de centrifugación (Figura 4D).
6. Una vez completado el ciclo de micro-ultracentrífuga, haga clic en el botón de vacío para represurizar la cámara antes de retirar el rotor y los tubos. Mantenga los tubos en hielo y colóquelos en posición vertical para evitar perturbar el pellet.
7. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una micropipeta P200, evitando perturbar el pellet (Figura 4E).
8. Expulse la punta y, a continuación, añada 50 μL de 1x PBS en el tubo después de retirar el sobrenadante con una micropipeta P200. Para muestras de GAS y QUA, agregue hasta 500 μL de 1x PBS para ayudar a la disolución (Figura 4F).
9. Vuelva a suspender el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P20 (o una micropipeta P200 si se añadieron 500 μL) hasta que se rompa por completo y ya no sea visible.
10. Cierre el tubo y guárdelo a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo (menos de una semana), -80 °C para el almacenamiento a largo plazo, o vuelva a colocar el tubo en hielo si la muestra se va a caracterizar inmediatamente mediante citometría de nanoflujo, Western blot u otros ensayos.

Resultados

Siguiendo este protocolo, se extrajeron con éxito vesículas extracelulares del músculo esquelético (SkM-EV) de varios grupos musculares, incluidos el tibial anterior (TA), el extensor largo de los dedos (EDL), el sóleo (SOL), el gastrocnemio (GAS) y el cuádriceps (QUA) de ratones de tipo salvaje. La caracterización posterior de estos SkM-EV se llevó a cabo mediante citometría de nanoflujo, dilucidando sus características distintivas como se resume en la Tabla 1. Sorprendentemente, a partir de solo 1 g de...

Discusión

El protocolo comienza con la disección de grupos musculares de las extremidades posteriores de ratones o la adquisición de tejido muscular humano post mortem con base en los protocolos disponibles¹⁶. Los siguientes procedimientos de aislamiento de vesículas extracelulares del músculo esquelético (SkM-EVs) comprenden tres secciones principales: digestión enzimática leve del tejido para liberar SkM-EVs intersticiales, filtración y centrifugación a baja velocidad, y ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 0,6	mL ThermoFisher Scientific	05-408-120
Microtubo de 1,5 mL (C)	Eppendorf	5720411009
1,5 mL	ThermoFisher Scientific	3448	Transparente, graduado, no estéril
Jeringa BD de 5 mL	Becton Dickinson	14-827-52	Consejo Luer-Lok
Portaobjetos de recuento de células, doble cámara para contador	de células Bio-Rad	145-0011
Centrífuga 5430R	Eppendorf	22620667
Solución de limpieza	NanoFCM Inc.
Colagenasa II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
DPBS (10x) Líquido (-calcio,-magnesio)	Cytiva	SH30378.02	La dilución final utilizada es 1x
DPBS/Modificado (1x)	Cytiva	SH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Genesee Scientific	25-500
E-POD Pure Dispensador remoto de agua	Millipore Sigma	ZRXSP0D01
FA-45-30-11 Rotor de microcentrífuga	Eppendorf	05-401-503
Fisher Vortex Genie 2	ThermoFisher Scientific	12-812
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 Horno de protocolo general	ThermoFisher Scientific	51028112	Convección por gravedad, 2.3 pies cúbicos 120 V
MemGlow-488 Sonda	Citoesqueleto Inc.	MG01-02
Millipak Millipore Especial	Millipore Sigma	TANKMPK02
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15070063
Pipet-Lite LTS Pipeta L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipeta L-20XLS+	Rainin	17014392
Puntas de pipeta ER LTS 1000µ L F 768G/8	Rainin	30808038
Puntas de pipeta ER LTS 20µ L F 960G/10	Rainin	30807966
Puntas de pipeta ER LTS 200µ L F 960G/10	Rainin	30807967
cuentas de control de calidad	NanoFCM Inc.
S110-AT Rotor de ángulo fijo	ThermoFisher Scientific	45539	1,10,000 rpm
S16 exo 65-155nm	perlas NanoFCM Inc.
Tijeras	SPI, EE. UU.
Micro-Ultracentrífuga Sorvall mX 150+		Contador
TC 20	Bio-Rad	1450102
Solución de Azul de Tripán	Pinzas Pinzas Corning	25-900-CI
	SPI, EE. UU.
Tubos de centrífuga VWR de 15 ml	Avantor	89039-668
Whatman Puradisc 13 Filtros	Cytiva	6782-1304	0.45 µ m tamaño de poro
Ratones C57BL/6J de tipo salvaje	Stock de Jackson Laboratory	#000664