Artículo de método

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

DOI:

10.3791/67445

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11 de octubre de 2024

 , 
1Department of Biochemical Science and Technology, National Taiwan University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo presentado aquí implica el perfil polisomal para aislar translatoma, ARNm asociados con ribosomas, en ARN polisomales y no polisomales de Arabidopsis a través de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Este método demuestra la eficiencia de traslación de Arabidopsis sometida a estrés térmico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El control traslacional de diferentes genes bajo estrés térmico es un paso crítico para la adaptación de las plantas al medio ambiente. La evaluación de las actividades traslacionales de varios genes puede ayudarnos a comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la resiliencia de las plantas, contribuyendo al desarrollo de cultivos con mayor tolerancia al estrés frente al cambio climático global. Este artículo presenta una metodología detallada para evaluar la eficiencia de la traslación a través del perfil de polisomas en plantas expuestas a estrés térmico. El procedimiento se divide en tres partes: tratamiento de estrés térmico para Arabidopsis, prueba de eficiencia de traducción utilizando perfiles de polisomas y cálculo de la eficiencia de traducción mediante el aislamiento de ARN polisomal y no polisomal basado en el perfil. En la primera parte, las plantas de Arabidopsis se someten a condiciones controladas de estrés térmico para imitar los desafíos ambientales. El tratamiento consiste en exponer las plantas a altas temperaturas durante períodos específicos, lo que garantiza una inducción de estrés constante y reproducible. Este paso es crucial para estudiar las respuestas fisiológicas y moleculares de la planta al estrés por calor. La segunda parte consiste en la prueba de eficiencia de traducción utilizando perfiles de polisomas. Los polisomas se extraen mediante centrifugación en gradiente de sacarosa, que separa los ARNm en función de la carga ribosómica. Esto permite examinar la ocupación de los ribosomas en los ARNm, proporcionando información sobre los mecanismos de control de la traducción en condiciones de estrés. En la tercera parte, el ARN se aísla de fracciones polisomales y no polisomales. El ARN de pico se utiliza para medir con precisión la cantidad de ARN en cada fracción. El cálculo de la eficiencia de traducción se realiza comparando la distribución de los ARNm a través de estas fracciones en condiciones normales y de estrés térmico. Las actividades de traducción de genes específicos se evalúan aún más mediante la realización de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con ARN asociado a ribosoma y ARN total. Esta metodología se centra exclusivamente en los efectos del estrés térmico, proporcionando un protocolo detallado para analizar la regulación traslacional en las plantas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La traducción es crucial para que los organismos sinteticen proteínas funcionales a partir de ARNm, apoyando las funciones celulares esenciales y los procesos biológicos como el metabolismo y la señalización y permitiendo las respuestas al estrés. Sin traducción, las células no pueden producir proteínas vitales, lo que afecta su estructura, función y regulación, lo que afecta el mantenimiento de la vida y fomenta la diversidad biológica 1,2. Por lo tanto, el estudio de la eficiencia traslacional de las plantas es crucial. La traducción implica varios pasos esenciales. En primer lugar, la iniciación se produce cuando el ARNm se une a un ribosoma, facilitada por factores de iniciación como los eIFs en eucariotas, que identifican el codón de inicio, normalmente AUG. A continuación, la elongación procede a medida que las moléculas de ARN de transferencia (ARNt), cada una de las cuales lleva aminoácidos específicos, se unen secuencialmente al ribosoma. Los enlaces peptídicos se forman entre los aminoácidos adyacentes, alargando la cadena polipeptídica de acuerdo con la secuencia de ARNm. Finalmente, la terminación se inicia al encontrar un codón de parada (UAA, UAG o UGA), reconocido por factores de liberación que incitan al ribosoma a liberar la proteína recién sintetizada. A lo largo de la traducción, varios factores de iniciación eucariotas (eIF), factores de elongación y ARN ribosómicos trabajan juntos para garantizar la precisión y la eficiencia 3,4.

Estudios previos han indicado que las modificaciones postraduccionales desempeñan un papel fundamental en la regulación de las interacciones entre los eIFs y, por lo tanto, influyen en la eficiencia de la traducción. La investigación in vitro ha revelado que la quinasa CASEÍNA quinasa 2 (CK2) fosforila eIF3c, eIF5 y eIF2β para aumentar sus interacciones entre sí y con eIF1 5,6. En la oscuridad, la ligasa E3 CONSTITUTIVAMENTE FOTOMORFOGÉNICA 1 (COP1) reprime la traducción mediante la inhibición de la fosforilación mediada por TOR de S6K-RPS6. El RPS6 no fosforilado es incapaz de formar ribosomas funcionales, deteniendo así la traducción7. Por el contrario, en condiciones de luz, la quinasa SUPPRESSOR OF PHYA 105 (SPA1) fosforila eIF2α para facilitar el ensamblaje del complejo eIF2 y promover el inicio de la traducción8. Estos hallazgos ponen de manifiesto los complejos mecanismos de control que regulan la traducción en respuesta a las señales ambientales.

Los estímulos ambientales moderados pueden promover eficazmente procesos traslacionales para facilitar el crecimiento, como la fotomorfogénesis 8,9. Sin embargo, cuando los factores ambientales son excesivos, las plantas inmóviles necesitan desarrollar mecanismos regulatorios adecuados para mitigar los daños causados por el estrés ambiental10. En estudios previos relacionados con las respuestas al estrés de las plantas, la mayoría se centró en la regulación a nivel metabólico, hormonal y transcripcional 11,12,13,14. Sin embargo, investigaciones recientes han comenzado a destacar la influencia de la regulación traslacional en la tolerancia al estrés de las plantas 15,16,17. Las plantas pueden aumentar su tolerancia al estrés reduciendo la eficiencia de traslación, minimizando así el consumo innecesario de energía. Debido a la formación de gránulos de estrés no membranosos en las células vegetales, el ARNm no traducido y las proteínas asociadas se agregan dentro de ellos para reducir la eficiencia traduccional18. Uno de los estreses ambientales comunes que las plantas encuentran a menudo es el estrés por calor, que se ha reportado que induce la formación de gránulos de estrés dentro de las células vegetales19,20. El aumento global de las temperaturas medias debido al calentamiento global afecta gravemente el rendimiento de los cultivos21. Por lo tanto, el estudio de la regulación fisiológica de las plantas bajo estrés térmico es crucial. Un estudio anterior ha demostrado que el tratamiento térmico del trigo dio lugar a una disminución del ARNm unido a polisomas. Sin embargo, los ARNm almacenados en gránulos de estrés se liberaron y se volvieron a unir a los ribosomas, lo que facilitó la traducción después de la recuperación22. Además, investigaciones anteriores han comparado la expresión génica entre el ARNm total y el ARNm unido a polisomas en plantas sumergidas16. Los resultados indicaron que los niveles de ARNm en estado estacionario asociados con el ácido abscísico y las respuestas de estrés abiótico aumentaron ligeramente después de la inmersión. Además, la cantidad de ARNm unidos a polisomas aumentó significativamente. Estos resultados sugieren que la regulación de la traslación podría desempeñar un papel más crítico en el control de la tolerancia al estrés en las plantas. Por lo tanto, un método eficaz de aislamiento de ARN polisomal es crucial para estudiar el translatomo de muestras tratadas bajo estrés.

En este protocolo, modificamos el método de aislamiento de ARN de la extracción de fenol/cloroformo voluminoso y de alto riesgo con el método de precipitación de LiCl al método de extracción de fenol/tiocianato de guanidinato a pequeña escala, que requiere menos volumen. El primer método consiste en la mezcla directa con fracciones polisomales, lo que resulta en un residuo experimental de mayor tamaño 9,15,23. Por el contrario, este enfoque modificado utiliza principios de densidad diferencial: el ARN polisomal se mezcla primero con una solución sin azúcar con alto contenido de sal y luego se precipita por ultracentrifugación. Posteriormente, la extracción del ARN se realiza utilizando un pequeño volumen de reactivo de tiocianato de fenol/guanidinio. Este método reduce eficazmente la generación de residuos orgánicos, lo que hace que nuestro experimento sea más respetuoso con el medio ambiente. Además, los disolventes orgánicos utilizados tienen una menor toxicidad. Estas razones nos llevaron a ajustar y mejorar los procedimientos experimentales en consecuencia. Además, los métodos anteriores no proporcionaban un protocolo completo para calcular la eficiencia de la traducción mediante la normalización de picos de entrada, que es esencial para análisis translatómicos más profundos.

Aquí, describimos el perfil de polisomas y el protocolo de aislamiento de ARN polisomal para investigar la eficiencia de la traducción y los análisis translatómicos en Arabidopsis bajo estrés de choque térmico. Este protocolo se empleó para evaluar la eficiencia de la traslación en el tipo salvaje Col-0 en condiciones normales, de choque térmico y posteriores a la recuperación. Los resultados del perfil de polisomas y el porcentaje de ARN polisomal revelaron alteraciones en la eficiencia de traducción después del tratamiento de estrés térmico en plántulas de Arabidopsis .

Protocolo

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1. Preparación de muestras de plántulas de Arabidopsis tratadas con estrés térmico

  1. Placa de 250 semillas para cada réplica y cada condición con un gotero en el papel de filtro colocado en la placa de agar medio basal Murashige y Skoog (MS) sin sacarosa (pH 5,6) suplementada con fitoagar al 1,2%.
    NOTA: Para plantar plántulas en placas MS, se coloca papel de filtro estéril en la placa para evitar que las raíces de las plántulas penetren profundamente en el medio, lo que facilita el muestreo. A continuación, las semillas se plantan sobre el papel de filtro. Para excluir la influencia de los azúcares en el crecimiento de las plantas y los resultados experimentales, se recomienda utilizar un medio MS que no contenga sacarosa para el cultivo.
  2. Envuelva la placa MS que contiene las semillas plantadas con papel de aluminio para bloquear la luz e incube a 4 °C durante 2 días para inducir la vernalización.
  3. Transfiera las semillas vernalizadas a una cámara de crecimiento para cultivar bajo un fotoperíodo claro-oscuro de 16 h: 8 h a 22 °C con una intensidad de luz de 100 μmol/m2/s.
  4. Para muestras de estrés térmico, selle las placas de MS medium que contienen plántulas de 5 días con cinta adhesiva impermeable y colóquelas en un baño de agua a 40 °C durante 1 h.
  5. Para las muestras que se recuperan después del tratamiento térmico, enfríe las placas inmediatamente después del tratamiento térmico. Posteriormente, colóquelos en una cámara de crecimiento a 22 °C durante 2 h.
  6. Coseche 250 plántulas tratadas o sin tratar en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada réplica y congele las muestras en nitrógeno líquido inmediatamente.
    NOTA: Para cada condición, se prepararon dos grupos de muestras. Uno es para los análisis de perfiles de polisomas y el otro es para la extracción de ARN polisomal y no polisomal.

2. Preparación del gradiente de sacarosa

  1. Prepare la solución de gradiente que contenga las siguientes concentraciones de sacarosa: 12,5 %, 24,4 %, 36,3 %, 48,1 % y 60 %. La composición de la solución incluye 50 mM de Tris-HCl, 25 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 100 μg/mL de heparina y 50 μg/mL de cicloheximida (CHX).
  2. Cargue las soluciones de gradiente de alta a baja concentración, comenzando desde la parte inferior y moviéndose hacia arriba. Después de agregar cada concentración de solución de gradiente, congele la solución a un estado sólido antes de agregar la siguiente concentración. Para cada concentración de gradiente de sacarosa, agregue 2.2 mL. Este proceso dará como resultado un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa.
  3. Almacene temporalmente el gradiente de sacarosa preparado a -80 °C y descongele durante la noche a 4 °C antes de usar.

3. Preparación de muestras de perfilado de polisomas

  1. Muele 250 plántulas de Col-0 de 5 días de edad, estresadas por calor o sin tratar, que hayan sido previamente congeladas hasta convertirlas en polvo utilizando un homogeneizador a una frecuencia de 30 ciclos/s durante 1 min.
    NOTA: Cuando el número de plantas con el mismo fondo es igual, tienen el mismo rendimiento de extracción de ARN. Sin embargo, cuando se comparan plantas transgénicas o mutantes con sobreexpresión con diferentes antecedentes, la cantidad de plantas utilizadas debe ajustarse de acuerdo con las condiciones de la planta.
  2. Para obtener una solución de extracción que contenga ARN polisomal y no polisomal, agregue 500 μL de tampón de extracción de polisomas (200 mM de Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM de KCl, 25 mM de MgCl2, 50 μg/mL de cicloheximida, 100 μg/mL de heparina, 2% de PTE, 10% de DOC, 400 U/mL de inhibidor de la ribonucleasa) a cada tubo y mezcle las muestras invirtiendo y en vórtice. Asegúrese de que las muestras se mantengan a 4 °C durante todo el proceso.
  3. Centrifugar la solución de extracción a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min. A continuación, filtre el sobrenadante a través de un colador de células de 100 μm para obtener una solución de extracción clara y sin partículas.
    NOTA: Las partículas presentes en la solución de extracción pueden sedimentarse durante la ultracentrifugación, formando potencialmente una bolita que podría afectar la precisión de las mediciones de perfiles de polisomas.
  4. Cargue el sobrenadante filtrado en un gradiente de sacarosa preparado previamente y asegúrese de que alcance el equilibrio.
    NOTA: Debido a la alta velocidad de rotación de la ultracentrífuga, es esencial garantizar tanto la seguridad como el correcto funcionamiento de la ultracentrífuga. Para lograr esto, es necesario confirmar que los pesos de la muestra sean idénticos antes de la rotación. Por lo tanto, utilizamos una balanza de precisión para verificar que los pesos de los gradientes sean completamente uniformes.
  5. Centrifugar el gradiente de sacarosa cargado con muestras a 4 °C, 210.000 x g durante 3,5 h utilizando un rotor de cubo oscilante ultracentrífugo. Ajuste las tasas de aceleración y desaceleración al máximo. Después de la ultracentrifugación, el ARN polisomal y no polisomal se distribuye según su densidad en la solución de gradiente de sacarosa correspondiente.
    NOTA: En el gradiente de sacarosa, el ARN no polisomal con menor densidad se distribuye en la capa superior, mientras que el ARN polisomal, caracterizado por una mayor densidad debido a la presencia de numerosos ribosomas involucrados en la traducción activa del ARNm, se distribuye en la capa inferior. Posteriormente, el perfil de polisomas se puede medir utilizando un fraccionador de gradiente de densidad.

4. Análisis de perfiles de polisomas

NOTA: Se utiliza un fraccionador de gradiente de densidad con una bomba de jeringa de microvolumen para medir el perfil de polisomas.

  1. Prepare la solución de persecución (70 % de sacarosa, 10 % de glicerol y 0,02 % de azul de bromofenol) para la bomba de jeringa de microvolumen.
  2. Utilice software para controlar el fraccionador de gradiente de densidad. Calibrar la máquina con agua desionizada. Después de la calibración, utilícelo para realizar perfiles de polisomas.
    1. Para realizar el ajuste de la línea de base, encienda el UV/VISDetector hasta que la luz cambie de rojo a verde. Ajusta la perilla "Desplazamiento de la grabadora " para alinear la línea del marcador y, a continuación, gira la perilla " Ajuste de línea base" a la posición de apertura mínima. Coloque la perilla de sensibilidad en el detector UV/VISDETECTOR en el nivel 2.0 y presione el botón Auto Baseline . Finalmente, use la perilla de desplazamiento de la grabadora para ajustar la línea de base deseada a 20. El proceso de calibración variará en función de la marca del mecanismo y de las diferentes muestras.
  3. Después de la ultracentrifugación, coloque los tubos con las muestras en el fraccionador de gradiente de densidad utilizando el sistema de perforación de tubos para que el tubo pueda conectarse a la bomba de jeringa con la solución de persecución y el detector UV.
  4. Cambie el fraccionador de gradiente de densidad al modo de control por software (REMOTE) y ajuste el caudal de inyección de la bomba de jeringa de microvolumen a 3 mL/min.
  5. Inicie la configuración del software para comenzar y obtener el gráfico del perfil de polisomas utilizando el fraccionador midiendo OD254.

5. Aislamiento de ARN polisomal y no polisomal

NOTA: Para esta parte del protocolo, se utilizó un grupo diferente de muestras del mismo lote después de realizar la ultracentrifugación siguiendo los mismos pasos descritos anteriormente.

  1. En función de los resultados de la medición del perfil de polisomas, recoja las fracciones de ARN polisomales y no polisomales por separado. Calcular los volúmenes de solución tanto para las fracciones polisomales como para las no polisomales y recoger la fracción no polisomal (parte superior).
    NOTA: De acuerdo con los perfiles, la fracción con más de dos ribosomas se define como una fracción polisomal, mientras que la fracción con los picos de ARNr 40S, 60S y 80S se define como una fracción no polisomal.
  2. Mezcle bien las fracciones objetivo de ARN con una solución prefría 2x con alto contenido de sal (400 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de KCl, 50 mM de MgCl2).
  3. Añadir 8 μL de stock diluido de control de ARN poli-A eucariota del kit.
    NOTA: Para la normalización de picos necesaria para el séptimo paso. El kit de control de ARN poli-A eucariota incluye genes de B. subtilis , como el gen DAP que no están presentes en las plantas, como genes de referencia. Para determinar la proporción de pérdida de genes de referencia durante la reacción después de la extracción, agregue una cantidad igual del reactivo que contiene una muestra de ARN del gen DAP a diferentes tubos con ARN polisomal o no polisomal antes de la extracción. Esto permite determinar la proporción de pérdida de genes de referencia durante la reacción después de la extracción y se puede utilizar con fines de normalización.
  4. Centrifugar el ARN mezclado en solución salina a 4 °C, 450.000 x g, durante 5 h utilizando un rotor de cubo oscilante ultracentrífugo.
  5. Después de la ultracentrifugación, el ARN se precipitará en el fondo del tubo de centrífuga. Vierta con cuidado el sobrenadante desde arriba para preservar la bolita de ARN en la parte inferior.
  6. Lave rápidamente el pellet de ARN con 500 μL de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) prefría, repitiendo este paso 3 veces.
    NOTA: Para evitar que el agua tratada con DEPC vuelva a disolver el ARN durante el proceso de lavado, es necesario enfriar previamente el agua tratada con DEPC antes de usarla para reducir su solubilidad. Además, se debe minimizar el tiempo de contacto entre el agua tratada con DEPC y el pellet de ARN durante el lavado.

6. Extracción de ARN polisomal y no polisomal

  1. Añadir 500 μL de reactivo de extracción de ARN y mezclar con la muestra de ARN a extraer. Incubar durante 10 min.
  2. Agregue 100 μL de cloroformo, mezcle bien e incube durante 10 minutos para la separación de fases.
  3. Centrifugar la mezcla de reacción a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min. Transfiera la capa acuosa transparente superior que contiene ARN a un nuevo tubo, mézclelo suavemente con un volumen igual de isopropanol e incube a -20 °C durante 2 h para la precipitación de ARN.
  4. Después de la precipitación, centrifugar a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min. Deseche con cuidado el sobrenadante y conserve la bolita de ARN en la parte inferior.
  5. Lave el pellet de ARN con 1 mL de etanol prefrío al 75%. Centrifugar a 4 °C, 12.000 x g durante 10 min, desechar el sobrenadante y secar al aire el pellet de ARN.
  6. Una vez que el pellet de ARN esté seco, vuelva a suspender el pellet de ARN en 30 μL de agua tratada con DEPC y mida la concentración de ARN (OD260) utilizando un espectrofotómetro de espectro completo (220 nm-750 nm).

7. Normalización de picos

  1. Utilice 1000 ng de ARN extraído para la transcripción inversa realizada mediante un kit de qPCR siguiendo las instrucciones del fabricante. Tanto el ARN polisomal como el no polisomal deben transcribirse de forma inversa en ADNc.
  2. Mezcle 1 μL de ADNc con cebadores de genes DAP y use tampón SYBR para medir el nivel de expresión del gen objetivo según las instrucciones del fabricante. A continuación, utilice la PCR en tiempo real para detectar la expresión del gen DAP .
    NOTA: Las secuencias de los cebadores del gen DAP son las siguientes:
    Cebador delantero = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
    Cebador inverso = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
  3. Comparar los niveles de expresión de los genes DAP en los grupos de ARN polisomal y no polisomal medidos y estimar el contenido de ARN en condiciones de pérdida proporcional. Usando el contenido de ARN normalizado, calcule la proporción de ARN en los polisomas.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tipo silvestre de Arabidopsis, Col-0, se cultivó en medio MS bajo un fotoperiodo de luz de 16 h:8 h. Para el control, se utilizaron plántulas de 5 días de edad sin tratamiento de estrés térmico. El grupo de estrés térmico se sometió a 1 h de tratamiento térmico a 40 °C en un baño de agua precalentado, mientras que el grupo de recuperación se colocó a 22 °C durante 2 h inmediatamente después del tratamiento térmico. Al emplear diferentes condiciones de tratamiento térmico y condiciones de recuperación, podemos utilizar los pasos posteriores para medir su eficiencia de traslación.

Antes de la extracción del ARN, primero se debe preparar el gradiente de sacarosa. Para separar el ARN polisomal y no polisomal en función de su diferencia de densidad, preparamos una solución de gradiente con concentraciones de sacarosa de 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% y 60%. A continuación, cargamos las soluciones de gradiente de alta a baja concentración, empezando por la parte inferior (Figura 1A). Posteriormente, podemos utilizar este gradiente para separar el ARN no polisomal de menor densidad en la capa superior, mientras que el ARN polisomal de mayor densidad se distribuirá en la capa inferior con mayores concentraciones de sacarosa. El ARN polisomal y no polisomal se extrajo del Col-0 tratado o no tratado. Para evitar que las partículas de la solución afecten a los resultados del análisis de perfiles de polisomas, la solución que contiene ARN debe filtrarse a través de un filtro celular para obtener una solución de extracción sin partículas. El sobrenadante filtrado se cargó en un gradiente de sacarosa preparado previamente y se equilibró. Después de la ultracentrifugación de las muestras cargadas con gradiente de sacarosa, el ARN polisomal y no polisomal se distribuyó según la densidad dentro del gradiente de sacarosa. Posteriormente, se realizó el perfilado de polisomas utilizando un fraccionador de gradiente de densidad (Figura 1B). El fraccionador de gradiente de densidad se controla mediante un software calibrado inicialmente con agua desionizada. Después de la calibración, las muestras se cargan en el fraccionador después de la ultracentrifugación. Operando en modo de control de software, la bomba de jeringa de microvolumen inyecta solución de sacarosa con concentraciones más altas que el gradiente de sacarosa en el gradiente, empujando la muestra. Esto permite que la medición comience desde la parte superior del gradiente de sacarosa, donde la densidad es menor, y continúe hacia la parte inferior, donde la densidad es mayor. Posteriormente, se activan los ajustes del software para comenzar la adquisición de datos, generando el gráfico del perfil del polisoma a través de la medición de OD254 (Figura 1B). Cuando observamos una mayor intensidad de señal en la fracción polisomal, indica que la muestra exhibe una mayor eficiencia de traducción.

En la Figura 2 se muestran las parcelas de perfilado de polisomas para plántulas de Col-0 de 5 días de edad bajo diferentes tratamientos. Los resultados del grupo control demuestran una clara separación entre la fracción no polisomal y la fracción polisomal (Figura 2A). Sin embargo, después de 1 h de estrés térmico a 40 °C, la intensidad de la señal de la fracción polisomal disminuyó significativamente (Figura 2B). Cuando se permitió que las plántulas tratadas térmicamente se recuperaran a 22 °C durante 2 h, la intensidad de la señal de la fracción polisomal se recuperó a un nivel similar al grupo control (Figura 2C). Nuestros resultados demostraron que el tratamiento de estrés térmico de 1 h redujo significativamente la eficiencia de traslación de las plántulas de Arabidopsis. Sin embargo, las plantas requirieron 2 h de recuperación para restaurar la eficiencia de traslación a niveles comparables a los de las plántulas que no sufren estrés por calor.

Para recopilar más evidencia que compare la eficiencia de traducción de las plántulas de Col-0 en diferentes condiciones de tratamiento, aislamos y extrajimos las fracciones de ARN polisomal y no polisomal. La recolección de fracciones de ARN polisomales y no polisomales se guió por los resultados de las mediciones del perfil de polisomas. Para la extracción de ARN polisomal y no polisomal, utilizamos el reactivo de tiocianato de fenol/guanidinio para extraer las muestras aisladas de ARN polisomal y no polisomal. Con el método de extracción de ARN que utilizamos, podemos obtener ARN estable y de alta calidad para nuestro siguiente análisis (Tabla 1). Posteriormente, normalice el ARN extraído con el kit de control de ARN poli-A eucariota GeneChip para mitigar los errores causados por las diferentes pérdidas de extracción. A continuación, se utilizó la PCR en tiempo real para cuantificar la expresión de los genes DAP , que se incluyen en los genes de B. subtilis añadidos al kit. Se realizó un análisis comparativo de los niveles de expresión génica de DAP entre los grupos de ARN polisomal y no polisomal para estimar el contenido de ARN en condiciones de pérdida proporcional (Figura 3A). Calculamos la relación entre el ARN polisomal normalizado y el ARN total para aclarar la eficiencia de traducción entre ellos (Figura 3B). Finalmente, se calculó la proporción de ARN en los polisomas utilizando el contenido de ARN normalizado (Figura 3C). Los resultados de la proporción de ARN en polisomas bajo diferentes tratamientos con Col-0 exhibieron un patrón consistente con los resultados del perfil de polisomas que se muestran en la Figura 2A. Ambos resultados indican que el estrés térmico reduce significativamente la relación ARN en la fracción polisomal, y este efecto puede revertirse después de una recuperación de 2 h a 22 °C (Tabla 1).

A partir de este método, podemos obtener la fracción completa de ARN polisomal o polisomal con alta calidad en lugar de separar el ARN en fracciones adicionales23. Nuestros resultados también demuestran que tanto los perfiles de polisomas como el porcentaje de ARN en los polisomas pueden reflejar eficazmente la eficiencia de la traducción en Arabidopsis con diferentes condiciones tratadas.

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Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo de perfilado de polisomas. (A) Ilustración esquemática de la preparación del gradiente de sacarosa en un tubo de centrífuga de 13 mL. (B) El diagrama de flujo ilustra el proceso experimental de perfilado de polisomas. En primer lugar, se extrae el translátomo. Posteriormente, el ARN polisomal y no polisomal se separa en función de sus diferencias de densidad mediante ultracentrifugación en gradientes de sacarosa de diferentes densidades. OD254 se mide utilizando un fraccionador de gradiente de densidad para obtener el gráfico de resultados de perfil de polisomas a continuación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Perfil de polisomas de Col-0 en diferentes condiciones. (A, B, C) El perfil de polisomas da como resultado Col-0 en condiciones de (A) sin tratamiento térmico (control), (B) tratamiento térmico a 40 °C durante 1 h y (C) recuperación a 22 °C durante 1 h después del tratamiento térmico. El ARN polisomal y no polisomal se fraccionó utilizando un gradiente de sacarosa del 12,5%-60%. Las posiciones del ARN no polisomal (NP) y polisomal (PL) se indican en los perfiles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Diagrama del flujo de trabajo de extracción de ARN polisomal y no polisomal. (A) Una ilustración de la normalización del ARN por espiga. (B) Una ilustración de la separación de ARN polisomal y no polisomal y el cálculo del porcentaje de ARN polisomal. (C) El porcentaje de ARN polisomal en Col-0 tratado con diferentes afecciones. Las barras de error indican la media ± SD (n=3 repeticiones biológicas). *Valor p < 0,01, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Contenido (ng)260/280260/230
ControlARNNP758.32.192.16
ARNPL302.32.212.13
Estrés por calorARNNP821.52.22.15
ARNPL174.32.192.21
RecuperaciónARNNP797.22.172.16
ARNPL300.92.192.18

Tabla 1: Contenidos y cualidades de ARN polisomal y no polisomal. En esta tabla se analizaron los contenidos y calidades de ARN. El contenido de ARN se normalizó después de la extracción utilizando métodos modificados.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método sencillo y estandarizado para medir la eficiencia de traducción de las plántulas de Arabidopsis. Los pasos críticos de este protocolo son garantizar la estabilidad del ARN con centrifugación secundaria y extracción de ARN, extracción con reactivos, así como una preparación meticulosa del gradiente de sacarosa. Además, proporcionamos pasos críticos para normalizar y cuantificar el ARN polisomal y no polisomal con el método de normalización de picos de entrada. Es muy importante que todos los procedimientos se lleven a cabo en hielo utilizando tampones y herramientas libres de RNasa. Además, asegure la preparación precisa de la concentración de sacarosa y minimice las sacudidas para reducir su impacto en el gradiente. En estudios previos 24,25,26, la investigación sobre las respuestas al estrés se ha centrado predominantemente en análisis transcripcionales y fenotípicos. Con los análisis de perfiles de polisomas, podemos investigar más a fondo la regulación de los procesos de traslación en plantas sometidas a estrés u otros estímulos ambientales.

La comprensión de los procesos traslacionales implica no solo realizar experimentos de perfilado de polisomas, sino también complementarlos con experimentos de etiquetado de azidohomoalanina (AHA). El marcaje con AHA se emplea para investigar la síntesis de proteínas y la actividad traduccional27. El método sustituye los residuos de metionina en las proteínas recién sintetizadas con AHA, un análogo de la metionina que contiene un grupo azida. Las células integran AHA en proteínas recién sintetizadas durante la traducción. Posteriormente, mediante el uso de técnicas basadas en la química de azidas, como la química de clic, las proteínas que contienen AHA pueden etiquetarse y detectarse selectivamente, lo que permite el análisis cuantitativo y la visualización de proteínas que se traducen activamente28. Al combinar el etiquetado de AHA con el perfil de polisomas, los investigadores pueden obtener una visión más profunda de la dinámica de la síntesis de proteínas dentro de las célulasvegetales.

Con este método de aislamiento de ARN polisomal y normalización de picos de entrada, también podemos utilizar el ARN extraído para el análisis de secuenciación de ARN. Al analizar el ARNm unido a polisomas, podemos determinar qué ARNm están experimentando activamente la traducción. Además, la comparación del ARNm en estado estacionario con el ARNm unido a polisomas nos permite identificar genes que están sobreexpresados a nivel de traducción o transcripción. El nivel de expresión del ARNm en estado estacionario refleja la actividad transcripcional, mientras que el ARNm unido a polisomas indica genes que se encuentran activamente en proceso de traducción. La eficiencia de la traducción está influenciada por los estímulos ambientales y las modificaciones postraduccionales 7,8,9,16. Por lo tanto, este método proporciona una comprensión completa de si la proteína objetivo de interés se traduce de manera efectiva. Sin embargo, el límite de este método es que aún habrá una pérdida de ARN durante el procedimiento de extracción. La expresión relativa del ARN de espiga obtenido a través de qRT-PCR también puede dar lugar a ligeros errores de medición. Se requiere más investigación y validación mediante proteómica o Western blot para investigar los aspectos funcionales de la proteína diana.

En resumen, este protocolo representa un método simple que proporciona un enfoque directo con resultados claros para evaluar la eficiencia de la traducción. Es importante destacar que su aplicabilidad se extiende más allá de las plántulas tratadas con estrés térmico para abarcar las plántulas expuestas a otros estímulos ambientales.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconocemos los servicios de investigación técnica de ultracentrífugas de Technology Commons en la Facultad de Ciencias de la Vida y el Centro de Instrumentación patrocinado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Universidad Nacional de Taiwán (Taiwán). También agradecemos a Yu-Ling Liang por el apoyo técnico y a los miembros del laboratorio Cheng por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Young Scholar Fellowship Fellowship Program del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán bajo la subvención No. NSTC 113-2636-B-002-007 a M.-C.C. M.-C.C. agradece el apoyo financiero de la Universidad Nacional de Taiwán.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo Eppendorf de 1,5 mLLabcon3012-870-000-9 Extracción deARN
Tubo de centrífuga de 13,2 mLUltracentrifugaciónBeckman Coulter331372
bromofenol Honeywell32712Perfil de polisoma
CloroformoHoneywell32211Extracción de ARN
Cicloheximida (CHX)Sigma-AldrichSI-C7698Perfil de polisomas
Pirocarbonato de dietilo (DEPC)Sigma-AldrichD5758Extracción de ARN
Etanol Sigma-Aldrich32221Extracción de ARN
GeneChip Eucariota Poli-A Kit de control deInvitrogen900433
Normalización de GlicerolHoneywell15523Heparina de normalización
Sigma-AldrichSI-H3149 Perfil depolisoma
HiScript III RT SuperMix para kit de qPCRVazymeR323-01Normalización
KClJ.T.Baker  3040-01Perfil de polisoma
MgCl2Sigma-AldrichSI-M8266Perfil de polisoma
MS medio basal PhytoM524Cultivo de plantas
Gráfico de picos Bomba de jeringaBrandelSYN4007LSPerfil de polisomas
Polioxietileno-10-Tridecil-éter (PTE)Sigma-AldrichP2393Perfil
de polisomasRNasinPromegaN251BPerfil de polisomas
Desoxicolato de sodio (DOC) Sigma-AldrichSI-D6750Perfil de polisoma
SacarosaSigma-AldrichS5391Perfil de polisoma
SYBR Green SupermixBio-RadBP170-8882Normalización
Reactivo TRI MRCTR118Extracción de ARN
Tris-HClJ.T.Baker  4109-06 Perfil depolisoma
UltracentrífugaBeckman CoulterOptima L-100Kultracentrifugación
UV/VISDETECTORBrandelUA-6Perfil de polisoma
Azul de

Referencias

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