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Artículo de método

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

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DOI:

10.3791/67479

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7 de febrero de 2025

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1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

En este artículo

Resumen

Aquí, proponemos un protocolo simple que combina ingeniería de oligosacáridos metabólicos, química de clic y microscopía de expansión que permite la obtención de imágenes de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares con resolución mejorada utilizando equipos de microscopía de rutina.

Resumen

Las técnicas de marcaje metabólico permiten la incorporación de reporteros bioortogonales en los glicanos, lo que permite la bioconjugación dirigida de colorantes moleculares dentro de las células a través de la química bioortogonal y de clic. La ingeniería de oligosacáridos metabólicos (MOE) ha atraído un interés considerable debido al papel esencial de la glicosilación en numerosos procesos biológicos que involucran el reconocimiento molecular y su impacto en patologías que van desde el cáncer hasta los trastornos genéticos y las infecciones virales y bacterianas.

Aunque el MOE es más conocido por la detección de glicoconjugados de superficie celular, también es una metodología muy importante para el estudio de los glicanos intracelulares en contextos fisiológicos y patológicos. Estos estudios se benefician enormemente de la alta resolución espacial. Sin embargo, la microscopía de superresolución no está disponible en la mayoría de los laboratorios y plantea desafíos para su implementación diaria. La microscopía de expansión es una alternativa reciente que mejora la resolución de la microscopía mediante la ampliación física de muestras biológicas marcadas con marcadores fluorescentes. Al incrustar la muestra en un gel hinchable y hacer que se expanda isotrópicamente a través del tratamiento químico, las estructuras subcelulares se pueden visualizar con mayor precisión y resolución sin la necesidad de técnicas de superresolución.

En este trabajo, ilustramos la capacidad de la microscopía de expansión para visualizar glicanos sialilados intracelulares mediante el uso combinado de MOE y química de clic. En concreto, proponemos un procedimiento para el marcaje bioortogonal y la microscopía de expansión que emplea un indicador dirigido a la sialilación, que puede estar asociado con la inmunofluorescencia para estudios de colocalización. Este protocolo permite estudios de localización de la biosíntesis de sialoconjugados, el tráfico intracelular y el reciclaje.

Introducción

La microscopía de fluorescencia, aunque se usa ampliamente para marcar y visualizar moléculas específicas dentro de las células, está inherentemente limitada en resolución por el límite de difracción de la luz1 de Abbe, que restringe la capacidad de distinguir entre objetos más cercanos a aproximadamente 200-250 nm. Esta limitación surge de la naturaleza ondulatoria de la luz y la apertura numérica de la lente del objetivo del microscopio, lo que presenta un desafío al obtener imágenes de estructuras subcelulares. La superación de estas limitaciones proporciona una mejor comprensión de ciertos procesos biológicos a escala nanométrica.

Para superar el límite de difracción de la luz, se han desarrollado técnicas de microscopía de superresolución como STORM (Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica) y STED (Agotamiento de Emisiones Estimuladas) 2,3. STORM se basa en la activación estocástica de los fluoróforos, lo que permite obtener imágenes solo de un subconjunto disperso en un momento dado. Esto permite la localización precisa de fluoróforos individuales, lo que permite la reconstrucción de una imagen de alta resolución. STED, por otro lado, mejora la resolución mediante el uso de un láser de agotamiento para apagar selectivamente la fluorescencia alrededor de la periferia del punto de excitación, reduciendo efectivamente la función de dispersión del punto.

Estos enfoques contrastan con la microscopía de campo amplio o confocal, en la que se detectan simultáneamente todos los fluoróforos, lo que da como resultado una imagen que combina todos los patrones de difracción y evita la distinción entre fluoróforos individuales cercanos, lo que lleva a una pérdida de resolución. Sin embargo, estos métodos de superresolución requieren fuentes de luz, equipos, preparación de muestras y/o fluoróforos muy específicos, lo que hace que estas tecnologías sean costosas, de difícil acceso en la mayoría de los laboratorios y difíciles de implementar en experimentos de rutina. Estas limitaciones han llevado a la comunidad científica a buscar soluciones alternativas para lograr una mayor resolución, que sean compatibles con los equipos de microscopía fácilmente disponibles y los protocolos de tinción de rutina. En 2015, Boyden y sus colaboradores desarrollaron un método para eludir las limitaciones de la microscopía óptica mediante la expansión física de la muestra, llamado Microscopía de Expansión (ExM)4.

ExM es un método de tres pasos que proporciona detalles a nanoescala de muestras biológicas sin superar el límite de difracción de la luz (Figura 1). En su lugar, utiliza microscopios convencionales limitados por difracción para obtener imágenes de muestras que se han ampliado físicamente de forma isotrópica. El primer paso, llamado gelificación, consiste en incrustar la muestra biológica, generalmente células o tejidos fijos, en un hidrogel de polielectrolito hinchable a base de acrilato de sodio y acrilamida. A continuación, la muestra biológica se somete a un tratamiento enzimático para degradar parcialmente ciertos componentes, como proteínas o membranas, y descomponer las estructuras celulares densas para garantizar que las células puedan expandirse uniformemente. Este paso, llamado digestión, ayuda a lograr esto al homogeneizar los componentes estructurales de la muestra con respecto a las propiedades mecánicas, evitando la expansión diferencial que podría conducir a la distorsión de la muestra. Finalmente, en el último paso, llamado expansión, la muestra incorporada en hidrogel y digerida se coloca en agua desionizada, lo que hace que se hinche. Esta tecnología da como resultado que la muestra se expanda en un factor de aumento lineal de aproximadamente 4-5x en cada dimensión, lo que permite la visualización de detalles celulares finos utilizando técnicas de microscopía estándar. Dada la naturaleza isotrópica de la expansión, la muestra biológica ampliada dentro de la matriz de gel conserva sus detalles geométricos tridimensionales y las relaciones espaciales entre sus diversos componentes estructurales. Por lo tanto, la información espacial se conserva al hincharse, mientras que la distancia entre las etiquetas fluorescentes ancladas en gel o las biomoléculas aumenta uniformemente en todas las direcciones. Esto permite una mejor separación de las señales, lo que da como resultado una resolución mejorada.

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Figura 1: Descripción general del Protocolo ExM. (a) Gelificación: La muestra biológica está anclada e incrustada dentro de un hidrogel de polielectrolito hinchable. b) Digestión: Las propiedades mecánicas de la muestra se homogeneizan mediante el uso de enzimas y detergentes, descomponiendo las proteínas y las membranas lipídicas que, de otro modo, restringirían la expansión y crearían distorsiones. (c) Expansión: El hidrogel se sumerge en agua desionizada, lo que hace que se expanda isotrópicamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Desde 2015, ExM ha experimentado importantes mejoras tecnológicas en la preservación de la información espacial. En particular, se han diseñado varios anclajes moleculares para unir covalentemente biomoléculas directamente al hidrogelhinchable 5,6. En este protocolo, utilizamos N-acriloxisuccinimida (NAS), que reacciona con los grupos amina libres de las biomoléculas (típicamente, residuos de lisina o posiciones N-terminales de las proteínas) para bioconjugar un grupo acriloilo con las proteínas de la célula, incluidas las glicoproteínas. Este grupo acriloilo reacciona con otros monómeros a través de reacciones de reticulación durante la gelificación, anclando estas biomoléculas directamente al polímero.

ExM es compatible con una amplia gama de métodos de etiquetado, incluida la ingeniería de oligosacáridos metabólicos (MOE). El MOE es una poderosa herramienta que permite el marcaje de glicanos mediante la incorporación de análogos de precursores metabólicos dotados de un mango químico bioortogonal7. Estos análogos, conocidos como reporteros químicos, se integran en las vías metabólicas sin causar toxicidad. En el enfoque MOE, los monosacáridos reporteros se procesan metabólicamente en azúcares nucleótidos activados y luego se transfieren a glicoconjugados nacientes. Nuestro enfoque principal se centra en el estudio de la sialilación, en particular la dinámica intracelular y el tráfico de N-glicoproteínas sialiladas, que es crucial en el contexto de la salud y la enfermedad debido a su papel en las interacciones célula-célula, la regulación inmunitaria y el desarrollo. La sialilación anormal está implicada en enfermedades como el cáncer 8,9,10,11, las enfermedades infecciosas12 y los trastornos genéticos 13,14,15, lo que la convierte en un objetivo clave para el desarrollo terapéutico y el descubrimiento de biomarcadores. La comprensión de la sialilación mejora los conocimientos sobre la glicobiología y los mecanismos de la enfermedad.

La sialilación puede ser probada usando MOE con análogos del ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), el ácido siálico más abundante en los seres humanos, o con análogos de la N-acetilmannosamina (ManNAc), un precursor metabólico de Neu5Ac, con un mango bioortogonal 8,16. El ManNAc se convierte en Neu5Ac en el citosol, y luego se activa en ácido citidina-5′-monofosfo-N-neuramínico (CMP-Neu5Ac) en el núcleo. Una vez activadas en un azúcar nucleótido, las sialiltransferasas en el aparato de Golgi transfieren unidades Neu5Ac a las posiciones terminales de las cadenas de glicanos en crecimiento (Figura 2). Tras la incorporación metabólica de derivados no naturales del ManNAc, los glicanos sialilados marcados pueden unirse covalentemente a un fluoróforo que contiene un grupo reactivo complementario al mango reportero mediante química de clic bioortogonal. Esto permite la observación directa de glicoconjugados in vivo o ex vivo.

Para la mayoría de los reporteros de monosacáridos, se requiere una forma peracetilada para atravesar la membrana plasmática a través de la difusión pasiva. Sin embargo, se ha demostrado que tanto los reporteros peracetilados como los no protegidos sondean eficientemente la sialilación16. Los reporteros de sialilación no protegidos son capaces de entrar en las células mediante mecanismos de transporte activos, a saber, la pinocitosis para los análogos de Neu5Ac y un transportador aún no identificado para ManNAc. Si bien los azúcares sin protección requieren una concentración más alta (generalmente 100-500 μM) para lograr efectos comparables, una vez dentro de la célula, pueden ingresar directamente a la ruta metabólica del ácido siálico. Por el contrario, los azúcares peracetilados necesitan ser completamente desacetilados por esterasas intracelulares no específicas antes de volverse metabólicamente activos. Aunque se pueden usar en concentraciones más bajas (generalmente 10-50 μM), la desacetilación incompleta puede interferir con la actividad enzimática o conducir a la incorporación de análogos de ácido siálico parcialmente acetilados, lo que podría sesgar el análisis posterior. Además, la liberación de ácido acético puede afectar el pH localmente, lo que puede afectar la función celular. Chen y sus colegas también han demostrado que los azúcares per-O-acetilados reaccionan con los residuos de cisteína libre en las proteínas a través de un mecanismo no enzimático, lo que lleva a la incorporación fuera del objetivo y al aumento de la señal inespecífica17,18. Por lo tanto, en el presente protocolo, empleamos reporteros ManNAc no protegidos.

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Figura 2: Ingeniería metabólica de oligosacáridos y marcaje de ácidos siálicos. UDP-GlcNAc se convierte en ManNAc por el dominio UDP-GlcNAc 2-epimerasa de GNE/MNK en el citosol. A continuación, el ManNAc es fosforilado en el citosol por el dominio ManNAc 6-quinasa de GNE/MNK para formar ManNAc-6-fosfato. La N-acetilneuraminato sintasa cataliza la condensación de ManNAc-6-P con fosfoenolpiruvato para producir Neu5Ac-9-fosfato, que posteriormente es desfosforilado por la fosfatasa del ácido siálico para producir Neu5Ac. Neu5Ac también puede ser suministrado por la vía de rescate a través de la endocitosis y el reciclaje lisosomal8. Después del transporte al núcleo, se convierte en CMP-Neu5Ac por la CMP-ácido siálico sintetasa. En el aparato de Golgi, CMP-NeuAc es el sustrato de las sialiltransferasas que introducen una fracción de Neu5Ac en las posiciones terminales de los glicanos en los glicoconjugados en maduración, que finalmente se expresan en la membrana celular o se secretan. Los reporteros químicos ManNAz con un mango bioortogonal pueden penetrar en la célula a través de un transportador activo no identificado e ingresar a la vía metabólica. Las unidades Neu5Az marcadas incorporadas en los glicanos después de la biosíntesis se marcan a través de la conjugación mediada por CuAAC de una sonda fluorescente. Abreviaturas: NAc = N-acetilo; UDP-GlcNAc = Difosfato de uridina N-acetilglucosamina; ManNAc = N-acetilmannosamina; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimerasa; MNK = ManNAc 6-quinasa; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosfato; NANS = N-acetilneuraminato sintasa; PEP = fosfoenolpiruvato; Neu5Ac = ácido N-acetilneuramínico; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosfato; NANP = fosfatasa de ácido siálico; CMP = citidina-5′-monofosfato; CMAS = CMP-ácido siálico sintetasa; STs = sialiltransferasas; ManNAz = N-azidoacetilmannosamina; Neu5Az = Ácido N-azidoacetilneuramínico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Entre las posibles reacciones bioortogonales, centramos nuestro interés en la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC)16,19. Según nuestra experiencia, el CuAAC es la mejor opción para el marcaje de glicanos intracelulares en células fijas. Esta reacción está bien establecida, se ha estudiado a fondo en química bioortogonal y se ha estandarizado para su uso en entornos biológicos complejos, lo que proporciona una base sólida de conocimientos y protocolos optimizados. De hecho, su cinética rápida ofrece una alta eficiencia de reacción y especificidad, e involucra grupos azida y alquino que son fáciles de sintetizar, estables, ausentes de los sistemas vivos e inertes a las biomoléculas nativas, lo que lo hace ideal para aplicaciones de celdas fijas donde la toxicidad del cobre no es un problema. La cicloadición de alquina-azida (SPAAC) promovida por cepa20,21, si bien evita la toxicidad del cobre, tiene una cinética más lenta y sondas más voluminosas, lo que tiende a conducir a una señal de fondo más alta y una disminución de la relación señal-ruido para aplicaciones intracelulares debido al atrapamiento hidrofóbico, mientras que la demanda inversa de electrones Diels-Alder (IEDDA)22,23, aunque rápido y sin cobre, implica una síntesis de sonda más compleja y requiere grupos reporteros más voluminosos que aún no se han caracterizado completamente en aplicaciones de MOE. Dado que ExM requiere exclusivamente células fijas, CuAAC ofrece una solución robusta y eficiente para el etiquetado bioortogonal.

En este trabajo se presenta un protocolo para la visualización de glicoproteínas sialiladas intracelulares en células, combinando marcaje metabólico, química de clic bioortogonal y microscopía de expansión. En los procedimientos experimentales descritos en este trabajo, utilizamos N-azidoacetilmannosamina (ManNAz) como reportero químico, y la ligadura de CuAAC de pequeños fluoróforos orgánicos se realiza antes del procedimiento de expansión. Las glicoproteínas se anclan al hidrogel con NAS antes de la gelificación, la digestión y la expansión. El marcaje MOE de los ácidos siálicos puede asociarse con enfoques de inmunofluorescencia para la evaluación de la colocalización, como se ejemplifica aquí con un anticuerpo primario anti-GM130 de ratón localizado en el aparato cis-Golgi. Este protocolo se puede aplicar a células en su estado fisiológico, o a células que han sido sometidas a tratamiento químico. Para ilustrar esto, la cloroquina se utilizó para inhibir la función lisosomal, que afecta el procesamiento y el tráfico de glicoproteínas dentro de las células. La tinción nuclear se utiliza como punto de referencia, no solo para localizar células, sino también como indicador de la calidad del proceso ExM. De hecho, el factor de expansión se puede medir comparando el tamaño del núcleo antes de la expansión (preExM) y la postexpansión (postExM).

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Protocolo

1. Siembra de células

NOTA: Realice los siguientes pasos en condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar. Este método puede aplicarse a cualquiera de las líneas celulares utilizadas en el presente trabajo (HeLa, MCF7, fibroblastos primarios), o a los modelos de líneas celulares más adherentes comúnmente utilizados en investigación 20,24,25.

  1. Cultive células en medio DMEM con alto contenido de glucosa suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) en un matraz T75 a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 .
  2. Una vez que las células hayan alcanzado la confluencia completa, retire el medio de cultivo celular y lave las células con 4 mL de PBS.
    NOTA: Las soluciones de PBS utilizadas en este paso y en todos los pasos de lavado posteriores deben hacerse estériles mediante filtración a través de una membrana de PTFE de 0,2 μm antes de su uso.
  3. Incubar las células durante 5 min a 37 °C en 2 mL de 1x solución de tripsina-EDTA que contenga 0,5 g/L de tripsina, para liberarlas del fondo del matraz.
  4. Agregue 8 ml de medio DMEM con alto contenido de glucosa que contenga un 10% de FBS y mezcle bien para asegurarse de que cada célula se desprenda del fondo del matraz.
  5. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml y centrifuga durante 5 min a 200 × g. Mientras tanto, agregue un cubreobjetos (diámetro 12 mm, espesor 130-160 μm) a cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
    NOTA: El grosor del cubreobjetos debe ajustarse para que coincida con los requisitos del microscopio utilizado en los siguientes pasos de adquisición de imágenes.
  6. Retire el sobrenadante después de la centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo celular.
  7. Determinar el número promedio de células/mL por hemocitometría en al menos dos mediciones.
  8. Diluir la suspensión celular hasta una concentración de 300.000 células por mL en medio de cultivo celular y sembrar 1 mL de la suspensión en cada pocillo.
  9. Deje que las células se asienten durante 24 horas en un medio DMEM con alto contenido de glucosa que contenga un 10% de FBS a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 antes de los siguientes pasos.

2. Tratamiento con cloroquina (opcional)

NOTA: Los pasos 2.1-2.8 ilustran cómo utilizar el protocolo en células tratadas con un reactivo externo (inhibidor, efector, fármaco), utilizando la cloroquina como ejemplo. Omita estos pasos para las células no tratadas con reactivos externos.

  1. Pese la cantidad correcta de sal de difosfato de cloroquina (CQ) para preparar un volumen suficiente de una solución madre de 10 mM.
    NOTA: Realice los siguientes pasos en condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar.
  2. Solubilice el CQ sólido en la cantidad deseada de agua desionizada para una concentración final de 10 mM.
  3. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 μm.
  4. Alicuota 1 mL de la solución madre de 10 mM en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenarlos a -20 °C.
  5. Lave la muestra de células preparada en el paso 1.9 con 1 mL de PBS.
  6. Añadir 100 μL de CQ de 10 mM en 9,9 mL de medio de alta glucosa DMEM que contenga un 10% de FBS, para una concentración final de 100 μM de CQ.
  7. Incubar las células durante 8 h en 1 mL de un medio suplementado con 100 μM de CQ a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 .
  8. Lave las células 3 veces con 1 mL de PBS.

3. Ingeniería metabólica de oligosacáridos

  1. Prepare una solución madre de 5 mM de ManNAz (o ManNAc para la condición de control negativo) en medio DMEM con alto contenido de glucosa que contenga 10% de FBS.
    NOTA: Esta solución madre debe tener un volumen suficiente para que cada pocillo pueda tratarse con 1 ml de solución análoga de azúcar. Lleve a cabo los siguientes pasos en condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar.
  2. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm y almacenar en alícuotas de 1 mL a -20 °C hasta que sea necesario.
  3. Prepare un medio suplementado con 500 μM de ManNAz o ManNAc diluyendo una alícuota de solución madre de 1 mL preparada en el paso 3.2 con 9 mL de medio de alto contenido de glucosa DMEM que contenga 10% de FBS.
  4. Incubar las células preparadas en el paso 1.9 (para experimentos con células no tratadas) o en el paso 2.8 (para experimentos con células tratadas con CQ) en 1 mL del medio suplementado con 500 μM de ManNAz (o 500 μM de ManNAc para el grupo de control) durante 24 h a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 .

4. Fijación y permeabilización

NOTA: Todos estos pasos se llevan a cabo bajo una campana extractora.

  1. Lave las muestras con 1 mL de PBS.
  2. Fije las celdas en cada cubreobjetos añadiendo 500 μL de paraformaldehído al 5%. Déjalo reposar durante 15 min a temperatura ambiente.
  3. Lavar 3 veces con 1 mL de PBS.
  4. Prepare una cámara húmeda personalizada utilizando una caja opaca lo suficientemente grande (por ejemplo, una caja de poliestireno) con tapa. Coloque un trozo de papel secante húmedo en el fondo de la caja y luego coloque una capa de parafilm encima.
    NOTA: La cámara húmeda debe proteger completamente la muestra de las fuentes de luz externas cuando esté cerrada.
  5. Coloque los cubreobjetos en el parafilm, con las celdas hacia arriba.
    NOTA: Etiquete el parafilm con el nombre o la referencia de las muestras con anticipación.
  6. Realice la permeabilización celular utilizando 200 μL de Triton X-100 al 0,5% (v/v) en PBS durante 15 min a temperatura ambiente.
  7. Lavar 3 veces con 200 μL de PBS.

5. Marcaje de fluorescencia

  1. Marcaje de CuAAC de glicanos sialilados marcados
    NOTA: El tampón de reacción de CuAAC debe estar recién preparado antes de su uso, y los reactivos deben agregarse en el orden especificado, con el ascorbato de sodio al final. En soluciones acuosas oxigenadas, los iones Cu(I) formados por la reducción de Cu(II) con ascorbato se reoxidarán gradualmente a Cu(II), lo que provocará una disminución de la concentración de ascorbato con el tiempo. Para mantener la reproducibilidad de los resultados, el tampón no debe almacenarse durante más de unos pocos días a 4 °C y se utiliza preferiblemente el mismo día.
    1. Para etiquetar los glicanos sialilados modificados con azida diseñados en la sección 3, prepare un tampón de reacción de CuAAC que consista en 5 μM de AlexaFluor 488 alquino (AF488Alk), 150 μM de CuSO4, 300 μM de 2-(4-((bis((1-(terc-butil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)ácido acético (BTTAA), 0,1 M K2HPO4 y 2,5 mM de ascorbato de sodio en agua desionizada. Prepare suficiente solución para aplicar 200 μL a cada cubreobjetos.
    2. Agregue 200 μL de tampón CuAAC en cada cubreobjetos para iniciar la reacción. Asegúrese de que la muestra esté cubierta homogéneamente con la gota y déjela reaccionar durante 45 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.
    3. Lavar 3 veces con 200 μL de PBS para detener la reacción y eliminar el exceso de sonda y reactivos.
  2. Tinción de núcleos
    1. Para el marcaje nuclear con Hoechst 33342, diluir una solución madre de 10 mg/ml a 1:2000 en PBS.
      NOTA: Para el mismo efecto, se pueden utilizar contratinciones nucleares equivalentes como el 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
    2. Cubrir las celdas con 200 μL de esta solución e incubar durante 5-10 min a temperatura ambiente, protegidas de la luz.
    3. Lavar 3 veces con 200 μL de PBS.
  3. Tinción de inmunofluorescencia
    1. Prepare un tampón bloqueante de albúmina sérica bovina (BSA) que contenga 0,1 g de gelatina, 1 g de BSA, 1 mL de FBS y 49 mL de PBS para 50 mL de tampón.
    2. Incubar las muestras durante 1 h a 4 °C en 200 μL de tampón de bloqueo BSA. Proteja la muestra de la luz.
    3. Para la tinción por inmunofluorescencia del aparato de Golgi utilizando un anticuerpo anti-GM130 de ratón purificado (epítopo reconocido: Rat GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142), diluir el anticuerpo primario a 1:100 en el tampón de bloqueo BSA preparado.
      NOTA: Este paso se puede adaptar a la tinción por inmunofluorescencia dirigida a otros orgánulos mediante el uso de cualquier anticuerpo primario relevante, en cuyo caso el factor de dilución debe adaptarse según las instrucciones del fabricante.
    4. Añadir 70 μL de la solución que contiene el anticuerpo a los cubreobjetos e incubar durante 1 h a 4 °C, protegidos de la luz.
    5. Lavar 3 veces con 200 μL de PBS.
    6. Diluir el anticuerpo secundario fluorescente (Alexa Fluor 546 anti-mouse IgG) a 1:600 en tampón de bloqueo BSA y añadir 100 μL en cada cubreobjetos.
    7. Incubar las muestras durante 1 h a temperatura ambiente, protegidas de la luz.
    8. Lavar 3 veces con 200 μL de PBS.
    9. Transfiera los cubreobjetos a una placa de 6 pocillos. Almacene las muestras en 2 mL de PBS a 4 °C durante unos días, protegidas de la luz.
      NOTA: se recomienda preparar siempre una réplica exclusivamente para la visualización preExM como referencia con fines de comparación antes y después de la expansión y para asegurarse de que el patrón de etiquetado no se haya distorsionado después de la expansión.

6. Imágenes de preexpansión de muestras

NOTA: Los siguientes pasos dependen del equipo de bioimagen utilizado y es posible que deban ajustarse a los requisitos de la máquina. Siga las reglas del laboratorio local o de la plataforma de bioimágenes. Los pasos 6.1-6.13 aquí se llevan a cabo en un microscopio confocal de barrido láser.

  1. Encienda el microscopio y asegúrese de que las fuentes de luz (láseres) se calienten. Abra el software de adquisición de bioimágenes.
  2. Seleccione las longitudes de onda de excitación láser correspondientes a los fluoróforos para crear los canales (por ejemplo, 405 nm para la tinción nuclear, 488 nm para los glicanos sialilados marcados con AF488Alk y 546 nm para el marcado con inmunofluorescencia). Active los láseres en consecuencia.
  3. Coloque y asegure un cubreobjetos de 32 mm de diámetro (130-170 μm de grosor) en un soporte adaptado al microscopio.
  4. Coloque la muestra preparada en el paso 5.3.9, con las celdas hacia abajo, en el cubreobjetos de 32 mm. Agregue una gota de agua desionizada para evitar que la muestra se seque.
  5. Seleccione una lente de objetivo adecuada, en este caso un objetivo de inmersión en aceite de 63x con una apertura numérica de 1,4 o equivalente.
    NOTA: La apertura numérica más alta proporciona la mejor resolución. Cuando utilice un objetivo de inmersión en aceite, recuerde agregar una gota de aceite entre el objetivo y el cubreobjetos.
  6. Coloque el soporte en la platina del microscopio por encima del objetivo.
  7. Utilice el modo de fluorescencia de campo claro o láser de baja intensidad para localizar un área de interés en la muestra.
  8. Establece el foco.
  9. Visualice las células en el software en modo de fluorescencia en vivo . Ajuste la intensidad del láser para cada canal. Comience con una potencia láser baja para evitar el fotoblanqueo. Aumente lentamente la potencia del láser y ajuste la ganancia y el desplazamiento del detector para amplificar la señal sin introducir ruido excesivo según sea necesario para visualizar la fluorescencia claramente sin sobreexposición.
    NOTA: Los parámetros deben ajustarse para minimizar el ruido de fondo y evitar la saturación de la señal. Es crucial mantener ajustes consistentes en todas las muestras de una serie de experimentos, incluidos los controles negativos.
  10. Establezca los parámetros de la imagen, como el tamaño del agujero de alfiler (p. ej., 1 unidad Airy), la velocidad de escaneo (p. ej., 8), el factor de zoom (p. ej., 1), el rango de valores de brillo (p. ej., 16 bits) y el número promedio (p. ej., 2), el modo (p. ej., línea) y el método (p. ej., media) según sea necesario para alcanzar la observación deseada.
    NOTA: Estos valores dependen del sistema y de la muestra y deben optimizarse antes de la adquisición. El tamaño del agujero de alfiler depende de la apertura numérica, el aumento y la longitud de onda: disminuirlo puede mejorar la resolución a expensas de la relación señal-ruido. Se recomienda establecer la velocidad de escaneo en valores rápidos (correspondientes a un tiempo de permanencia pequeño por píxel) para evitar el fotoblanqueo.
  11. Realice la adquisición y guarde los datos en el formato deseado con los metadatos adecuados para futuras referencias.
  12. Una vez finalizada la adquisición, vuelva a colocar la muestra en la placa de 6 pocillos añadiendo una pequeña cantidad de agua desionizada para facilitar la transferencia con un par de pinzas.
    NOTA: El paso 6.12 solo se lleva a cabo si es necesaria la expansión de esta muestra en particular. De lo contrario, deseche el ejemplo y use otras réplicas para los pasos siguientes.

7. Protocolo de microscopía de expansión

NOTA: Las muestras se protegen lo más posible de la luz para evitar el fotoblanqueo. Los pasos de anclaje y gelificación se realizan bajo una campana extractora.

  1. Anclaje
    1. Incubar las muestras con N-acriloilsuccinimida (NAS) a una concentración de 3,2 mg/mL en PBS en un agitador mecánico durante 1 h a temperatura ambiente. Prepare una cantidad suficiente de solución para añadir 500 μL de solución por pocillo (solución madre: 16 mg/mL NAS en DMSO).
      NOTA: El NAS reacciona con los residuos de lisina y los N-terminales de las proteínas para injertar un grupo acriloilo, lo que permite que las proteínas se anclen al hidrogel en los pasos posteriores.
    2. Lavar 3 veces con 1 mL de PBS.
  2. Gelificación
    1. Prepare una solución de monómero compuesta de la siguiente manera: en 50 mL de 1x PBS (pH 7,4), agregue 5,843 g de NaCl, 1,25 g de acrilamida, 0,075 g de bis-acrilamida y 4,313 g de acrilato de sodio. Prepare suficiente solución para aplicar 70 μL a cada cubreobjetos. Congelar 1 mL de alícuotas al menos 24 h antes de la gelificación.
      PRECAUCIÓN: Los monómeros son tóxicos; Deben manipularse con cuidado con el equipo de protección adecuado y pesarse bajo una campana extractora.
    2. En una pieza de parafilm, se coloca una gota de 70 μL de solución de monómero, seguida de la adición de 1,4 μL de 10% (v/v) de N,N,N',N'-tetrametilenilendiamina (TMEDA), luego 1,4 μL de persulfato de amonio (APS) al 10% (p/v), que se mezclan en la gota.
      NOTA: Los reactivos de reticulante deben agregarse en este orden específico, primero TMEDA y luego APS.
    3. Rápidamente, coloque el cubreobjetos con cuidado sobre la solución con las celdas hacia abajo.
    4. Deje que la solución polimerice durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara húmeda.
  3. Digestión
    1. Prepare una solución tampón para la digestión compuesta por 1x tampón TAE, Triton X-100 al 0,5% (v/v), 0,8 M de guanidina HCl y 8 U/mL de proteinasa K.
      NOTA: El tampón de digestión debe estar recién preparado y preincubado durante 30 min a 37 °C antes de su uso.
    2. Añadir 1 mL de tampón de digestión al hidrogel formado en el paso 7.2. Deje que la digestión continúe durante 3 h a 37 °C en un agitador mecánico.
    3. Retire el tampón de digestión y lave suavemente el gel 3 veces con 2 ml de agua desionizada.
      NOTA: El hidrogel se expandirá ligeramente y se desprenderá del cubreobjetos.
  4. Expansión
    1. Dejar que el hidrogel se expanda en 3 mL de agua desionizada durante 2 h. Cambia el agua cada 30 min.

8. Imágenes posteriores a la expansión de las muestras

  1. Coloque un cubreobjetos de 32 mm de diámetro (130-170 μm de grosor) y asegúrelo en un soporte.
  2. Corta un trozo de hidrogel y colócalo en el cubreobjetos, con las células en el fondo del gel.
    NOTA: Las piezas extirpadas deben ser lo suficientemente grandes como para proporcionar una superficie adecuada para la observación, pero no demasiado grandes, ya que esto podría dificultar la manipulación del gel y aumentar el riesgo de rotura (tamaño recomendado: 5 a 8 mm). Coloque suficientes piezas de hidrogel para cubrir toda la superficie del cubreobjetos; Esto ayudará a asegurar las piezas en su lugar y evitará cualquier deriva durante la toma de imágenes. En caso de problemas de deriva, la precapa de los cubreobjetos con poli-D-lisina podría resultar ventajosa6.
  3. Coloque el soporte en la platina del microscopio por encima del objetivo.
  4. Realice la adquisición de imágenes en un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de inmersión en aceite como se describe en el paso 6.

9. Cálculo del factor de expansión (EF) en ImageJ

  1. Abra los datos de imagen en el software gratuito ImageJ o equivalente.
  2. Si trabaja en una imagen de varios canales, divida los canales y trabaje solo en el canal del núcleo navegando a Seleccionar imagen | Colores | Canales divididos.
  3. Para medir el diámetro del núcleo, resalte la señal correspondiente al núcleo determinando un umbral haciendo clic en Seleccionar imagen | Ajustar | Umbral.... Elija un método en el menú desplegable predeterminado que mejor se adapte a la imagen (por ejemplo, Otsu) y ajuste el umbral hasta que la forma del núcleo se corte claramente del fondo.
    NOTA: La configuración del umbral debe ajustarse para cada imagen, ya que es posible que una configuración no se ajuste a todas las imágenes o a todas las muestras.
  4. Configure la medida para determinar el diámetro de Feret haciendo clic en Seleccionar Analizar | Establecer medidas.... En el menú, seleccione Diámetro de Feret y ajuste el decimal si es necesario.
  5. Para comenzar el análisis de la imagen, haga clic en Seleccionar Analizar | Analice las partículas para establecer el tamaño de las partículas; Para el núcleo, elija 5-infinity μm² | Mostrar resultados | Añadir al gestor | Excluir en bordes y superposición. Inicie el análisis.
  6. A medida que comienza el análisis, aparecerán varias ventanas. En la ventana de resultados, busque el diámetro máximo de Feret de cada núcleo en la columna Feret. Copie y pegue los datos sin procesar en una hoja de cálculo y calcule el tamaño medio del núcleo para muestras preexpandidas y expandidas .
    NOTA: Asegúrese de que las regiones de interés (ROI) correspondientes a cada núcleo sigan toda la periferia del núcleo.
  7. Calcule el factor de expansión (FE) de la siguiente manera:
    EF = figure-protocol-1
    NOTA: El factor EF determina cuánto se ha expandido la muestra.

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Resultados

A continuación se muestra la aplicación del protocolo para visualizar glicoproteínas siadiladas en células HeLa (Figura 3A) y células MCF7 (Figura 3B), omitiendo el tratamiento con CQ (sección 2 del protocolo) y la tinción de colocalización con inmunofluorescencia (paso 5.3 del protocolo).

figure-results-1

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Discusión

El protocolo de marcaje actual de CuAAC no incluye aminoguanidina en el tampón de reacción. Dado que está dirigido a visualizar glicoconjugados intracelulares, se realiza en células que se fijan después de la etapa de incorporación metabólica, para evitar cualquier problema de citotoxicidad y mejorar la absorción del sistema catalítico. El uso de aminoguanidina se recomienda típicamente para el marcaje de la superficie celular de células vivas para prevenir reacciones secundarias entre el dehidroascorbato y los residuos ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a las instalaciones de TisBio y a la plataforma PLBS por proporcionar el entorno técnico propicio para lograr este trabajo. Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones del CNRS y del Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Nos gustaría agradecer al Dr. François Foulquier, al Dr. Zoé Durin, a la Sra. Dorothée Vicogne y a la Sra. Céline Schulz por estimular las discusiones y por proporcionarnos la línea celular Fibroblast 533T y el anticuerpo primario GM130.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(+) L-ascorbato de sodioSigma Aldrich11140
placa de cultivo celular de 12 pocillosCorning3513
AcrilamidaSigma AldrichA8887
Ácido acrílico N-hidroxisuccinimida éster Sigma AldrichA8060
Alexa Fluor 488 alkyne Jena BioscienceCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 cabra anti-ratón IgGInvitrogenA11003
Persulfato de amonioSigma Aldrich9913
Bis-AcrilamidaSigma Aldrich146072
BSASigma AldrichA7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
Tubo de centrifugación 2 mLEPPENDORF30120094
Sal de difosfato de cloroquinaSigma AldrichC6628
Tubo cónico 15 mLCubreobjetos de 352097
12 mm #1eprediaCB00120RA120MNZ0
cubreobjetos 32 mm #1eprediaCB00320RA140MNZ0
CuSO4Sigma Aldrich209198
DMEM medio de alta glucosa DutscherL0104-500
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco DutscherL0615-500
Suero fetal bovinobiowestS1810-500
Fibroblasto 533T--Recogido de individuos sanos
FIJI ImageJ 2.9.0--
GelatinaBio-RAD170-6537
Guanidina HClSigma Aldrich50950
Células HeLaATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2--
K2HPO4EuromedexPB0447-B
Microscopía confocal anhidra LSM 780 Zeiss-MCF7
ATCCHTB-22
N-acetilmannosamina (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
NaClCarlo Erba479687
N-azidoacetilmannosamina (ManNAz)BIOSYNTHMA46002
Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Aceite DIC M27Zeiss420782-9900-799 
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10xEuromedexET330
proteinasa KSigma AldrichP2308de  Tritirachium álbum
purificado ratón GM130 anticuerpoBD Bioscience61082250 y micro; g
Acrilato de sodio Sigma Aldrich408220
T75 FrascoCorning430641
TEMEDSigma AldrichT9281
tris Acetato EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
Triton X-100Sigma AldrichX-100
Trypan AzulDutscher702630
Trypsine-EDTA 1xDutscherL0930-100
Falcon

Referencias

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