Artículo de método

Un flujo de trabajo rápido y sencillo para la cuantificación de estructuras externas de Drosophila adulta

DOI:

10.3791/67485

⸱

8 de noviembre de 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, San José State University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un flujo de trabajo rápido y de bajo costo para obtener imágenes de alta resolución de ojos de Drosophila adultas para cuantificar los patrones y los defectos de crecimiento. Describimos nuestro protocolo para la preparación de muestras mediante montaje en punto, adquisición de imágenes de alta resolución y análisis de imágenes.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ojo compuesto de Drosophila es un tejido con un patrón preciso que ha revelado mecanismos moleculares y procesos biológicos que impulsan la morfogénesis. Es una estructura simple de ojos unitarios repetitivos, denominada omatidios, que se utiliza para caracterizar las interacciones genéticas y las funciones de los genes. Las mutaciones que afectan a la arquitectura del ojo pueden detectarse y analizarse fácilmente; Por lo tanto, este sistema se utiliza con frecuencia en instituciones de escasos recursos. El análisis fenotípico adicional a menudo incluye un microscopio electrónico de barrido (SEM) para generar imágenes de gran aumento adecuadas para el análisis cuantitativo. Sin embargo, los SEM son caros y requieren reactivos costosos; La preparación de la muestra dura días; Y, a menudo, necesitan personal a tiempo completo para la preparación de muestras y el mantenimiento de los instrumentos. Esto limita su utilidad en instituciones de escasos recursos o durante la austeridad presupuestaria. En entomología, el uso de tecnología de imágenes digitales de alta resolución es una práctica común para la identificación y caracterización de especies. Este artículo describe un método que combina estrategias y permite la obtención de imágenes digitales de alta resolución de estructuras adultas de Drosophila y el análisis cuantitativo utilizando el software abierto ImageJ. El flujo de trabajo es una alternativa rápida y amigable para los estudiantes que remedia las limitaciones de las instalaciones de investigación con fondos y recursos insuficientes con un enfoque rápido y rentable para el análisis fenotípico cuantitativo.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster es un poderoso organismo modelo genético que se ha utilizado durante décadas para dilucidar las vías de señalización molecular y los comportamientos celulares. Muchas de las vías de señalización conservadas evolutivamente que son esenciales para el desarrollo multicelular se identificaron por primera vez y se definió su mecanismo de acción en Drosophila. Alrededor del 65-75% de todos los genes asociados a enfermedades humanas tienen ortólogos en Drosophila 1,2. El ojo adulto de Drosophila es un modelo importante que ha permitido realizar cribados genéticos imparciales que facilitaron el descubrimiento de importantes genes conservados implicados en enfermedades humanas, como el cáncer 3,4, la neurodegeneración5 y los trastornos metabólicos6.

El ojo de Drosophila está compuesto por ~800 ojos unitarios, denominados omatidios, que están dispuestos con precisión en un patrón hexagonal a lo largo de la superficie del ojo adulto7. Cada omatidio está compuesto por ocho neuronas fotorreceptoras que ocupan una ubicación distinta dentro de un trapecio asimétrico. Estos están respaldados por cuatro células de cono no neural y dos células pigmentarias primarias que secretan lente y pseudocono para enfocar la luz en los rabdomeros sensibles a la luz de las neuronas fotorreceptoras. Los omatidios vecinos están separados por una sola fila de células reticular interomatidiales, compuestas por células pigmentarias secundarias, células pigmentarias terciarias y complejos de cerdas mecanosensoriales 8,9,10.

Las perturbaciones en el desarrollo del ojo son visibles en los ojos de los adultos como un aumento o disminución del tamaño del ojo, una abundancia o estructura anormal de lentes o cerdas, o como un "ojo áspero" en el que el patrón hexagonal normalmente invariante se interrumpe de tal manera que ya no se puede seguir una fila de omatidios a través de la superficie del ojo. Estos fenotipos se pueden marcar a nivel de tejido macroscópico utilizando microscopios de disección. El análisis detallado de los fenotipos incluye tradicionalmente la microscopía electrónica de barrido seguida del análisis cuantitativo de imágenes11. Sin embargo, la microscopía electrónica de barrido requiere instrumentación costosa, reactivos costosos, preparación de muestras que dura días y, a menudo, personal de tiempo completo para mantenerla.

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Figura 1: Flujo de trabajo para obtener imágenes de estructuras adultas de Drosophila . (A) Recolectar y fijar Drosophila adulta en etanol al 70%. (B) Prepare las muestras para la obtención de imágenes mediante el montaje en puntos y la fijación a los pines. (C) Adquirir imágenes de alta resolución a través del apilamiento de enfoque y la integración. (D) Cuantificar imágenes usando FIJI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este documento presenta un flujo de trabajo que es relativamente económico, tiene un tiempo corto de preparación de la muestra, se puede configurar fácilmente en una mesa de laboratorio de 3 pies, no requiere materiales peligrosos y podría ser una adición duradera a los laboratorios de investigación de Drosophila (Figura 1). El montaje en punta es una técnica entomológica utilizada para secar al aire y preservar pequeños insectos de cuerpo blando, como Drosophila12. Este método se basa en la combinación de objetivos de microscopio con cámaras DSLR de alta resolución para aumentos efectivos de 10x a 1,000x. La limitada profundidad de campo inherente a la macrofotografía se supera mediante el apilamiento de enfoque: unir una serie de imágenes con el plano focal moviéndose a través del espécimen de interés13. Este método produce imágenes de alta resolución adecuadas para la cuantificación de fenotipos y podrían adaptarse fácilmente a otras estructuras de interés, como el ala, la pata, el tórax y el abdomen. El flujo de trabajo de análisis de imágenes utiliza el programa gratuito de análisis de imágenes FIJI (NIH ImageJ). Esta metodología hace que la preparación de muestras, las imágenes de alta resolución y el análisis sean accesibles para estudiantes de pregrado y científicos de instituciones de escasos recursos.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Recolección y fijación de Drosophila adulta

  1. Coloque cruces de Drosophila o cepas seleccionadas y colóquelas en viales que contengan alimento para moscas. Incubar los viales a la temperatura deseada (normalmente 25 °C) hasta que las moscas se hayan desarrollado y los adultos se cierren (~10-14 días a 25 °C).
  2. Anestesia a las moscas con CO2 y colócalas en una almohadilla de CO2 .
  3. Clasifique las moscas con una pluma y seleccione los individuos con el fenotipo deseado (por ejemplo, alas rectas). Haga un clasificador de moscas de plumas recortando una pluma de ganso para que quepa en el extremo cónico de una pipeta serológica de 1 mL.
  4. Prepare un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL con 1 mL de etanol al 70%. Coloque las moscas seleccionadas en el tubo de microcentrífuga y póngalas en hielo. Almacene los tubos de microcentrífuga a 4 °C durante la noche (Figura 2A).
    NOTA: No conserve las moscas en etanol durante más de 24 h. El almacenamiento a largo plazo de las moscas en etanol al 70% provocará la pérdida de pigmento ocular y corporal.

2. Preparación de la muestra mediante montaje puntual

NOTA: Drosophila son insectos de cuerpo blando que se vuelven quebradizos y colapsan cuando se secan al aire; Por lo tanto, este protocolo requiere que las muestras se tomen imágenes el mismo día en que se montan. Trabaje en pequeños grupos de ~ 5 moscas a la vez para evitar la pérdida de muestras. Aumente el número de muestras de un conjunto en función de la eficiencia. Las muestras que requieren más tiempo antes de la obtención de imágenes pueden deshidratarse mediante una serie de concentraciones crecientes de hexametildisilazano (HMDS)14.

  1. Corte pequeñas puntas triangulares (7,1 mm x 2,7 mm) de cartulina de archivo de 65 lb con un punzón especializado. Prepare los puntos doblando la punta (el 25 % más estrecho) en un ángulo de 90° con pinzas de punta fina Dumont #5 (Figura 2B).
  2. Con las pinzas de punta fina Dumont #5, retire las moscas de los tubos de la microcentrífuga (paso 1.4). Seque suavemente las moscas con un pañuelo de laboratorio sin pelusa para eliminar el exceso de etanol. Coloque cada mosca en su lado izquierdo en una tarjeta de índice bajo un microscopio de disección.
    NOTA: Retire las moscas del tubo sujetándolas a una estructura anatómica que no sea el área de interés: al obtener imágenes de la cabeza, sostenemos las muestras por el ala o la pata. No sujete las muestras por el abdomen, ya que esa estructura se utiliza para pegar la mosca en la punta de la tarjeta.
  3. Prepare el pegamento para pieles, ajustando su consistencia a la viscosidad deseada. Mezcle 1-2 gotas de pegamento para pieles con 1-2 gotas de agua desionizada (DI) y mezcle con una pipeta de transferencia en una ficha. Tome una punta de tarjeta preparada en el extremo ancho con pinzas y coloque una pequeña cantidad de pegamento diluido en la punta doblada de la punta frotándola en la mezcla de pegamento y agua (Figura 2C).
    NOTA: El pegamento debe ser untable pero no líquido.
  4. Aplique la punta doblada de la punta en la cara anterior del abdomen derecho alrededor de los segmentos abdominales 2-3 (Figura 2C). Antes de que el pegamento se seque, haz ligeros ajustes a la mosca de modo que el eje antero-posterior de la mosca quede perpendicular a la punta doblada de la punta.
  5. Inserte un pasador de montaje No. 3 en el extremo ancho de la punta de la tarjeta (Figura 2D) y asegúrelo a un bloque de clavijas para insectos (Figura 2E). Etiquete cada alfiler o fila de alfileres con el genotipo correspondiente.

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Figura 2: Preparación de la muestra. (A) Las Drosophila adultas se clasifican en función de los marcadores fenotípicos y se recogen en tubos de microcentrífuga marcados que contienen un 70% de etanol en hielo. Las moscas se almacenan a 4° C durante la noche. (B) Las puntas de las tarjetas de papel se preparan doblando el extremo estrecho 90° del resto de la tarjeta con un par de pinzas #5. (C) Las moscas se recuperan de los tubos y se dejan secar brevemente al aire. El pegamento para pieles se aplica en el extremo pequeño y doblado de la punta de la tarjeta preparada y se pega a la mosca adulta en los segmentos abdominales 2-3. (D) Los especímenes se montan, con una etiqueta de identificación, en un alfiler de insectos de acero inoxidable # 3. (E) Los especímenes fijados se almacenan en una placa de muestra hasta que estén listos para la adquisición de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Adquisición de imágenes de apilamiento de enfoque de alta resolución

  1. Adquiera fotografías de alta resolución de ojos de mosca con un sistema de imágenes de apilamiento de enfoque ensamblado y personalizado, ensamblado y personalizado.
    1. Capture fotografías con un cuerpo de cámara DSLR con un teleobjetivo de 70-200 mm conectado a un objetivo de microscopio Apo de 20x a través de un adaptador de lente de 77 mm.
    2. Asegúrese de que la muestra esté iluminada con un destello a través de un difusor (Figura 3).
    3. Controle la posición Z mediante un controlador Stackshot y un Macro Rail.
    4. Conecte la cámara, el flash y la platina motorizada a un trípode de aluminio anodizado de alta resistencia.
  2. Coloque cada muestra montada en un punto en un cardán de etapa universal con la cabeza orientada de modo que el ojo mire hacia la lente. Realice ajustes en la posición de la cabeza moviendo suavemente la cabeza con las pinzas.
    PRECAUCIÓN: Los ajustes grandes y rápidos pueden resultar en una decapitación accidental.
  3. Con la cámara conectada a una computadora portátil, ajuste la configuración de adquisición en el software. Fotografíe muestras con un aumento de 20x con estos ajustes: Potencia del flash 1/32, Velocidad de obturación 1/200, Apertura F2.8 e ISO 400. Asegúrese de que todas las funciones de enfoque automático y estabilización de imagen estén desactivadas.
    NOTA: Estos ajustes equilibran la iluminación óptima del flash, la velocidad del obturador y la profundidad de campo. Tendrían que ajustarse para otros aumentos y/o combinaciones de lentes.
  4. Establezca la ubicación para guardar la pila de imágenes resultante (10-50 imágenes) en la carpeta de archivos deseada. Asegúrese de que haya suficiente capacidad de almacenamiento para las imágenes (~8,5 MB por imagen).
  5. Ajuste la configuración de la pila de enfoque en la unidad de control Stackshot en el modo de distancia automática .
    1. Establezca el tamaño del paso en 5 μm y calcule el número de pasos estableciendo las posiciones de inicio y parada de la pila de enfoque.
    2. Visualice el espécimen en el modo LiveView y con la cámara en el modo de disparo automático para identificar las posiciones de inicio y parada.
    3. Mueva el riel de modo que la parte más cercana del espécimen esté enfocada (establecer la posición inicial ) y, a continuación, desplácese hasta donde esté enfocada la entidad más lejana de interés (establecer la posición final ).
  6. Vuelva a colocar la cámara en el modo de disparo manual e inicie la adquisición de imágenes desde la unidad de control Stackshot.
    NOTA: El tiempo de adquisición de la imagen depende del tamaño del espécimen. Cuanto mayor sea la profundidad de campo necesaria para muestras grandes, más cortes se incluirán en la pila de imágenes, lo que extenderá el tiempo total de adquisición.
  7. Abra archivos en el software de apilamiento de enfoque al que se hace referencia. Genere una imagen apilada haciendo clic en Apilar | Alinear y apilar todo (PMax).
  8. Guarde la imagen final en el disco duro del ordenador como un archivo .tif haciendo clic en Archivo | Guarde la imagen de salida.
    NOTA: Dependiendo de la resolución del archivo de imagen apilado y del número de muestras de las que se haya creado una imagen, es posible que se necesiten discos duros externos grandes (1 TB) para la copia de seguridad de la imagen. En este protocolo, las imágenes apiladas son de aproximadamente 100 MB cada una antes de ser comprimidas.

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Figura 3: Adquisición de imágenes. (A) Aparato de imagen con partes etiquetadas de la siguiente manera: a) Cuerpo de la cámara DSLR; b) teleobjetivo; c) 20 objetivos y adaptadores de microscopio Apo; d) Destello; e) Difusores de lentes y cúpulas; f) Controlador de tiro apilado, Macro Rail y Etapa giratoria; g) Gimbal de escenario universal; h) Trípode. (B) Aparato de imagen con difusor de luz en su lugar. (C) Primer plano de la muestra montada en posición para la toma de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Flujo de trabajo de análisis FIJI para calcular el área ocular de un adulto

  1. Para el análisis de imágenes, obtenga el software FIJI15 en el sitio web de ImageJ.net.
  2. Elija imágenes para el análisis en las que el ojo esté centrado y alineado con una iluminación adecuada y un desenfoque periférico mínimo, lo que indica una alineación adecuada con la cámara.
  3. Calibra la escala de la imagen.
    1. Descargue la imagen de la barra de escala para un aumento de 20x que se correlaciona con 500 μm. Alternativamente, en el momento de la adquisición de la imagen, fotografíe una regla utilizando los mismos ajustes. Abra la imagen en el software FIJI.
    2. Mida la longitud de la barra de escala (Figura 4A). Usa la Herramienta Línea Recta para trazar exactamente la línea. Haga clic en Analizar | Medir. Esta distancia de píxeles es equivalente a 500 μm (Figura 4B).
    3. Calcule píxeles por micra. Utilícelo para convertir las mediciones de píxeles en mediciones micrométricas.
  4. Abra el archivo de imagen apilado en FIJI (Figura 4C).
  5. Seleccione Lupa en la barra de herramientas para ampliar el área de enfoque. Trate de llenar la pantalla con el ojo y la cutícula de la cabeza circundante inmediata (Figura 4D).
  6. Seleccione Herramienta de selección a mano alzada en la barra de herramientas. Delinee el área de la retina lo más cerca posible, siguiendo los contornos de la fila más externa de omatidios (Figura 4E). Para eliminar parte de la selección, mantenga presionado el botón de opción y seleccione los píxeles que desea eliminar. Para agregar a la selección, mantenga presionados los botones de opción y cambio y seleccione los píxeles que desea agregar.
  7. Para calcular el área, seleccione Analizar | Mida desde el menú superior (Figura 4F). Aparecerá una nueva ventana con los parámetros de área, media, mínimo y máximo . Copie y pegue estos datos en una hoja de cálculo para documentarlos y convertirlos de píxeles a micrómetros.
  8. Realizar análisis estadísticos adecuados.

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Figura 4: Análisis de imágenes en FIJI. (A) Escalar la imagen original. Descargue la imagen de calibración y mida la longitud de la barra de 500 μm. (B) Ajuste la escala usando la función Establecer escala . (C) Abra la imagen apilada. (D) Amplíe la imagen para que el ojo esté centrado y casi en pantalla completa. (E) Utilice la herramienta Selección a mano alzada para delinear el ojo en el borde entre la fila más externa de omatidios y la cutícula circundante. (F) Mida el área dentro de la región seleccionada haciendo clic en Analizar | Medir | Área. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ojo de Drosophila es un excelente sistema modelo para estudiar el patrón de tejidos, el control del crecimiento y la muerte celular. Recientemente hemos publicado un estudio que investiga cómo el pH intracelular (pHi) influye en el crecimiento de los tejidos. En primer lugar, establecimos un sistema genético en el que la sobreexpresión del intercambiador de sodio-protones DNhe2 (el ortólogo del NHE1 de los mamíferos) en el ojo en desarrollo causa defectos en el patrón y un aumento de la proliferación16. Se observa un aumento de la proliferación con un pHi más alto en todas las especies, desde levaduras hasta mamíferos17. Sin embargo, también observamos que con el aumento del pHi, el ojo adulto parecía de menor tamaño en comparación con los controles.

Se realizó un análisis cuantitativo del área ocular adulta para determinar cómo la expresión elevada de DNhe2 disminuye el tamaño del tejido en el ojo de Drosophila . Primero adquirimos imágenes de baja resolución utilizando un microscopio ocular (Figura 5A), pero estas eran de calidad insuficiente para realizar mediciones cuantitativas. Específicamente, los bordes del ojo no están enfocados, lo que impide una medición precisa del área del ojo.

Medimos el área de cada ojo en imágenes de alta resolución de ojos adultos de Drosophila (Figura 5B). Las moscas que expresan GMR>DNhe2 tenían ojos significativamente más pequeños (media de 74,28 μm2) que el control de fondo genético w1118 moscas (media 125,83 μm2) o el control controlador GMRGAL4 moscas heterocigóticas (media 142,49 μm2), lo que supone una reducción del 41% y del 48% en el área, respectivamente (Figura 5C). Esta disminución en el tamaño de los ojos, a pesar del aumento de la proliferación, podría atribuirse a niveles elevados de muerte celular.

Los genes de autofagia conocidos, incluido Atg1, que induce la formación de fagoforos, se utilizaron en estudios de interacción genética (Figura 5). Los efectos sobre el tamaño de los ojos de los adultos se cuantificaron mediante fotografía de alta resolución y análisis de área (Figura 5B). El tamaño del ojo se restauró (129,9μm2 vs 74,28μm2) en moscas GMR>DNhe2 heterocigotas para Atg13 en comparación con GMR>DNhe2 solo y fue similar a los controles (Figura 5C). Combinado con el análisis de marcadores moleculares, nuestros resultados respaldan un aumento de la muerte celular autofágica a un pH más alto.

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Figura 5: Rescate de la disminución del tamaño de la retina asociada al aumento del pH intracelular con disminución de la autofagia. (A) Imágenes de baja resolución de ojos de mosca adultos tomadas con un microscopio de inserción ocular. (B) Imágenes de alta resolución de ojos de mosca adultos utilizados para la cuantificación del tamaño de los ojos para los siguientes genotipos: w1118; GMRGAL4; GMR>DNhe2; GMRGAL4; Atg13; RMM>DNhe2; ATG13. (C) El tamaño medio medido de los ojos de los adultos fue: w1118 (125,83 μm2, N = 7); GMRGAL4 (142,49 μm2, N = 9) y GMR>DNhe2 (74,28 μm2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146,4 μm2, N = 15); GMR>DNhe2; Atg13 (129,9 μm2, N = 19) y se indica mostrando valores medianos con rangos intercuartílicos. La significación estadística se determinó mediante pruebas t no apareadas con corrección de Welch. Los datos de B y C fueron publicados previamente18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nuestras conclusiones se ven reforzadas por la preparación de la muestra, las imágenes de alta resolución y el análisis descrito aquí. Estos métodos permitieron una descripción precisa y cuantitativa del tamaño de los ojos de Drosophila adultos con varios genotipos. Continuamos utilizando este enfoque para evaluar otras interacciones genéticas que dilucidarán los mecanismos de control del crecimiento dependiente del pH.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí describimos un método para la preparación de muestras, imágenes de alta resolución y análisis de estructuras adultas de Drosophila . El ojo de Drosophila es un sistema modelo genéticamente manejable que ha proporcionado información crítica sobre los mecanismos moleculares que subyacen a enfermedades como el cáncer19, la neurodegeneración20 y las enfermedades metabólicas21. En particular, se generan "avatares" de pacientes con cáncer en los que se generan Drosophila transgénicas portadoras de mutaciones oncogénicas y se pueden utilizar para el cribado de fármacos de alto rendimiento22. Aunque nos centramos en el ojo adulto, este protocolo se puede adaptar para analizar otras estructuras de interés como el ala, la pata, el tórax y el abdomen.

Las habilidades motoras finas son necesarias en varios pasos críticos de este protocolo. La preparación de la muestra de Drosophila adulta mediante montaje en punta requiere paciencia y práctica. Aconsejamos a los principiantes que practiquen el montaje en punta antes de preparar muestras raras o preciosas. Hay varios pasos críticos que requerirán la práctica de las habilidades motoras finas y una atención cuidadosa.

Los primeros pasos críticos en el protocolo son la preparación de los puntos de la tarjeta y la aplicación del pegamento para adherir el punto de la tarjeta al abdomen (paso del protocolo 2.4-2.5). Es importante aplicar la cantidad justa de pegamento porque las estructuras anatómicas objetivo (es decir, la cabeza) pueden estar cubiertas de pegamento si se aplica demasiado o no tiene la consistencia adecuada. La muestra también debe pegarse en una posición adecuada, con el eje antero-posterior perpendicular al pin de montaje. El segundo paso crítico es posicionar el cabezal para la obtención de imágenes de alta resolución (paso 3.2 del protocolo). Es crucial que la cabeza esté orientada con el ojo mirando hacia la lente de la cámara. Para ajustar la cabeza, se realizan pequeños ajustes con pinzas. Los movimientos suaves e incrementales son cruciales, ya que la decapitación accidental puede ocurrir con ajustes grandes o forzados. Un paso adicional en el que se requieren habilidades motoras finas es cuando se utiliza la herramienta de selección a mano alzada de la barra de herramientas FIJI (paso del protocolo 4.6). Aquí, es crucial trazar lo más cerca posible de la fila externa de omatidios del ojo. Esta precisión es clave para mediciones rigurosas y reproducibles del área del ojo (Figura 4E).

Los métodos de imagen, como la microscopía electrónica de barrido (SEM), siguen siendo el enfoque principal para visualizar y analizar estructuras externas. Sin embargo, los protocolos SEM requieren que el usuario maneje productos químicos peligrosos y opere múltiples instrumentos, incluidos secadores de puntos críticos, aparatos de recubrimiento por pulverización catódica y el propio SEM. La preparación de la muestra lleva varios días y requiere una formación y habilidad intensivas. Un desafío importante que enfrentan las instituciones académicas es la inversión financiera y el compromiso para mantener el instrumento y, en nuestra experiencia, el personal con experiencia en el mantenimiento y operación de este equipo generalmente no cuenta con el apoyo a nivel institucional. Nuestro protocolo mitiga los costos y elimina la exposición a sustancias químicas peligrosas a costa de imágenes de menor resolución en comparación con SEM.

El sistema descrito en este estudio era un paquete preensamblado, pero su naturaleza modular permite reducir el costo mediante la sustitución de componentes individuales con equipos fabricados internamente (por ejemplo, etapas de muestra, difusores de flash), marcas o modelos alternativos, o equipos que ya podrían estar presentes en el laboratorio. Si bien la conexión de objetivos de microscopio a cámaras macro está aumentando en popularidad entre los aficionados y fotógrafos profesionales, es posible que se requiera un poco de prueba y error para diferentes combinaciones de objetivos y lentes. Para replicar el sistema descrito aquí, un objetivo de microscopio corregido al infinito debe conectarse a una lente de tubo (teleobjetivo aquí) con un adaptador roscado apropiado. Otra consideración a la hora de intercambiar componentes es asegurarse de que la distancia de trabajo del objetivo sea compatible con las dimensiones de la montura de la cámara, la montura de la muestra y el riel de macroenfoque. Por último, el software de apilamiento de foco seleccionado aquí es comercial, pero existen muchas soluciones de apilamiento de enfoque de posprocesamiento gratuitas o de bajo coste, incluidos los plugins de ImageJ.

Si bien este protocolo requiere práctica para dominar las técnicas de manejo de muestras, está diseñado para adquirir y analizar imágenes de alta resolución para un análisis fenotípico detallado. Los procedimientos presentados aquí constituyen una alternativa rápida y de bajo costo a las metodologías tradicionales de imagen. Mediante el uso de técnicas de imagen digital basadas en software gratuito para el análisis cuantitativo, nuestra metodología es accesible y no requerirá costosas compras o actualizaciones de software. La configuración de imágenes requiere cierto costo y esfuerzo, pero una vez establecida, debería ser una adición duradera a los laboratorios de Drosophila . Este método produce imágenes de alta resolución adecuadas para la cuantificación de fenotipos y podrían adaptarse fácilmente a otras estructuras de interés, como el ala, la pata, el tórax y el abdomen. Esta metodología hace que la preparación de muestras, las imágenes de alta resolución y el análisis sean accesibles para estudiantes de pregrado y científicos de instituciones de escasos recursos.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de pH de Grillo-Hill por las discusiones y el apoyo. Agradecemos a Tim Andriese, Randy Kirschner, Kitty (Ngoc-Huong) Nguyen, Marco Parent, Jonny Shaloub y Librado Veliz por su excelente soporte técnico. Este trabajo contó con el apoyo de los premios NIH SC3GM132049 y 1R16GM153640 (BKGH), un premio de investigación de la facultad de biotecnología de la CSU (LM y BKGH) y fondos iniciales de la Facultad de Ciencias y el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Estatal de San José (FJL). Mención especial para Bernd Becker por su ingenio y asistencia durante este proceso. Agradecemos a la comunidad de BioIcons (https://bioicons.com/) por proporcionar iconos de alta calidad para nuestras figuras y especialmente a Serviere por el icono de la pipeta, y a DBCLS por los iconos de Drosophila, fórceps y microscopio electrónico de escritorio utilizados en la Figura 1 y la Figura 2, que tienen licencia CC-BY 4.0 Unported. También agradecemos a la comunidad de SciDraw (https://scidraw.io/) por proporcionar íconos de alta calidad para nuestras figuras, especialmente Diogo Losch De Oliveira (doi.org/10.5281/zenodo.3925953), que están bajo licencia Creative Commons 4.0 (CC-BY).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pipeta serológica de 1 mLThermoFisher Scientific170353N
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mLGenesee Scientific 24-282LR
20x Objetivo del microscopio ApoMitutoyo Corp.378-804-3
Cartulina de archivo de 65 lb Neenah, Inc.91901
Canon EF 70-200 mm USM II teleobjetivoCanon3044C002
Canon EOS 6D Mark II DSLR Cuerpo de la cámaraCanon1897C002
Difusor DomeSoluciones macroscópicas PA-DIF-GIM-SM
para Mitutoyo M Plan APO ObjetivosSoluciones macroscópicas mitutoyo-difusores
Drosophila viales y taponesGenesee Scientific 32-117BF
Dumont #5 pinzas de punta finaFisher ScientificNC9889584
Plumas de gansoAmazonB01CMMJI6U
Trípode de aluminio anodizado de alta resistenciaReally Right Stuff, LLCTFA-32G
KimwipesFisher Scientific06-666APañuelo de laboratorio sin pelusa
Levenhuk M1000 Plus CámaradigitalLevenhuk70358
Pasador de montaje n.º 3Indigo Instruments33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila mediaGenesee Scientific 66-113comida para moscas
Point-PunchM.C. Mieth Manufacturing, Inc.448Detail
Screwknob ClampReally Right Stuff, LLCSK-ClampPara sujetar el riel macro al controlador Stackshot del trípode
y al riel macroCognisys Inc.
Adaptador de anillo reductor  Cámara RAF 763461174207Adaptador de lente para conectar el objetivo del microscopio a la lente de la cámara
Titebond GlueFranklin International5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite FlashShenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.YN-24EX
strong>Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1). software de adquisiciónCanon
FIJINational Institutes of HealthFiji se publica como código abierto bajo la Licencia Pública General GNU. FIJI versión 2.14.0/1.54f 
GraphPad PrismGraphPad Software, Boston, Massachusetts EE. UU.Prisma versión 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)Zerene Systems, LLCFocus Stacking Software
Difusor ST3X_100_BUNDLE<El de

Referencias

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