Modelado del consumo de alcohol en roedores mediante el consumo de alcohol en jaulas caseras de dos botellas y análisis microestructural

Resumen

Este protocolo describe un paradigma estándar de consumo de alcohol en jaula en casa de acceso intermitente y dos botellas para modelar el consumo de alcohol en ratas. Además, proporciona instrucciones paso a paso para aumentar el protocolo estándar con un sistema de detección de lamidos de bricolaje que permite el análisis microestructural del comportamiento de la bebida.

Resumen

La elección de dos botellas para beber en jaulas en casa es uno de los paradigmas más utilizados para estudiar el consumo de etanol en roedores. En su forma más simple, los animales tienen acceso a dos botellas de bebida, una de las cuales contiene agua del grifo regular y la otra etanol, con una ingesta diaria medida por el cambio en el peso de la botella durante el período de 24 horas. En consecuencia, este enfoque no requiere equipo de laboratorio especializado. Si bien esta facilidad de implementación es probablemente el mayor contribuyente a su adopción generalizada por parte de los investigadores preclínicos del alcohol, la resolución de los datos de consumo de alcohol adquiridos con este enfoque está limitada por el número de veces que el investigador mide el peso de la botella (por ejemplo, una vez al día). Sin embargo, el deseo de examinar los patrones de consumo de alcohol en el contexto de la ingesta general, las intervenciones farmacológicas y las manipulaciones neuronales ha impulsado el desarrollo de sistemas de detección de lamidos en jaulas caseras que pueden adquirir datos a nivel de lamidos individuales. Aunque varios de estos sistemas se han desarrollado recientemente, el sistema de código abierto, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), ha atraído una atención significativa en el campo por su asequibilidad y facilidad de uso. Aunque emocionante, este sistema fue diseñado para su uso en ratones. Aquí, revisamos los procedimientos apropiados para el consumo de agua en jaula en casa estándar y equipado con un lickómetro de dos botellas. También introducimos métodos para adaptar el sistema LIQ HD a las ratas, incluidas modificaciones de hardware para acomodar un tamaño de jaula más grande y un soporte de botella impreso en 3D rediseñado compatible con botellas de bebida estándar listas para usar. Con este enfoque, los investigadores pueden examinar los patrones diarios de bebida, además de los niveles de ingesta en muchas ratas en paralelo, aumentando así la resolución de los datos adquiridos con una inversión mínima en recursos adicionales. Estos métodos proporcionan a los investigadores la flexibilidad de utilizar botellas estándar o un aparato equipado con un lickómetro para interrogar los mecanismos neurobiológicos que subyacen al consumo de alcohol, en función de sus necesidades experimentales precisas.

Introducción

Aunque el consumo moderado de alcohol se ha asociado históricamente con beneficios moderados para la salud, recientes estudios exhaustivos a gran escala han revelado que ninguna cantidad de consumo de alcohol es segura^1,2. De hecho, el consumo de alcohol es el^7º factor de riesgo principal de muerte y discapacidad a nivel mundial¹ y las personas que beben incluso pequeñas cantidades de alcohol tienen un mayor riesgo de cáncer, enfermedades infecciosas y lesiones^1,3. En los Estados Unidos, las muertes por consumo de alcohol aumentaron casi un 30% entre 2016 y 2021⁴. Es importante destacar que el riesgo de muerte y discapacidad aumenta monótonamente con el aumento del consumo¹.

Aunque los estudios en humanos han proporcionado información valiosa sobre la neurobiología del uso y abuso del alcohol, el control experimental proporcionado por los modelos animales es crucial para una comprensión profunda de los mecanismos que subyacen al comportamiento de consumo y el riesgo de consumo excesivo de alcohol. Estos modelos también son herramientas valiosas para el desarrollo de tratamientos destinados a reducir el consumo descontrolado. El consumo de alcohol en jaulas en casa con dos biberones es uno de los paradigmas preclínicos más utilizados para estudiar el consumo de alcohol en roedores. Esto se debe, en gran parte, a su facilidad de implementación, ya que permite medir el consumo voluntario total de alcohol y la preferencia sin necesidad de equipos de investigación especializados o análisis complejos. Con este enfoque, los investigadores pueden recopilar mediciones a intervalos deseados (por ejemplo, horas, días, semanas) calculando el cambio en el peso de la botella desde el principio hasta el final de una sesión de bebida. Las variaciones de este método básico han sido utilizadas por muchos en el campo para facilitar los niveles bajos a moderados o atracones de ingesta de alcohol durante períodos cortos y largos de tiempo. Por ejemplo, se han utilizado procedimientos continuos e intermitentes de elección de dos botellas para facilitar niveles bajos y moderados de ingesta de alcohol, respectivamente, tanto en ratones^{5 como en} rats^6,7,8. Los mismos paradigmas pueden promover altos niveles de ingesta en cepas que prefieren el alcohol^7,9. Alternativamente, se ha demostrado que una adaptación de este método que limita el acceso al alcohol a 2-4 horas diarias a partir de aproximadamente 3 horas después del inicio del ciclo de oscuridad genera atracones de bebida en ratones (es decir, beber en la oscuridad)^10,11. Se han utilizado variaciones adicionales de estos métodos junto con métodos que facilitan la dependencia del alcohol (es decir, la exposición crónica intermitente al vapor de etanol) para examinar la escalada del consumo voluntario de alcohol durante la abstinencia^{12,13,14,15,16,17,18,19}.

Aunque ampliamente adoptado por el campo, el enfoque estándar de medir la ingesta de alcohol por cambio en el peso de la botella se limita en resolución al consumo total por sesión de bebida. En consecuencia, este enfoque es incapaz de capturar los patrones de consumo, que se sabe que afectan tanto el riesgo como la gravedad del trastorno por consumo de alcohol (AUD)^20,21,22. De hecho, la ingesta media de un individuo a lo largo del tiempo puede ser consecuencia de varios episodios de consumo excesivo de alcohol o de muchos episodios de bebida, cada uno de ellos asociado a un consumo relativamente bajo, y estos matices pasan desapercibidos cuando el consumo se mide como la ingesta total por sesión de bebida. Es importante destacar que se observan significativamente más episodios de consumo de alcohol asociados con grandes episodios de bebida (es decir, tragar) en individuos con AUD en relación con controles sanos²³ y los datos en primates no humanos sugieren que los individuos que establecen un patrón de consumo de alcohol que incluye grandes episodios de bebida al principio de su historial de consumo de alcohol tienen un riesgo significativo de AUD²². Además, los episodios de consumo de alcohol que incluyen grandes episodios de consumo aumentan significativamente el riesgo de morbilidad y mortalidad independientemente del diagnóstico de AUD²¹. En conjunto, estos datos han llevado a un mayor interés en examinar los patrones de bebida, además de los niveles de ingesta general en modelos preclínicos, y han impulsado el desarrollo de una serie de sistemas de diversa complejidad que son capaces de capturar datos de bebida a nivel de lamidas individuales.

Entre los primeros se encuentra el desarrollo de un sistema de dos botellas equipado con detección de lamido de fotohaz diseñado para su uso en ratones²⁴. Este sistema fue adaptado posteriormente por un grupo separado para su uso en rats²⁵. En los años transcurridos desde entonces, se han utilizado variaciones sobre este tema para desarrollar sistemas similares contenidos en alojamientos personalizados para roedores²⁶, que permiten la detección de lamidas de animales individuales alojados socialmente^27,28, y que capturan tanto el comportamiento de alimentación como de bebida²⁹. Entre estos, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ ha atraído una atención significativa por ofrecer un sistema para su uso en ratones que es paralelo a la facilidad de implementación y asequibilidad del sistema desarrollado por Godnyuck et al.²⁴. Este sistema utiliza la detección capacitiva para detectar directamente el contacto entre la lengüeta y el tubo de sorbo de metal conductor, a diferencia de las medidas indirectas como el enfoque o la interacción del sorbedor que se proporcionan mediante el sistema de detección de fotohaz. Los autores proporcionan datos que demuestran que su sistema de detección capacitiva ofrece una precisión y sensibilidad significativamente mayores en la detección de lamidos, produciendo correlaciones más fuertes entre el número de lamidos y el cambio en el peso de la botella que la detección de fotohaz. Los autores demuestran además la capacidad de utilizar este sistema junto con un paradigma de acceso continuo de dos botellas para capturar medidas de la microestructura del consumo de alcohol, además de medidas de la ingesta diaria general³⁰.

Aquí, describimos los procedimientos para el consumo de alcohol en jaula en casa con dos botellas utilizando un enfoque estándar, así como métodos que permiten la detección de lamidos (Figura 1). También presentamos métodos para construir e implementar LIQ HDR, una adaptación de LIQ HD³⁰ para su uso en ratas que incluye modificaciones de hardware para acomodar tamaños de jaula más grandes y un portabotellas rediseñado impreso en 3D compatible con botellas estándar listas para usar. Estos métodos proporcionan a los investigadores la flexibilidad necesaria para utilizar un enfoque estándar o equipado con un lickómetro, en función de sus recursos experimentales y de sus necesidades de recopilación de datos.

A continuación se muestra una descripción de los materiales necesarios e instrucciones paso a paso para capturar el consumo de alcohol en jaula en casa utilizando el procedimiento de bebida de elección de dos botellas de acceso intermitente adaptado de Simms et al.⁷. En este procedimiento, las ratas tienen acceso las 24 horas del día a dos botellas de bebida, 7 días a la semana. Los lunes, miércoles y viernes (MWF), las ratas reciben una botella que contiene agua (_H2O) y otra botella que contiene etanol (EtOH). Estas botellas se retiran los martes, jueves y sábados (TRS) y se reemplazan con dos botellas de agua. Las ratas beben de las mismas dos botellas de agua los sábados y domingos. Tenga en cuenta que estos métodos se pueden ajustar fácilmente para horarios alternativos de acceso al etanol (por ejemplo, continuo, atracón, etc.) si lo desea. Se proporcionan instrucciones separadas para los enfoques estándar y equipados con lickómetros.

Protocolo

Todos los datos representativos se recopilaron utilizando ratas adultas Long-Evans mantenidas individualmente, con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago y de acuerdo con las Guías del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Es necesario el alojamiento individual para monitorear con precisión el consumo de líquidos de cada sujeto. Se utilizaron ratas Long-Evans adultas macho (n = 38) y hembra (n = 22), que al llegar tenían entre P50 y P80 y se les permitió aclimatarse al vivario durante una semana antes de comenzar el experimento. Las ratas tuvieron acceso ad libitum a alimento estándar (Teklad 7912, Envigo) y agua, salvo que se indique lo contrario.

1. Preparación antes del experimento

1. Etiquete las botellas de bebida como H₂O o EtOH. Luego, coloque un identificador único para cada rata: una botella de H₂O y una de EtOH para los días LMA y dos botellas de H₂O para los días MJS.
   NOTA: Opcionalmente, utilice cinta de diferentes colores para identificar las botellas de H₂O y EtOH, con el fin de evitar errores durante el cambio de botellas.
2. Llene las botellas de H₂O con agua potable un día antes de la fecha de inicio del experimento. Prepare la solución de EtOH mezclando EtOH de 190 grados con agua potable (20% v/v) un día antes de la fecha de inicio del experimento.
   ADVERTENCIA: Es fundamental utilizar EtOH no desnaturalizado, ya que el EtOH desnaturalizado es venenoso.
3. Prepare una jaula vacía en el mismo estante que las jaulas de las ratas que participan en el experimento. Esta jaula se utilizará para calcular el derrame.
4. Equipe las jaulas con el sistema LIQ HDR si se va a utilizar (véase el paso 3, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 y Figura Suplementaria 1).
5. Determine el momento preciso del día para el cambio de botellas antes del inicio del estudio. Las botellas deben reemplazarse a la misma hora todos los días para obtener una medición precisa del consumo en 24 h.
   NOTA: Investigaciones previas han demostrado que los roedores presentan el mayor grado de consumo poco después del inicio del ciclo oscuro^10,31. Por lo tanto, con el fin de registrar el consumo durante este período de alta actividad (véase el paso 2.3.1 para registrar el consumo tipo atracón), se recomienda realizar el cambio de botellas entre 30 y 60 minutos después de que se apaguen las luces. Utilice lámparas rojas durante el cambio de botellas para permitir la visualización sin interrumpir el ciclo luz-oscuridad.

2. Procedimientos diarios y mantenimiento

1. El primer día del experimento, realice lo siguiente.
   1. Retire las botellas estándar de agua de las jaulas.
   2. Opcional: con frecuencia las ratas mueven la tapa de la jaula mientras buscan alimento, lo que podría causar derrames que no pueden corregirse con la jaula de derrame vacía. El uso de tazones para alimento dentro de la jaula puede aliviar esta preocupación. Si se utiliza, retire el alimento de la parte superior de la jaula, agregue un tazón para alimento dentro de la jaula y llénelo con alimento. Asegúrese de que el espacio en el piso asignado a la rata siga cumpliendo con las directrices institucionales según el tamaño de la jaula para ratas y el tamaño del tazón para alimento.
   3. Indique al personal de cuidado y manejo, según corresponda, que el personal de investigación proporcionará alimento y agua durante toda la duración del experimento.
   4. Los cambios de jaula pueden interrumpir la recolección de datos. Realice los cambios de jaula simultáneamente con la obtención de las mediciones de peso corporal. Los investigadores que elijan hacer esto deben informar a su personal de cuidado y manejo en consecuencia.
2. En los días posteriores, siga los procedimientos descritos a continuación.
   NOTA: Recuerde que cualquier movimiento de jaulas y botellas puede provocar derrames. Por lo tanto, es importante ser cuidadoso con los movimientos y utilizar los mismos métodos para colocar y retirar las botellas en la jaula de derrame que los utilizados para las jaulas de ratas.
   1. Ingrese a la habitación antes de la hora de cambio de botellas, asegurándose de tener suficiente tiempo para realizar los pasos siguientes, y coloque botellas nuevas en las jaulas a la hora de inicio programada para la sesión.
   2. Retire las tapas con filtro de las jaulas. Si es LMA, continúe con el paso 2.2.3. Si es MTR, continúe con el paso 2.2.4.
   3. Los lunes, miércoles y viernes, retire las botellas MTR de la parte superior de las jaulas. Pese las botellas LMA (una de EtOH y una de H₂O). Registre el peso inicial de la botella para la sesión de consumo de hoy. Proporcione alimento adicional en la parte superior de la jaula o en los tazones para alimento si es necesario. A la hora designada de inicio de la sesión, coloque las botellas en la parte superior de la jaula de cada rata con la cinta hacia arriba para que las ratas no muerdan la etiqueta de la botella.
      NOTA: Normalmente, el consumo de agua no se registra ni se informa para MTR, pero los investigadores pueden recopilar opcionalmente estos datos obteniendo los pesos de las botellas antes y después, como se describe a continuación en el paso 2.2.3 y el paso 2.2.4, si así lo desean. El lado para la botella de EtOH debe alternarse después de cada sesión de consumo para evitar el desarrollo de una preferencia lateral, lo que podría sesgar involuntariamente los datos de consumo.
      1. Opcional: trabajos previos han demostrado que muchas ratas presentan un consumo similar al atracón al inicio de la sesión de consumo^8,32,33. La mayoría de los investigadores que registran el consumo compulsivo durante este periodo informan la ingesta durante los primeros 30-60 minutos de la sesión. Para obtener datos de ingesta durante este posible episodio de atracón, siga los pasos descritos a continuación.
      2. Configure un temporizador después de colocar las botellas en la última jaula. Deje la habitación sin interrupciones durante el periodo cronometrado.
      3. Vuelva a ingresar a la habitación cuando suene el temporizador. Retire las botellas de EtOH y H₂O y registre sus pesos. Devuelva las botellas de EtOH y H₂O a las jaulas.
         NOTA: Este paso no es necesario para registrar episodios de atracón cuando se utiliza un sistema equipado para la detección de lamidos.
   4. Los martes, jueves y sábados, retire las botellas LMA de las jaulas a la hora designada de finalización de la sesión, correspondiente a 24 h después de la hora de inicio. Pese cada botella y registre el peso final de la botella para la sesión de consumo LMA. Obtenga y registre el peso corporal de cada rata. Si es necesario, proporcione alimento adicional en la parte superior de la jaula o en los tazones para alimento. Coloque las botellas de H₂O MTR en la parte superior de la jaula de cada rata con la cinta hacia arriba para que las ratas no muerdan la etiqueta de la botella.
   5. Devuelva las tapas con filtro a las jaulas y salga de la sala de animales.
      NOTA: Opcionalmente, cubra los bebederos de las botellas de EtOH para evitar la evaporación. Si los cambios de jaula los realiza el personal de investigación, designe 1 día a la semana durante las tareas MTR para realizar esta actividad. Coloque a cada rata en una jaula limpia después de obtener su peso corporal.
3. Lave las botellas y renueve los líquidos de forma regular, semanal o quincenal, según los procedimientos institucionales de cuidado y manejo de animales. Tenga cuidado de realizar estas tareas de manera que no interrumpan las sesiones de consumo. Por ejemplo, las botellas de H₂O MTR pueden lavarse y rellenarse después de retirarlas los días LMA. De manera similar, las botellas de H₂O y EtOH LMA pueden lavarse y rellenarse después de retirarlas los días MTR.

3. Detección de lamidos durante experimentos de elección de dos botellas

NOTA: Los investigadores interesados en obtener datos de consumo de bebida de alta resolución pueden modificar el procedimiento anterior agregando capacidades de detección de lamidos a las botellas. LIQ HD³⁰ es un sistema de bajo costo hecho por uno mismo (DIY) que permite este tipo de recolección de datos en ratones. Los procedimientos descritos a continuación detallan las modificaciones necesarias para adaptar LIQ HD para su uso en ratas (denominado LIQ HDR). Véase la Tabla de Materiales para obtener una lista de todas las piezas vendidas comercialmente y las piezas personalizadas impresas en 3D necesarias para construir un sistema de detección de lamidos, el cual puede capturar datos de elección entre dos botellas para hasta 18 ratas. Los archivos .stl para impresión 3D y las instrucciones están disponibles en el sitio web del autor (www.ejgloverlab.com/3dprints).

1. Configuración de unidades de sensores capacitivos
   NOTA: Cada sistema LIQ HDR consta de tres unidades de sensores capacitivos, que en conjunto capturan datos de lamidos de 36 botellas en paralelo, correspondientes a 18 ratas alojadas individualmente. Cada unidad de sensor consiste en un diferencial I²placa de expansión C y una placa sensora capacitiva de 12 teclas, que se conectará a los lickómetros de seis jaulas separadas mediante seis pares de cables de 2 pines codificados por colores para cada lickómetro (Figura 2A).
   1. Reúna los materiales necesarios para construir las tres unidades del sensor capacitivo, como se muestra en Figura 2B, junto con las herramientas de soldadura necesarias.
   2. Para comenzar a armar la unidad sensora A, cubra un cable con conector hembra de 2 pines con un tubo termoretráctil rojo de 7 pulgadas de largo, e inserte los extremos de los cables rojo y negro en los pines #0 y #1 de la placa sensora (Figura 2C-1) y soldar en su lugar (Figura 2C-2). Asegúrese de que el cable esté en la parte frontal de la placa del sensor, tal como se muestra, para poder disponer las jaulas en orden numérico de izquierda a derecha en el vivario sin que los cables se superpongan y puedan interrumpir la grabación (véase el paso 3.6 y Figura 6).
   3. Cubra cinco cables más con tubos termorretráctiles de colores claramente distintos y suéldelos a los pines del 2 al 11 como se muestra (Figura 2C-3). Asegúrese de que todos los cables rojos estén soldados a los pines pares, que se conectarán a todas las botellas del lado izquierdo, y de que todos los cables negros estén soldados a los pines impares, que se conectarán a todas las botellas del lado derecho.
   4. Cubra las uniones de soldadura con pegamento caliente por todos los lados para protegerlas (Figura 2C-4). Etiquete los conectores en orden numérico, asignando un ID único a cada lickómetro (Figura 2C-4).
   5. Para ensamblar la unidad sensora A, conecte la placa sensora A a un punto final de comunicación (EndPoint) mediante un cable de 4 pines de 50 mm, y conecte el punto final al puerto de salida de 3,3 V del conversor nivelador de 5 V a 3 V mediante un cable de 4 pines de 100 mm (Figura 2D-1). Aunque tanto la placa del sensor como la placa de comunicación tienen dos conectores idénticos de 4 pines, es importante asegurarse de que el cableado sea exactamente como se muestra (Figura 2D-1 y Figura 2F) para utilizar las carcasas impresas en 3D para sensores y la configuración sugerida del vivario (ver paso 3.6 y Figura 6). Coloque la unidad sensora A dentro de la carcasa impresa en 3D (Figura 2D-2). Cierre suavemente la tapa, teniendo cuidado de no aplastar el cable del convertidor de nivel (Figura 2D-3).
   6. Modificar el I²C direcciones de las placas sensoras B y C soldando un cable puente desde el pin ADDR hasta el pin 3Vo o SDA según se indica (Figura 2E).
   7. Soldar seis cables conectores hembra codificados por colores a las placas sensoras B y C utilizando el mismo orden que se usó para la placa A. Etiquetar cada conector con el número de identificación correspondiente del lickómetro. Conectar la placa B al punto medio de comunicación (MidPoint) y la placa C a un punto final (EndPoint) con cables de 4 pines de 50 mm (Figura 2F).
   8. Coloque las unidades sensoras B y C en sus respectivas cajas impresas en 3D. Conecte en cadena las tres unidades sensoras mediante cables Ethernet para completar la configuración del sensor (Figura 2G).
2. Configuración de la interfaz del microcontrolador
   NOTA: La interfaz del microcontrolador LIQ HDR (Figura suplementaria 1A) es el mismo que el descrito para LIQ HD³⁰ con modificaciones muy menores. Los procedimientos descritos a continuación ofrecen una visión general de los pasos necesarios para configurar la interfaz, con las modificaciones descritas en los pasos 3.2.6 y 3.2.8. Se remite a los investigadores al protocolo original y al tutorial en video proporcionado en la página de GitHub del autor para obtener instrucciones detalladas paso a paso más completas³⁰.
   1. Reúna los materiales y las herramientas de soldadura necesarios para construir la interfaz del microcontrolador (Figura suplementaria 1B). En el lado posterior del escudo táctil (Figura suplementaria 1C-1), cree un puente de soldadura a través de las pistas de soldadura traseras (Figura suplementaria 1C-2).
   2. En el lado posterior del escudo de registro de datos, corte la pista del puente del pin CS (Figura suplementaria 1D-1). En el lado frontal del registrador de datos, suelde un cable puente corto desde el pin CS hasta el pin #7 (Figura suplementaria 1D-2).
   3. Para instalar los encabezados apilables del blindaje, primero apílelos en la parte trasera del blindaje de la pantalla táctil (Figura suplementaria 1E-1). Apile el registrador de datos sobre la pantalla táctil, use cinta para estabilizarlo y suelde todos los pines de conexión al registrador de datos (Figura suplementaria 1E-2). Luego retire la pantalla táctil.
   4. Apile el encabezado 2 x 3 restante al microcontrolador (Figura suplementaria 1F-1), luego apile el registrador de datos sobre el microcontrolador antes de soldar los pines de encabezado en su lugar (Figura suplementaria 1F-2).
   5. Inserte la batería de tipo moneda en el registrador de datos (Figura suplementaria 1G-1). Coloque la pantalla táctil sobre el registrador de datos (Figura suplementaria 1G-1). Inserte la tarjeta microSD junto con su adaptador en el registrador de datos (Figura suplementaria 1G-2).
   6. Para hacer el cable de conexión a tierra adicional, corte un conector macho de un cable puente y retire el aislamiento del extremo hasta dejar aproximadamente 1/4 de pulgadaFigura suplementaria 1H-1). Suelda un tramo de cable sólido pelado a un cable puente y cubre la unión soldada con un tubo termorretráctil (Figura suplementaria 1H-2).
   7. Conecte los cables jumper de 4 pines y el cable de conexión a tierra adicional al microcontrolador (Negro - GND, Rojo - 5V, Amarillo - pin #21, Azul - pin #20, Figura suplementaria 1I-1). Sujete las conexiones con pegamento caliente (Figura suplementaria 1I-2). Opcionalmente, envuelva los cables puente con tubo termorretráctil (Figura suplementaria 1I-2).
   8. Coloque la interfaz del microcontrolador completamente ensamblada en la carcasa impresa en 3D, pasando los cables jumper de 4 pines y el cable de tierra a través de la abertura en la parte superior (Figura suplementaria 1J).
   9. Siga el protocolo original para la instalación del software de interfaz del microcontrolador³⁰.
3. Construcción de lickómetros LIQ HDR
   NOTA: La impresión 3D personalizada que sostiene las botellas está diseñada para usarse con una botella estándar para roedores con un tubo dispensador de diámetro de 8 mm (ver Tabla de materiales Figura 3A). Este portabotellas puede adaptarse fácilmente para su uso con botellas y tubos bebedores similares, con modificaciones menores o sin necesidad de modificaciones.
   1. Reúna los materiales, las piezas impresas en 3D y las herramientas de soldadura necesarios para construir un lickómetro, como se muestra en Figura 3B. Tenga en cuenta que cada sistema LIQ HDR acomoda un máximo de 18 lickómetros para 36 botellas.
   2. Para prolongar el cable del conector macho, retire el aislamiento de ambos extremos hasta dejar aproximadamente 1/4 de pulgada de longitud expuesta, así como de los cables de extensión rojo y negroFigura 3C-1).
   3. Soldar los cables de extensión al cable conector (Figura 3C-2) y cubra las uniones de soldadura con tubo termorretráctil (Figura 3C-3). Cubra el cable del conector macho con un tubo termorretráctil que haga juego en color con el cable del conector hembra correspondiente en la unidad del sensor (Figura 3C-4).
   4. Para ser coherente con el cableado del tablero del sensor (Figura 2), pase el cable rojo y el cable negro a través del pasaje izquierdo y derecho del portafrascos, respectivamenteFigura 3D-1).
   5. Soldar cada cable al extremo mismo del 1 ¾ cinta de cobre conductora de una pulgada (Figura 3D-2) y doble las cintas de cobre por la mitad (Figura 3D-3).
   6. Despegue la cinta de cobre y use un par de pinzas para colocarla cuidadosamente dentro del soporte del bebedero (Figura 3E-1) antes de adherirlo firmemente a las paredes internas del soporte del bebedero (Figura 3E-2). Asegúrese de que el lado con soldadura de la cinta de cobre quede adherido a la pared más cercana a la línea media del soporte del frasco, como se indica (Figura 3E-2). Introduzca un tubo bebedero a través del soporte para presionar firmemente la cinta contra la pared y cebado el soporte.
   7. Para reforzar el lado de soldadura de la cinta de cobre, que no es tan adhesivo y tiende a desprenderse, aplique un poco de pegamento caliente sobre la unión soldadaFigura 3E-3). Extender el pegamento para cubrir tanto la cinta de cobre como cualquier parte adyacente expuesta de la impresión 3D (Figura 3E-4).
   8. Pase el cable a través del conducto interno del protector de cableFigura 3F). Asegúrese de seleccionar el protector de cable adecuado (orientado hacia la izquierda o hacia la derecha) para cada lickómetro, a fin de utilizar la configuración sugerida del vivario (véase el paso 3.6 y Figura 6)."NOTA: Los lickómetros 5-6, 11-12 y 17-18, que se muestran con cables de color azul o morado en la configuración actual, requieren un protector de cable orientado hacia la izquierdaFigura 4D-1), mientras que todos los demás lickómetros requieren un protector de cable orientado hacia la derecha (Figura 4D-2).
   9. Para instalar la abrazadera del cable, primero coloque un cable en la ranura de una de las mitades de la abrazadera (Figura 3G-1), luego coloque la otra mitad sobre el segundo cable y, a continuación, cierre firmemente ambas mitades con la tuerca (Figura 3G-2).
   10. Etiquetar el conector macho con el número de identificación correspondiente del lickómetro (Figura 3H). Repita estos pasos hasta que se hayan construido todos los 18 lickómetros.
4. Instalación de lickómetros LIQ HDR
   NOTA: LIQ HDR está diseñado para su instalación en una jaula estándar para ratas tipo caja de zapatos con tapa de alambre metálico (Figura 4A-1).
   1. Identifique dos pares de varillas con una distancia centro a centro de aproximadamente 75 mm en la parte superior de la jaula de alambre para acomodar el portabotellas. Utilice un par de alicates para abrir ligeramente las varillas metálicas alrededor de las aberturas del bebedero. Aísle estas varillas con cinta aislante para evitar el contacto metal con metal entre los bebederos y la parte superior de la jaulaFigura 4A-2).
      NOTA: Aunque la cinta aislante no es accesible para las ratas y, por lo tanto, no está expuesta a mordeduras, se recomienda desecharla al final del estudio y no reutilizarla entre estudios.
   2. Instale el lickómetro y el panel de acrílico láser de 1/8 de pulgada de espesor en la parte superior de la jaula con dos juegos de tornillos y tuercas M5 (Figura 4B). Asegúrese de que las aberturas de los bebederos en el lickómetro y en el panel de acrílico coincidan, y de que los bebederos no estén en contacto con ninguna parte de la tapa de la jaula.
   3. Fije el sujetador de cable al poste más externo (~4 mm de diámetro) de la parte superior de la jaula de alambreFigura 4C). Ajuste el clip del cable si es necesario para asegurarse de que la tapa de la jaula quede bien ajustada sobre la base de la jaula y de que el cable no esté sometido a tracción excesiva ni doblado con tensión excesiva. Asegúrese de que se esté utilizando el protector de cable adecuado para cada lickómetro (Figura 4D y vea el paso 3.8.8).
   4. Ajuste los tubos de sorber según sea necesario para que solo unos ~2 cm del sorber sobresalgan de la tapa (Figura 4E-1). Para instalar las botellas, inserte el tubo dispensador a través del soporte del tubo en el portabotellas hasta que se detenga (Figura 4E-2). Solo la punta más extremas del tubo del bebedero debe sobresalir más allá del panel de acrílico (Figura 4E-3). Es fundamental que ninguna otra parte del tubo dispensador esté expuesta para evitar lamidas falsas positivas derivadas de comportamientos no consumatorios, como cuando la rata toca o juega con el tubo dispensador. La tapa del filtro debe poder colocarse firmemente sobre la tapa de alambre de la jaula y el sujetador de cable sin alterar el cable mismo (Figura 4F).
      NOTA: Se puede utilizar un panel de acrílico más grueso o una pila de varios paneles de 1/8 de pulgada para encapsular completamente tubos bebederos de mayor longitud en experimentos que requieran que los tubos se extiendan más hacia el interior de la jaula, como cuando se mide la ingesta de líquidos en ratas jóvenes que podrían tener dificultades para alcanzar un tubo bebedero corto.
5. Instalación y uso de bloqueadores sipper
   ​NOTA: El bloqueador del sorbete (Figura 5Aestá diseñado para restringir el acceso de la rata al bebedero durante el cambio de botellas y para garantizar una calibración precisa del lickómetro al inicio de cada sesión de consumo.
   1. Reúna las piezas impresas en 3D y un tornillo, tuerca y arandela M5 para un bloqueador de bebedero, como se muestra en Figura 5B.
   2. Inserte el SIPPER_Gear en el SIPPER_Base (Figura 5C-1). Asegúrese de que el SIPPER_Gear esté orientado exactamente como se muestra en la inserción del renderizado 3D. Introduzca el SIPPER_Worm en la abertura en la parte superior del SIPPER_Base. Gire el tornillo sinfín en sentido horario mientras lo inserta, hasta que la cabeza quede al ras con la base (Figura 5C-2).
   3. Atornille la tuerca SIPPER al extremo del tornillo sinfín desde la parte inferior de la base (Figura 5C-3). Utilice pinzas para apretar la tuerca mientras gira el dial de tornillo sinfín. Introduzca los cuellos redondos y estrechos de los SIPPER_Blockers en las ranuras del engranaje (Figura 5C-4).
   4. Instale el bloqueador de sorber montado en la parte superior de la jaula utilizando el juego de tornillos M5 (Figura 5D). Asegúrese de que ambos bloqueadores de sorbete estén alineados con las aberturas del sorbete.
   5. Para bloquear el acceso a los bebederos, gire el dial del tornillo sinfín en sentido horario para bajar los bloqueadores hasta que cubran completamente las aberturas de los bebederos (Figura 5E).
   6. Para permitir el acceso a los bebederos, gire el dial en sentido antihorario hasta que los bloqueadores estén en posición vertical y perpendicular a la parte superior de la jaula (Figura 5F-1). Tire manualmente hacia arriba de cada brazo del bloqueador hasta que las cabezas queden justo debajo de la parte superior de la jaula de alambre. Gire los bloqueadores 90° de modo que las cabezas queden paralelas a las varillas metálicas en la parte superior de la jaula y los brazos queden fijos en su lugar (Figura 5F-2). Siga girando el dial en sentido antihorario hasta que ambos bloqueadores estén elevados por encima de la parte superior de la jaula (Figura 5F-3) y los bebedores son completamente accesibles (Figura 5F-4).
6. Uso del sistema LIQ HDR en el vivario
   NOTA: La siguiente configuración de vivario está optimizada para registrar el consumo en la prueba de elección de dos botellas mediante una única interfaz de microcontrolador conectada a 18 jaulas estándar para ratas tipo caja de zapatos. Todos los componentes electrónicos, incluyendo la interfaz de microcontrolador, las unidades sensoras y diversos cables, se fijan a estantes metálicos de alambre montados en la pared que sostienen las jaulasFigura 6A). Es posible que se requieran algunas modificaciones para adaptarse a las instalaciones para animales y a las necesidades del usuario.
   1. Monte cada unidad sensora en los estantes del vivario utilizando el tornillo de montaje personalizado impreso en 3D (Figura 6B). Asegúrese de que cada unidad sensora esté montada directamente debajo de la jaula con el lickómetro de color amarillo para evitar tensiones innecesarias en el cableado (Figura 6A).
   2. Organice y asegure cada cable con conector hembra, asegurándose de que no se superpongan entre sí ni se doblen excesivamente en sus extremos soldados, lo que podría provocar una detección deficiente de lamidosFigura 6B). Si se utiliza estantería con varillas metálicas, esto puede lograrse fácilmente sujetando los cables del conector a varillas separadas en el estante, como se muestra.
   3. Monte la interfaz del microcontrolador junto a la unidad del sensor A utilizando el mismo tornillo de montaje impreso en 3D y conecte su conector de 4 pines al puerto de entrada de 5 V del convertidor de niveles de 5 V a 3 V conectado a la unidad del sensor A (Figura 6C).
   4. Utilice cinta aislante para asegurar el cable de tierra adicional a una fuente de conexión a tierra, como la estantería metálica (Figura 6D).
   5. Organice cada jaula según el color y el ID del lickómetro instalado según Figura 6A representación para minimizar el solapamiento y la tensión de los cables.
   6. Conecte de forma segura todos los cables conectores macho del lickómetro a los cables conectores sensoras hembra correspondientes (Figura 6E). Conecte la fuente de alimentación para encender la interfaz del microcontrolador (Figura 6F).
   7. En la página principal de la GUI (interfaz gráfica de usuario)Figura 6G), pulse el Configuración de símbolo para abrir la página de Configuración. Los usuarios pueden cambiar los horarios de encendido y apagado de las luces según el programa del vivario para asegurar que la pantalla de la interfaz se atenúe automáticamente cuando comience el ciclo oscuro (Figura 6H-1).
   8. Golpear suavemente Editar configuración del sensor (Figura 6H-1) para ajustar el umbral de contacto a 8 y el umbral de liberación a 2, lo cual hemos encontrado que permite la detección de lamidos más consistente en ratas utilizando la configuración actual (Figura 6H-2). Téngase en cuenta, sin embargo, que es posible que los usuarios deban experimentar con diferentes configuraciones si se introducen modificaciones al sistema actual.
   9. Desmarcar Auto Calibración si los datos se recopilan únicamente durante un período de 24 horas o menosFigura 6H-2).

4. Procedimientos diarios para la elección de dos botellas en jaula domiciliaria utilizando detección de lamidos

1. Siga los pasos descritos en el paso 2 para procedimientos estándar de elección entre dos botellas con las siguientes modificaciones.
2. Los lunes, miércoles y viernes, antes de colocar las botellas MWF, utilice los bloqueadores de bebederos para cubrir las aberturas de los bebederos en todas las jaulas (véase el paso 3.5.5 y Figura 5E).
3. Antes de grabar, seleccione el correcto Lado experimental en la página principal de la interfaz gráfica de usuario, que será el lado de la botella de EtOH para ese día (Figura 6G).
4. Después de instalar todas las botellas de MWF, toque ¡EMPEZAR! en la página principal (Figura 6G) para comenzar la calibración de los sensores, momento en el que se recomienda que el usuario dé un paso atrás desde el sistema y se asegure de que las ratas no estén lamiendo los bebederos (Figura 6I-1). La calibración tarda unos segundos en completarse, tras lo cual el sistema entra en la página principal de registro, que muestra el número acumulado de lamidos en cada botella para cada lickómetroFigura 6I-2).
5. Eleve todos los bloqueadores de sorberos por encima de la parte superior de la jaula para permitir el acceso a los sorberos (véase el paso 3.5.6 y Figura 5F) y devuelva suavemente todas las tapas de filtro como se describe (véase el paso 3.4.4 y Figura 4F).
6. Golpear suavemente Actualizar para actualizar el número de lamidos en la pantalla, ya que este no se actualiza en tiempo real por sí solo (Figura 6I-2).
7. Los martes, jueves y sábados, toque Guardar & Salir para detener la grabación y volver a la página principal (Figura 6I-2) antes de retirar los frascos de MWF.
8. Para retirar la tarjeta SD para la transferencia de datos, toque Expulsar SD antes de desconectar la tarjeta SD (Figura 6G). Inserte la tarjeta SD en cualquier computadora y copie/pegue el archivo de datos .csv, nombrado según la fecha de inicio del frasco, en esa computadora (Figura 6K). Para volver a colocar la tarjeta SD para la siguiente grabación, inserte la tarjeta en la interfaz y toque Montar SD (Figura 6J).
   NOTA: Recomendamos hacer copias de seguridad de los archivos de datos diariamente.
9. Es recomendable limitar las mediciones del peso corporal a una vez por semana, siempre que sea compatible con el modelo animal y el protocolo de uso de animales, y realizar esta tarea el día designado para el cambio de jaula con el fin de minimizar las perturbaciones innecesarias a los lickómetros y sensores. Desconecte todos los cables macho de los lickómetros de los cables hembra correspondientes de los sensores antes de mover las jaulas. Después de pesar cada rata, devuélvala a una jaula limpia. Transfiera el lickómetro a una nueva tapa de jaula y vuelva a conectar cada lickómetro al sensor correspondiente cuando sea necesario.
10. Para experimentos que evalúan el efecto de una intervención (por ejemplo, inyección de un fármaco) sobre la ingesta de EtOH y la microestructura del consumo de bebidas, programe dichas intervenciones antes del inicio de la sesión de consumo siempre que sea posible. En ocasiones en que esto no sea posible, los investigadores pueden interrumpir la detección de lamidos golpeando ligeramente Pausa (Figura 6I-2) y reanudar la captura de datos tocando Resumen después de que finalice la intervención. Sugerimos recoger los pesos de las botellas durante cada pausa en la sesión de consumo para registrar los cambios en la ingesta de EtOH antes y después de la intervención, así como para tener en cuenta cualquier derrame que pueda ocurrir al retirar la tapa de la jaula para acceder al animal.
11. Al final del estudio, todos los componentes dentro de la jaula deben desinfectarse minuciosamente antes de ser utilizados con animales nuevos, con el fin de limitar la transmisión de contaminantes entre los animales. Se recomienda rociar suavemente el lickómetro con una solución de EtOH al 70 % y luego limpiarlo con una toalla, teniendo cuidado de no alterar los componentes eléctricos internos. El bloqueador de bebedero y el panel de acrílico pueden lavarse con agua tibia y jabón.

5. Análisis de datos

1. Antes de evaluar las medidas dependientes, corrija los datos de ingesta para tener en cuenta el derrame que inevitablemente ocurre al cambiar las botellas cada día. Para ello, calcule el promedio del cambio en el peso de la botella de EtOH y de las botellas de H₂O en la jaula de derrame durante todo el período del estudio.
2. Excluya cualquier valor mayor de dos desviaciones estándar respecto a la media para cada botella. Después de excluir estos valores atípicos, reste las medias calculadas a los cambios en el peso de las botellas de EtOH y H₂O obtenidos de las jaulas que contienen animales. Al restar esta cantidad, los investigadores pueden estar seguros de que la pérdida promedio debida al derrame de una solución determinada no se considera en las medidas de consumo. La resta de la cantidad promedio de derrame puede dar como resultado un valor negativo para algunos animales en ciertas ocasiones. Convierta estos valores a cero e interprételos como la ausencia de ingesta para esa solución.
3. Las medidas dependientes principales en los experimentos de elección con dos botellas son la ingesta de EtOH (g/kg) y la preferencia (%). Calcule la ingesta a partir del cambio en el peso de la botella de EtOH (g) y normalícela respecto al peso corporal (kg) siguiendo los pasos siguientes.
   1. Convierta el cambio en el peso de la botella (g) al cambio en volumen (mL) utilizando la siguiente ecuación:
      
      La densidad del etanol puro es 0,789 g/mL. Por lo tanto, la densidad aportada por el EtOH al 20% es 0,1578 g/mL. El H₂O pesa 1 g/mL. Por consiguiente, la densidad aportada por el 80% de H₂O = 0,80 g/mL. En consecuencia, cada mL de una solución de EtOH al 20% (v/v) está compuesto por 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 g/mL. Por lo tanto, la ecuación final al utilizar una concentración de EtOH al 20% (v/v) es:
      
   2. Calcule la dosis de etanol consumida utilizando la ecuación siguiente. Utilice los pesos corporales obtenidos durante la misma semana que los datos de ingesta para calcular el etanol consumido en relación con el peso corporal del animal.
      
   3. Calcule la preferencia utilizando la siguiente ecuación:
      
4. Al igual que su contraparte en ratones³⁰, LIQ HDR registra una variedad de variables de microestructura de la ingesta, incluyendo la duración de lamidos, número de episodios, duración de episodios, número de lamidos por episodio y duración de lamidos por episodio (Figura 6K). Un episodio de ingesta se define como una serie de lamidos que comienza con al menos 3 lamidos realizados en menos de 1 segundo y termina tras transcurrir 3 segundos sin lamidos adicionales. Estas medidas pueden utilizarse luego para calcular la duración promedio individual de cada lamido, la duración promedio individual de cada episodio, el número promedio de lamidos por episodio, la frecuencia promedio de lamidos, el intervalo estimado entre lamidos y el intervalo estimado entre episodios.
   NOTA: La interfaz del microcontrolador proporciona estos datos de microestructura con una resolución de 1 minuto en un archivo .csv (Figura 6K). Los investigadores pueden utilizar la aplicación de análisis proporcionada con el protocolo original de LIQ HD³⁰ o su plataforma de postprocesamiento preferida para agrupar y resumir los datos según las necesidades de la investigación. Los datos de microestructura normalmente se suman durante todo el período de 24 h para comparar diferencias promedio a nivel macroscópico, o en intervalos de 30 min a 1 h para examinar las variaciones en los patrones de ingesta a lo largo de un ciclo luz-oscuridad.

Resultados

Datos estándar de consumo de EtOH en jaula domiciliaria con elección intermitente de dos botellas
Mediante el procedimiento estándar (Figura 7A), los investigadores pueden registrar la ingesta durante 24 h (Figuras 7B-D) así como el consumo similar a atracón si se registran los pesos de las botellas poco después del inicio de la sesión de consumo (Figuras 7E-F). Al calcular la ingesta de etanol en relación con la ingesta de agua, los investigadores también pueden obtener datos de preferencia en todos los puntos temporales medidos (Figuras 7D,F). Como se muestra en la Figura 7C, las ratas frecuentemente presentan un período de aumento en la ingesta de etanol durante los primeros días de acceso con elección de dos botellas. Esto va seguido de una meseta en la que la ingesta permanece relativamente estable. Aunque este patrón se observa consistentemente en ratas macho^{7,32,33,34,35,36}, no siempre se observa en hembras. En cambio, algunos estudios informan niveles estables de ingesta de etanol durante todo el período del estudio en ratas hembra^37,38. Además, algunos estudios sugieren que la ingesta de etanol podría aumentar aún más con períodos más prolongados de acceso^36,39. La ingesta diaria puede variar significativamente entre individuos. Sin embargo, la ingesta diaria promedio ha sido bien caracterizada para las cepas más comúnmente utilizadas en la investigación del alcohol y puede utilizarse como referencia para evaluar el éxito al analizar datos agrupados^{7,8,33,34,35,39}.

Como se muestra en la Figura 7E, muchas ratas consumen una porción significativa de su ingesta diaria de etanol poco después del inicio de la sesión de consumo^8,33. Este patrón de ingesta de etanol similar a un atracón suele asociarse con una preferencia significativa por el etanol frente al agua (Figura 7F). Sin embargo, los investigadores no deberían sorprenderse si la preferencia durante 24 h no supera el 50%. Esto es particularmente cierto para cepas de roedores no endogámicas o que no prefieren el alcohol, y para estudios limitados a períodos relativamente cortos de acceso a elección de dos botellas^{7,32,33,35,37}.

Validación del LIQ HDR para el análisis de la microestructura del consumo en el paradigma de elección entre dos botellas
La incorporación del sistema LIQ HDR al paradigma estándar de elección entre dos botellas en ratas permite a los investigadores predecir con precisión y exactitud el consumo a partir de los datos registrados de bebida. Esto se confirma por la presencia de una correlación fuerte y significativa entre el número acumulado de lamidos detectados y el cambio en el peso de las botellas, tanto para la botella de EtOH (R² = 0.7789, F_(1,113) = 398.1, p < 0.0001) como para la de H₂O (R² = 0.7910, F_(1,117) = 442.9, p < 0.0001) durante un período de 24 h (Figura 8A). Lo mismo ocurre en los días en que las ratas recibieron dos botellas con H₂O (R² = 0.8875, F_(1,188) = 1484, p < 0.0001; Figura 8B).

LIQ HDR también permite un análisis preciso de los patrones de consumo con una alta resolución temporal que no ofrece el paradigma estándar de elección entre dos botellas. Mediante este enfoque, los investigadores tienen la oportunidad de examinar diferencias en los patrones de consumo entre distintas soluciones, a lo largo del ciclo de luz, entre sexos, grupos farmacológicos y más. Por ejemplo, agrupar los lamidos promedio en intervalos de 30 minutos permite un análisis sencillo de los patrones promedio de consumo durante 24 h. Como era de esperar, este análisis revela ingestas significativamente mayores tanto de EtOH como de H₂O durante el ciclo oscuro, cuando las ratas están despiertas, en comparación con el ciclo claro, cuando las ratas suelen estar durmiendo (Figura 8C). Utilizando un enfoque similar, los investigadores pueden explorar diferencias entre grupos en los patrones de consumo. Por ejemplo, la microestructura del consumo puede compararse entre ratas macho y hembra analizando el número promedio de lamidos de EtOH (Figura 8D) o de agua (Figura 8E) a lo largo de un período de 24 h. Para investigar el consumo inicial intenso y/o el consumo similar al atracón, los investigadores pueden aumentar la resolución de su análisis centrándose en el consumo que ocurre poco después del inicio de la sesión, utilizando ventanas de agrupamiento más pequeñas para resumir los datos. Al hacerlo, los investigadores pueden estudiar períodos de consumo similares al atracón sin necesidad de recopilar múltiples mediciones de peso de botella dentro de un período de 24 h. Como se muestra en el Figura 8C (inseto), este análisis revela que la mayor parte del consumo capturado mediante una medición de peso de botella obtenida 30 minutos después del inicio de la sesión ocurre en los primeros 5 minutos, en lugar de distribuirse a lo largo de los 30 minutos. Datos como estos pueden ayudar a identificar los puntos temporales óptimos para la recolección de muestras de sangre con el fin de medir la concentración sanguínea de etanol (BEC). De hecho, se observó un patrón similar de consumo inicial intenso en un día de consumo diferente, durante el cual se registraron patrones de consumo de alta resolución en un período tan breve como 15 minutos (Figura 8F). Los lamidos promedio registrados durante esta sesión predijeron de manera confiable el cambio en el peso de la botella (EtOH: R² = 0.6316, F_(1,10) = 17.15, p = 0.0020; H₂O: R² = 0.8601, F_(1,10) = 61.47, p < 0.0001; Figura 8G). Además, las BEC obtenidas a partir de muestras de sangre recolectadas 15 minutos después del inicio de la sesión se correlacionaron bien con el número de lamidos detectados (R² = 0.4327, F_(1,10) = 7.627, p = 0.0201; Figura 8H), incluso con niveles relativamente bajos de ingesta de EtOH.

LIQ HDR captura diversas medidas de la microestructura de la ingesta de líquidos, que se detectan y calculan en tiempo real durante las sesiones de bebida y se guardan en intervalos de 1 minuto, de forma similar a la detección de lamidos (Figura 6K). Estas medidas se describen brevemente en el paso 5.4 y se han definido previamente³⁰. Los investigadores pueden realizar análisis detallados de los cambios en la microestructura individual de la ingesta y examinar cómo y en qué medida los patrones de bebida contribuyen a las diferencias en la ingesta total. Por ejemplo, encontramos que aunque las ratas macho y hembra exhibieron un número similar de lamidos, episodios de bebida y duración de los episodios (Figura 9A-C) al ingerir agua, esto se asoció con una ingesta total mayor (g/kg) en las hembras que en los machos (prueba t; t=2.882, gl=10, p=0.0163; Figura 9D). Esto era esperado dada la dimorfismo sexual en el peso corporal, lo cual facilita niveles mayores de ingesta por peso corporal en las hembras que en los machos para un número equivalente de lamidos. Llamativamente, esto contrasta con la comparación de las diferencias sexuales en los patrones de microestructura para EtOH, que reveló una microestructura de bebida similar asociada con niveles similares de ingesta de EtOH (Figuras 9E-H). Estos datos sugieren que, aunque el volumen por lamido de agua es similar entre sexos, en comparación con los machos, las ratas hembra tienen un volumen por lamido menor para EtOH. En conjunto, estos datos microestructurales respaldan la idea de que las ratas macho y hembra probablemente difieren en sus estrategias de bebida voluntaria según el tipo de líquido consumido en el entorno de la jaula domiciliaria. Trabajos previos también han reportado diferencias sexuales en las estrategias de bebida que dependen del tipo de líquido^40,41, aunque las diferencias observadas en esos estudios no se limitaron únicamente al consumo de agua. La duración de la historia de bebida podría desempeñar un papel en las diferencias observadas entre estudios, ya que en el conjunto de datos actual el acceso a elección de dos botellas se limitó a 5 semanas, mientras que en trabajos previos superó las 12 semanas^40,41.

Figura 1: Consumo en jaula domiciliaria con elección de dos botellas. (A) Los investigadores pueden medir la ingesta voluntaria de etanol en la jaula domiciliaria y la preferencia (en relación con el agua) mediante un método estándar que calcula la ingesta basándose en el cambio de peso de las botellas. (B) Al utilizar LIQ HDR, un sistema casero de bajo costo para la detección de lamidos en la jaula domiciliaria diseñado para ratas, los investigadores pueden obtener las mismas mediciones que en el procedimiento estándar de elección de dos botellas, al tiempo que registran la microestructura detallada del consumo durante todo el período de grabación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Construcción de unidades sensoras capacitivas. (A) Componentes electrónicos y diagrama de conexiones. (B) Materiales necesarios para construir tres unidades sensoras capacitivas requeridas para armar un sistema LIQ HDR. (C) Soldar cables conectores hembra de 2 pines para las jaulas #1-6 a los pines #0-11 del tablero A y asegurar las uniones soldadas con pegamento caliente. Codificar los cables por colores utilizando tubos termorretráctiles de colores y etiquetar cada uno con un número de identificación único del lickómetro. (D) Conectar el tablero A y el convertidor de nivel de 5 V a 3 V a un punto final de comunicación diferencial I²C mediante cables de 4 pines (1), y alojar el tablero A y el módulo de comunicación en la carcasa impresa en 3D (2-3). (E) Cambiar las direcciones I²C de los tableros B y C soldando un puente desde el pin ADDR al pin 3Vo y al pin SDA, respectivamente. (F) Soldar cables conectores hembra de 2 pines a los tableros sensores B y C, etiquetarlos con los números de identificación correspondientes del lickómetro y conectar el tablero B a un punto medio de comunicación y el tablero C a un punto final mediante cables de 4 pines. (G) Colocar las unidades sensoras B y C en sus respectivas cajas impresas en 3D y conectar en cadena las tres unidades mediante cables Ethernet. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Construya el lickómetro LIQ HDR. (A) Representación 3D de los componentes dentro de la jaula. (B) Materiales para configurar un lickómetro de dos botellas. Tenga en cuenta que un sistema LIQ HDR acomoda 18 lickómetros de dos botellas. (C) Alargue la longitud del cable del conector macho de 2 pines con un par de cables negro y rojo y codifíquelos por colores usando tubos termorretráctiles. (D) Pase los cables negro y rojo a través de las aberturas izquierda (L) y derecha (R) del soporte de botellas (1) y suelde los extremos a las cintas de cobre (2-3). (E) Adhiera las cintas de cobre a las paredes internas de los soportes del pico (1-2) y refuércelas con pegamento caliente (3-4). (F) Pase el cable a través del protector del cable. (G) Instale la abrazadera del cable. (H) Etiquete el conector con el número de identificación correspondiente al lickómetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Instalación del lickómetro. (A) Utilice cinta aislante para cubrir las varillas metálicas alrededor de las aberturas de los bebederos en la tapa metálica de la jaula. (B) Instale el lickómetro y el panel de acrílico en la tapa de la jaula con dos juegos de tornillos y tuercas M5. (C) Fije el sujetador de cable a la varilla más externa de la tapa de alambre de la jaula. (D) Asegúrese de utilizar el protector de cable adecuado (izquierdo L o derecho R) para cada jaula. (E) Asegúrese de que solo ~2 cm de los bebederos de las botellas queden expuestos (1), de modo que cuando las botellas se coloquen sobre la jaula (2), solo las puntas de los bebederos sobresalgan del panel de acrílico y estén accesibles para las ratas. (F) La tapa del filtro debe colocarse sobre el sujetador de cable sin alterar el cable en sí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Instalación y uso del bloqueador de bebederos. (A) Representación 3D del bloqueador de bebederos. (B) Piezas personalizadas impresas en 3D para un bloqueador de bebederos. (C) Ensamblar las piezas impresas en 3D. (D) Instalar el bloqueador ensamblado en la tapa de la jaula con un tornillo M5 + tuerca + arandela. (E) Girar el dial en sentido horario para bloquear el acceso a los bebederos. (F) Girar el dial en sentido antihorario para retirar los bloqueadores de los bebederos (1), levantar los bloqueadores y rotarlos 90° (2), y continuar girando el dial en sentido antihorario hasta que los bloqueadores estén por encima de la tapa de la jaula (3-4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Configuración del vivario y operación de la interfaz gráfica de usuario (GUI). (A) Configuración recomendada del vivario y diagrama de cableado (B) Monte cada unidad sensora en los estantes y organice y estabilice los cables de los sensores en los estantes. (C) Monte la interfaz del microcontrolador en los estantes y conecte su puente de 4 pines al convertidor de nivel de 5 V a 3 V conectado a la unidad del sensor A. (D) Sujete el cable de tierra adicional con cinta aislante. (E) Conecte los cables del sensor a los cables correspondientes del lickómetro. (F) Conecte la fuente de alimentación para encender la interfaz del microcontrolador. (G) Página principal de la interfaz GUI. (H) Golpear Configuración para ajustar el horario de encendido/apagado de las luces al programa de iluminación del vivario (1) y toque Configuraciones del sensor para ajustar los umbrales de contacto y liberación en ratas (2). (I) Para registrar datos, seleccione el lado de la botella de EtOH en la página principal, golpear suavemente ¡EMPEZAR! para calibrar los sensores (1) e iniciar la grabación (2). Toque Actualizar para actualizar el número de lamidos que se muestra en la pantalla, y toque Guardar & Salir para detener la grabación. (J) Golpear suavemente Expulsar SD en la página principal para extraer la tarjeta SD y transferir los datos. Toque Montar SD después de insertar la tarjeta SD. (K) Captura de pantalla de un archivo de datos brutos representativo que ilustra cómo los datos de microestructura se guardan en intervalos de 1 minuto mediante la interfaz del microcontrolador Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Datos representativos de consumo en el paradigma de elección entre dos botellas obtenidos mediante el procedimiento estándar. En el paradigma de acceso intermitente a dos botellas con elección de etanol (EtOH) en la jaula doméstica, (A) las ratas reciben una solución de EtOH al 20% (v/v) (naranja) y H₂O (azul) los lunes, miércoles y viernes (LMF), y dos botellas que contienen H₂O los martes, jueves y fines de semana. (B) Las mediciones del consumo diario de líquido revelan que, aunque las ratas mantienen un nivel relativamente constante de ingesta total de líquido (mL) durante todo el período del estudio, (C) a menudo muestran un aumento en la ingesta de EtOH durante las primeras sesiones de consumo, tras lo cual los niveles se estabilizan. (D) Este patrón de aumento y mantenimiento se refleja de manera similar en la preferencia por el EtOH. Los investigadores también pueden registrar la ingesta de EtOH similar a un atracón (E) si se pesan las botellas después de los primeros 30-60 minutos desde el inicio de la sesión. (F) Esto suele asociarse con una alta preferencia por el EtOH frente al H₂O. Las barras de error sombreadas representan ± EE (n = 32 para machos y n = 16 para hembras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: LIQ HDR capta con precisión el consumo con alta resolución temporal. La precisión y exactitud del sistema LIQ HDR se confirma, en parte, por la presencia de una correlación positiva significativa entre el número de lamidos y el cambio en el peso del frasco en los días en que las ratas reciben (A) H₂O y EtOH, así como en (B) los días en que ambos frascos contienen H₂O. (C) Las diferencias en los patrones de consumo entre H₂O (azul) y EtOH (naranja) durante el período de 24 h pueden evaluarse fácilmente agrupando los lamidos promedio en intervalos de 30 minutos. El recuadro corresponde al promedio de lamidos en intervalos de 5 minutos durante los primeros 30 minutos de acceso a los frascos (resaltados en gris), período en el cual las ratas a menudo exhiben un comportamiento significativo de carga inicial. Las diferencias entre grupos en los patrones de consumo también pueden examinarse mediante un enfoque similar, como se ejemplifica con la microestructura de lamidos para (D) EtOH y (E) H₂O representada en ratas macho y hembra a lo largo de un período de 24 h. (F) Los patrones de consumo también pueden evaluarse con alta resolución temporal durante un período de prueba más corto, (G) durante el cual LIQ HDR continúa registrando con precisión la ingesta y (H) prediciendo la concentración sanguínea de etanol (BEC), incluso con niveles relativamente bajos de ingesta de EtOH. Las barras de error sombreadas representan ± EE (n = 6 para cada sexo). Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9: Datos representativos de la microestructura de la ingesta de líquidos. LIQ HDR permite registrar medidas de la microestructura del consumo de bebidas, incluyendo (A) el número de lamidos, (B) el número de episodios de ingesta y (C) la duración del episodio, además de (D) medir la ingesta total de agua mediante el cambio en el peso del frasco. (E-H) Se pueden obtener medidas similares para el etanol. Las comparaciones entre grupos de estas medidas pueden identificar patrones de consumo distintos, como ocurre en el ejemplo actual, que revela diferencias según el sexo en las estrategias de ingesta dependiendo de la solución consumida. La línea continua indica la mediana, y las líneas punteadas indican los cuartiles (n = 6 para cada sexo); prueba t no apareada; *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Configuración de la interfaz del microcontrolador. (A) Componentes electrónicos y diagrama de conexiones. (B) Materiales necesarios para construir la interfaz del microcontrolador requerida para un sistema LIQ HDR. (C) En el lado posterior del escudo táctil capacitivo, agregue un puente de soldadura a través de las almohadillas de soldadura de la retroiluminación. (D) En el lado posterior del escudo de registro de datos, corte la pista del puente de la patilla CS (1). Suelde un cable puente desde la patilla CS hasta la patilla #7 (2). (E) Suelde pines de encabezado al registrador de datos utilizando el escudo táctil como base. (F) Apile el encabezado restante de 2x4 en el microcontrolador (1), coloque el registrador de datos sobre el microcontrolador y suelde el encabezado en su lugar (2). (G) Inserte la batería de tipo moneda en el registrador de datos (1), coloque la pantalla táctil sobre el registrador de datos e inserte la tarjeta SD en el registrador de datos (2). (H) Para hacer el cable de tierra adicional, corte un conector macho del cable puente y suelde el extremo a un cable de núcleo sólido pelado. (I) Conecte los cables puente de 4 pines y el cable de tierra adicional al microcontrolador (1) y fíjelos con pegamento caliente (2). (J) Coloque la interfaz del microcontrolador en la carcasa personalizada impresa en 3D. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo actual proporciona instrucciones paso a paso para capturar datos de consumo de etanol utilizando un procedimiento de jaula casera de dos botellas de acceso intermitente. Este método se puede implementar con relativa facilidad y con poco o ningún costo o necesidad de equipo de investigación especializado. Utilizando los procedimientos proporcionados aquí para construir e implementar LIQ HDR, un sistema de detección de lamidas para su uso en ratas, los investigadores pueden capturar datos de microestructura de consumo de alta resolución además de medidas estándar de ingesta y preferencia.

El programa de acceso intermitente descrito en el protocolo actual es un procedimiento ampliamente utilizado en gran parte porque es bien sabido que genera niveles más altos de ingesta de etanol que muchos programas alternativos de acceso al etanol. De hecho, investigaciones anteriores han demostrado que las ratas con acceso en un horario intermitente tienen una ingesta diaria promedio de etanol más alta que las ratas con acceso continuo de 24 h ^6,7. Sin embargo, pueden ser deseables diferentes programas de acceso al etanol dependiendo de la pregunta de investigación u otros parámetros de diseño experimental. Los investigadores pueden modificar muy fácilmente el protocolo actual para adaptarse a diferentes horarios (por ejemplo, acceso continuo, beber en la oscuridad, etc.) simplemente cambiando la hora y los días de encendido / apagado de la botella.

Aunque el consumo de dos botellas es un paradigma relativamente simple de implementar, pueden surgir problemas que tienen el potencial de comprometer la recopilación de datos. Por lo tanto, es crucial que los experimentadores inspeccionen los datos a diario para identificar rápidamente posibles problemas. En particular, los investigadores deben prestar mucha atención a los cambios muy grandes o muy pequeños en el peso de las botellas que pueden ser indicativos de un sorbo con fugas u obstruido, respectivamente. Detectar signos de estos problemas a tiempo puede evitar la exclusión de todos los datos de un tema determinado del análisis. De hecho, si los investigadores notan cambios drásticos (o ausencia de cambios) en el peso de la botella durante un período de 24 horas, un simple cambio a una nueva botella puede ayudar a confirmar si una botella determinada debe retirarse de la circulación. Por estas razones, es aconsejable tener botellas y sorbos adicionales a mano. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que algunas ratas exhiben naturalmente niveles muy bajos de consumo de etanol, por ^ejemplo,35. Esto es particularmente cierto para las ratas de ciertas cepas, ver⁸ para una revisión. Por lo tanto, los investigadores no deben alarmarse si una pequeña población de animales en un experimento determinado tiene un consumo de etanol bajo o nulo. Del mismo modo, algunos animales son propensos a jugar con el sorbo/botella de manera que pueda promover el derrame. Aunque son raros, los casos repetidos de cambios altos en el peso de la botella que no están asociados con el consumo pueden requerir que un animal en particular sea retirado del experimento.

Nuestro detallado protocolo paso a paso demuestra la facilidad de implementación y uso del sistema LIQ HDR para ratas. Los investigadores sin conocimientos o habilidades previas en electrónica y programación de microcontroladores pueden adaptar fácilmente este sistema a sus necesidades experimentales con poca o ninguna modificación. Nuestros datos representativos demuestran aún más su aplicación exitosa para estudios de consumo de agua en jaulas caseras de ratas y su poderosa capacidad para capturar numerosas medidas de microestructura de consumo de agua a alta resolución temporal. LIQ HDR incluye varias modificaciones de diseño en relación con su predecesor de mouse³⁰. Esto se hizo no solo como una necesidad para una adaptación exitosa para su uso en ratas, sino también para mejorar la funcionalidad y la experiencia del usuario. Los componentes de la jaula, incluido el portabotellas impreso en 3D, el bloqueador de sorbos y los componentes electrónicos, se reubican en la parte superior de la jaula para protegerlos contra la masticación, lo que puede provocar una pérdida frecuente y significativa de datos y rotación de hardware. La adición de un panel acrílico cortado con láser ayuda a prevenir la destrucción de estos componentes vulnerables. Aparte del panel acrílico, que es el mismo material que una jaula de ratas de caja de zapatos estándar, todos los demás componentes LIQ HDR son inaccesibles para el animal desde el interior de la jaula o solo accesibles por un breve momento durante el cambio de botella. Este diseño limita el potencial de destrucción de los componentes del dispositivo y el riesgo para el animal a través de la ingestión de artículos no alimentarios. A diferencia de las botellas hechas a medida que requieren mucha mano de obra utilizada en el diseño LIQ HD, el portabotellas impreso en 3D de LIQ HDR está diseñado para ser compatible con las botellas comerciales para roedores listas para usar. Las botellas se instalan en la parte superior de la jaula y son accesibles para las ratas de la misma manera que se aplican las botellas para beber durante el cuidado y la cría estándar. La adición de bloqueadores de sorbos es una solución simple pero efectiva que mejora la confiabilidad del sistema y evita la pérdida de datos valiosos que, en ausencia del bloqueador, puede resultar de la bebida que ocurre antes de iniciar la captura de datos en la interfaz Arduino o las medidas erróneas de lamido que ocurren cuando las ratas interactúan con los sorbos durante la calibración diaria. Si bien las jaulas para ratas considerablemente más grandes requieren aumentar el tamaño del diseño de hardware original, el uso de cables significativamente más largos puede afectar negativamente la sensibilidad y precisión de la detección capacitiva debido a la interferencia, así como la integridad de la comunicación I²C entre las placas de sensores conectadas en cadena y la interfaz Arduino. Evitamos este problema con la adopción del sistema de comunicación diferencial I²C para lograr una transmisión de señal de ultra largo alcance y casi sin pérdidas a través de cables Ethernet. Los materiales utilizados para los componentes de la jaula permiten una fácil limpieza y desinfección entre usos. El lickómetro se puede esterilizar y limpiar con una solución de EtOH al 70%, mientras que se debe tener cuidado para garantizar que los componentes eléctricos, como la cinta de cobre conductora, permanezcan intactos. Los equipos no eléctricos que están en contacto directo con el animal, como el bloqueador de sorbos y el panel acrílico, se pueden lavar a fondo con agua tibia y jabón.

La confiabilidad y efectividad de cualquier sistema de detección de lamidas requiere una construcción e instalación adecuadas, así como pruebas exhaustivas, monitoreo diligente de errores y resolución de problemas efectiva. Todos los componentes de bricolaje deben fabricarse y ensamblarse con habilidad y cuidado. Esto es especialmente importante para los pasos que involucran soldadura, que pueden requerir práctica para principiantes. Independientemente, se requieren pruebas exhaustivas de todos los lickómetros antes de su uso en experimentos reales. Si el sistema debe modificarse para adaptarse a las necesidades experimentales individuales, es posible que sea necesario ajustar aún más la configuración del sensor (por ejemplo, los umbrales de toque y liberación) para una detección precisa de lamidos. Para los usuarios primerizos, sugerimos probar el sistema en un breve estudio piloto de muestra pequeña utilizando una solución altamente apetecible que generará altos niveles de consumo de alcohol. La detección de lamidas se puede verificar en tiempo real inspeccionando visualmente la placa del sensor mientras el LED parpadea cada vez que se registra una lamida. Las correlaciones fuertes, significativas y consistentes entre el número de lamidas y el cambio en el peso de la botella deben usarse como punto de referencia para la configuración adecuada del hardware y el software. Incluso después de finalizar la configuración, recomendamos iniciar la grabación de un experimento determinado en un día en que las ratas reciben dos botellas que contienen agua para solucionar problemas del equipo que pueden ser evidentes al comienzo de un experimento. También puede ser ventajoso probar la función del lickómetro en el día del agua asociado con el cambio de jaula, ya que esto requiere que los lickómetros se desconecten y se vuelvan a conectar al sensor. La falla aleatoria del lickómetro o sensor individual, que daría como resultado datos atípicos muy obvios (por ejemplo, no se detectaron o se detectaron pocos licks a pesar de un cambio sustancial en el peso de la botella) de manera consistente para el mismo lickometer, es indicativo de componentes defectuosos. Recomendamos preparar con anticipación los componentes adicionales para cada elemento del sistema de lickometer para permitir un fácil reemplazo según sea necesario. Finalmente, no se puede exagerar la importancia de asegurarse de que los cables de los sensores no se superpongan o se doblen excesivamente. Si lo hace, puede resultar en casos aleatorios de detección deficiente de lamidos, evidentes por un número de lamidos irrazonablemente bajo para un cambio dado en el peso de la botella o duraciones de lamido extremadamente grandes (cerca de 60,000 ms para un contenedor de 1 minuto) que abarcan minutos u horas. Sin embargo, las pequeñas pérdidas de datos son inevitables en los estudios que recopilan datos durante 24 horas para muchos animales durante muchos días utilizando el enfoque estándar o equipado con un lickómetro. Los investigadores pueden excluir datos erróneos para las raras sesiones de bebida cuando los pesos de las botellas y / o lamidas claramente no reflejan la ingesta (por ejemplo, obstrucción del sorbo, error de calibración, etc.). En ocasiones como estas, el valor promedio para una medida determinada (por ejemplo, ingesta (g / kg), lamidas, etc.) durante el período de estudio para ese sujeto en particular puede sustituirse por el valor faltante durante el análisis de datos. El ANOVA de efectos mixtos también se puede utilizar como alternativa para acomodar los puntos de datos faltantes.

Una de las ventajas del paradigma de consumo de dos botellas es el aspecto voluntario de la ingesta de etanol. Esto ofrece una excelente validez aparente, particularmente a la luz de los hallazgos que muestran que el alcohol administrado por el experimentador puede producir efectos significativamente diferentes sobre la función cerebral y el comportamiento en comparación con el alcohol autoadministrado voluntariamente⁴². Además, la naturaleza voluntaria del paradigma permite a los investigadores capturar diferencias individuales en la ingesta similares a la variabilidad en la preferencia por el alcohol y los patrones de consumo observados en los humanos. Estas diferencias individuales pueden proporcionar una poderosa oportunidad para que los investigadores correlacionen el consumo (ingesta y/o patrones) con la magnitud de los efectos patológicos observados.

Sin embargo, se deben considerar algunas limitaciones del paradigma de beber en jaulas caseras de dos botellas. Por ejemplo, aunque la variabilidad individual en la ingesta de etanol puede ser ventajosa para algunos experimentos, puede ser una desventaja en otros experimentos en los que puede ser deseable un nivel constante de intoxicación o exposición al etanol. Esto es particularmente cierto para los experimentos que examinan las consecuencias de la dependencia y la abstinencia de la exposición crónica al etanol. Es importante destacar que el consumo de alcohol de dos botellas no se caracteriza como un modelo de dependencia, incluso en ratas con acceso a etanol durante períodos prolongados de tiempo. Por lo tanto, en ausencia de síntomas acompañantes de abstinencia, los investigadores deben tener cuidado al interpretar las consecuencias del consumo prolongado de etanol como efectos de dependencia y/o abstinencia. De hecho, es posible, si no plausible, que las ratas que beben cantidades relativamente grandes de etanol durante el procedimiento de elección de dos botellas presenten síntomas de abstinencia, pero que las ratas que beben volúmenes totales más bajos en un período dado de 24 h no muestren signos similares de dependencia. Los patrones de bebida también pueden desempeñar un papel importante en esta consideración, ya que dos animales que beben la misma cantidad durante un período de 24 h pueden experimentar niveles muy diferentes de intoxicación (es decir, BEC) dependiendo del patrón de su ingesta de etanol²². Esto destaca la utilidad de LIQ HDR en el procedimiento de elección de dos botellas, ya que puede identificar fácilmente a las ratas que consumen una dosis determinada de etanol a un ritmo rápido (es decir, trago) frente a aquellas que consumen la misma dosis a un ritmo mucho más lento (es decir, sorbo). Aunque es potencialmente indeseable para los estudios que investigan los efectos de una dosis controlada de etanol, la detección de cambios en los patrones de consumo (p. ej., reducción de episodios de atracones) después de una intervención experimental en particular tiene un valor traslacional significativo dado el enfoque de reducción de daños que se persigue cada vez más en la clínica. Finalmente, no se requiere esfuerzo para que los animales obtengan acceso al etanol en los paradigmas de consumo de jaulas domésticas, incluido el que se describe aquí. Por lo tanto, la utilidad de este paradigma se limita al análisis de la bebida sola, mientras que los métodos operantes se favorecen para los casos en que los investigadores están interesados en examinar la búsqueda de alcohol, una característica importante del AUD.

En resumen, el protocolo descrito aquí proporciona a los investigadores toda la información y los recursos necesarios para medir la ingesta de etanol en ratas en el entorno de jaulas domésticas. Presentamos opciones para enfoques de resolución relativamente baja y alta que brindan a los investigadores la flexibilidad de elegir el método que sea más adecuado para sus necesidades de investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Componentes disponibles en el mercado			Cantidad
12 teclas Conexión del sensor táctil capacitivo (MPR121)	Adafruit	1982	3
de cable de 2 pines (JST XH 2.5mm paso)	Adafruit	4872	18
Puente de placa de pruebas de 4 pines (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
Cable de 4 pines (Qwiic de 100 mm)	SparkFun	PRT-17259	1
cable de 4 pines (Qwiic de 50 mm)	SparkFun	PRT-17260	3
Salida de cambio de nivel de 5 V a 3 V	Adafruit	5637	1
Pantalla táctil capacitiva (2,8 pulgadas)	Adafruit	1947	1
Cinta conductora de cobre (1/4 de pulgada)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND	1
Datos escudo de registro	Adafruit	1141	1
Kit de conexión de comunicación diferencial I2C (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Cinta aislante	DigiKey	3M156004-ND	1
Tubo termorretráctil (3/16 pulgadas varios colores)	Bridas y más	HS357-S10	6
Kit de tubos termorretráctiles (4 pulgadas negro)	Jameco	2095963	1
Batería de botón de litio (3V 12.5mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
arandela plana M5	Grainger	54FN66	1
tuerca hexagonal M5	Grainger	6CA72	1
de máquina M5 (12mm)	Grainger	6GU88	1
de máquina M5 (25mm)	Grainger	6GU91	2
Cable de puente macho/macho	Adafruit	1957	1
Placa de microcontrolador (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
filamento PETG (plata de 2.85mm)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
filamento PLA (2.85mm negro)	Filamento MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
PLA (plata de 2.85mm)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Fuente de alimentación (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
tarjeta de memoria SD/microSD (8GB)	Adafruit	1294	1
Cabezales de apilamiento	Shield Adafruit	85	1
Cable de núcleo sólido (22AWG rojo)	Adafruit	288	1
Cable de núcleo trenzado (22AWG negro)	Adafruit	2976	1
Alambre de núcleo trenzado (22AWG rojo)	Adafruit	3068	1
Tubo sorbedor de tapa giratoria con bola	Diseño alternativo	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Botella de agua (8oz)	Diseño alternativo	WB8FS	38
Componentes impresos en 3D personalizados			Cantidad
Fondo de caja Arduino impreso en 3D	N/A	ARDUINO_Bottom.stl	1
tapa de caja Arduino impresa en 3D	N/A	ARDUINO_Top.stl	1
pinza de cable impresa en 3D L	N/A	CLIP_L.stl	18
tuerca de clip de cable impresa en 3D	N/A	CLIP_Nut.stl	18
pinza de cable impresa en 3D	N/	A CLIP_R.stl	18
portabotellas de lickómetro impreso en 3D	N/A	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Protector de cable de lickómetro impreso en 3D L	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Protector de cable de lickómetro impreso en 3D R	N/	A LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
letras de lickómetro impresas en 3D	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
tornillo de montaje impreso en 3D	N/A	Tornillo de montaje.stl	4
Caja de sensor impresa en 3D A inferior	N/A	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Caja de sensor impresa en 3D A top	N/A	SENSOR_A_Top.stl	1
caja de sensor impresa en 3D B inferior	N/A	SENSOR_B_Bottom.stl	1
caja de sensor impresa en 3D B top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
caja de sensor impresa en 3D C inferior	N/A	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Caja de sensor impresa en 3D C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Letras de la caja del sensor impresa en 3D	/A	SENSOR_Letters.stl	1
Bloqueador de sorbos impreso en 3D	N/A	SIPPER_Blocker.stl	36
Base de bloqueador de sorbos impresa en 3D	N/A	SIPPER_Base.stl	18
Engranaje de bloqueo de sorbos impreso en 3D	N/A	SIPPER_Gear.stl	18
Tuerca bloqueadora de sorbos impresa en 3D	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
Gusano bloqueador de sorbos impreso en 3D	N/A	SIPPER_Worm.stl	18
Panel acrílico de lickómetro cortado con láser	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19

pares tornillo tornillo R N