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Artículo de método

Modelado del consumo de alcohol en roedores mediante el consumo de alcohol en jaulas caseras de dos botellas y análisis microestructural

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DOI:

10.3791/67486

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8 de noviembre de 2024

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un paradigma estándar de consumo de alcohol en jaula en casa de acceso intermitente y dos botellas para modelar el consumo de alcohol en ratas. Además, proporciona instrucciones paso a paso para aumentar el protocolo estándar con un sistema de detección de lamidos de bricolaje que permite el análisis microestructural del comportamiento de la bebida.

Resumen

La elección de dos botellas para beber en jaulas en casa es uno de los paradigmas más utilizados para estudiar el consumo de etanol en roedores. En su forma más simple, los animales tienen acceso a dos botellas de bebida, una de las cuales contiene agua del grifo regular y la otra etanol, con una ingesta diaria medida por el cambio en el peso de la botella durante el período de 24 horas. En consecuencia, este enfoque no requiere equipo de laboratorio especializado. Si bien esta facilidad de implementación es probablemente el mayor contribuyente a su adopción generalizada por parte de los investigadores preclínicos del alcohol, la resolución de los datos de consumo de alcohol adquiridos con este enfoque está limitada por el número de veces que el investigador mide el peso de la botella (por ejemplo, una vez al día). Sin embargo, el deseo de examinar los patrones de consumo de alcohol en el contexto de la ingesta general, las intervenciones farmacológicas y las manipulaciones neuronales ha impulsado el desarrollo de sistemas de detección de lamidos en jaulas caseras que pueden adquirir datos a nivel de lamidos individuales. Aunque varios de estos sistemas se han desarrollado recientemente, el sistema de código abierto, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), ha atraído una atención significativa en el campo por su asequibilidad y facilidad de uso. Aunque emocionante, este sistema fue diseñado para su uso en ratones. Aquí, revisamos los procedimientos apropiados para el consumo de agua en jaula en casa estándar y equipado con un lickómetro de dos botellas. También introducimos métodos para adaptar el sistema LIQ HD a las ratas, incluidas modificaciones de hardware para acomodar un tamaño de jaula más grande y un soporte de botella impreso en 3D rediseñado compatible con botellas de bebida estándar listas para usar. Con este enfoque, los investigadores pueden examinar los patrones diarios de bebida, además de los niveles de ingesta en muchas ratas en paralelo, aumentando así la resolución de los datos adquiridos con una inversión mínima en recursos adicionales. Estos métodos proporcionan a los investigadores la flexibilidad de utilizar botellas estándar o un aparato equipado con un lickómetro para interrogar los mecanismos neurobiológicos que subyacen al consumo de alcohol, en función de sus necesidades experimentales precisas.

Introducción

Aunque el consumo moderado de alcohol se ha asociado históricamente con beneficios moderados para la salud, recientes estudios exhaustivos a gran escala han revelado que ninguna cantidad de consumo de alcohol es segura1,2. De hecho, el consumo de alcohol es el7º factor de riesgo principal de muerte y discapacidad a nivel mundial1 y las personas que beben incluso pequeñas cantidades de alcohol tienen un mayor riesgo de cáncer, enfermedades infecciosas y lesiones1,3. En los Estados Unidos, las muertes por consumo de alcohol aumentaron casi un 30% entre 2016 y 20214. Es importante destacar que el riesgo de muerte y discapacidad aumenta monótonamente con el aumento del consumo1.

Aunque los estudios en humanos han proporcionado información valiosa sobre la neurobiología del uso y abuso del alcohol, el control experimental proporcionado por los modelos animales es crucial para una comprensión profunda de los mecanismos que subyacen al comportamiento de consumo y el riesgo de consumo excesivo de alcohol. Estos modelos también son herramientas valiosas para el desarrollo de tratamientos destinados a reducir el consumo descontrolado. El consumo de alcohol en jaulas en casa con dos biberones es uno de los paradigmas preclínicos más utilizados para estudiar el consumo de alcohol en roedores. Esto se debe, en gran parte, a su facilidad de implementación, ya que permite medir el consumo voluntario total de alcohol y la preferencia sin necesidad de equipos de investigación especializados o análisis complejos. Con este enfoque, los investigadores pueden recopilar mediciones a intervalos deseados (por ejemplo, horas, días, semanas) calculando el cambio en el peso de la botella desde el principio hasta el final de una sesión de bebida. Las variaciones de este método básico han sido utilizadas por muchos en el campo para facilitar los niveles bajos a moderados o atracones de ingesta de alcohol durante períodos cortos y largos de tiempo. Por ejemplo, se han utilizado procedimientos continuos e intermitentes de elección de dos botellas para facilitar niveles bajos y moderados de ingesta de alcohol, respectivamente, tanto en ratones5 como en rats6,7,8. Los mismos paradigmas pueden promover altos niveles de ingesta en cepas que prefieren el alcohol7,9. Alternativamente, se ha demostrado que una adaptación de este método que limita el acceso al alcohol a 2-4 horas diarias a partir de aproximadamente 3 horas después del inicio del ciclo de oscuridad genera atracones de bebida en ratones (es decir, beber en la oscuridad)10,11. Se han utilizado variaciones adicionales de estos métodos junto con métodos que facilitan la dependencia del alcohol (es decir, la exposición crónica intermitente al vapor de etanol) para examinar la escalada del consumo voluntario de alcohol durante la abstinencia12,13,14,15,16,17,18,19.

Aunque ampliamente adoptado por el campo, el enfoque estándar de medir la ingesta de alcohol por cambio en el peso de la botella se limita en resolución al consumo total por sesión de bebida. En consecuencia, este enfoque es incapaz de capturar los patrones de consumo, que se sabe que afectan tanto el riesgo como la gravedad del trastorno por consumo de alcohol (AUD)20,21,22. De hecho, la ingesta media de un individuo a lo largo del tiempo puede ser consecuencia de varios episodios de consumo excesivo de alcohol o de muchos episodios de bebida, cada uno de ellos asociado a un consumo relativamente bajo, y estos matices pasan desapercibidos cuando el consumo se mide como la ingesta total por sesión de bebida. Es importante destacar que se observan significativamente más episodios de consumo de alcohol asociados con grandes episodios de bebida (es decir, tragar) en individuos con AUD en relación con controles sanos23 y los datos en primates no humanos sugieren que los individuos que establecen un patrón de consumo de alcohol que incluye grandes episodios de bebida al principio de su historial de consumo de alcohol tienen un riesgo significativo de AUD22. Además, los episodios de consumo de alcohol que incluyen grandes episodios de consumo aumentan significativamente el riesgo de morbilidad y mortalidad independientemente del diagnóstico de AUD21. En conjunto, estos datos han llevado a un mayor interés en examinar los patrones de bebida, además de los niveles de ingesta general en modelos preclínicos, y han impulsado el desarrollo de una serie de sistemas de diversa complejidad que son capaces de capturar datos de bebida a nivel de lamidas individuales.

Entre los primeros se encuentra el desarrollo de un sistema de dos botellas equipado con detección de lamido de fotohaz diseñado para su uso en ratones24. Este sistema fue adaptado posteriormente por un grupo separado para su uso en rats25. En los años transcurridos desde entonces, se han utilizado variaciones sobre este tema para desarrollar sistemas similares contenidos en alojamientos personalizados para roedores26, que permiten la detección de lamidas de animales individuales alojados socialmente27,28, y que capturan tanto el comportamiento de alimentación como de bebida29. Entre estos, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)30 ha atraído una atención significativa por ofrecer un sistema para su uso en ratones que es paralelo a la facilidad de implementación y asequibilidad del sistema desarrollado por Godnyuck et al.24. Este sistema utiliza la detección capacitiva para detectar directamente el contacto entre la lengüeta y el tubo de sorbo de metal conductor, a diferencia de las medidas indirectas como el enfoque o la interacción del sorbedor que se proporcionan mediante el sistema de detección de fotohaz. Los autores proporcionan datos que demuestran que su sistema de detección capacitiva ofrece una precisión y sensibilidad significativamente mayores en la detección de lamidos, produciendo correlaciones más fuertes entre el número de lamidos y el cambio en el peso de la botella que la detección de fotohaz. Los autores demuestran además la capacidad de utilizar este sistema junto con un paradigma de acceso continuo de dos botellas para capturar medidas de la microestructura del consumo de alcohol, además de medidas de la ingesta diaria general30.

Aquí, describimos los procedimientos para el consumo de alcohol en jaula en casa con dos botellas utilizando un enfoque estándar, así como métodos que permiten la detección de lamidos (Figura 1). También presentamos métodos para construir e implementar LIQ HDR, una adaptación de LIQ HD30 para su uso en ratas que incluye modificaciones de hardware para acomodar tamaños de jaula más grandes y un portabotellas rediseñado impreso en 3D compatible con botellas estándar listas para usar. Estos métodos proporcionan a los investigadores la flexibilidad necesaria para utilizar un enfoque estándar o equipado con un lickómetro, en función de sus recursos experimentales y de sus necesidades de recopilación de datos.

A continuación se muestra una descripción de los materiales necesarios e instrucciones paso a paso para capturar el consumo de alcohol en jaula en casa utilizando el procedimiento de bebida de elección de dos botellas de acceso intermitente adaptado de Simms et al.7. En este procedimiento, las ratas tienen acceso las 24 horas del día a dos botellas de bebida, 7 días a la semana. Los lunes, miércoles y viernes (MWF), las ratas reciben una botella que contiene agua (H2O) y otra botella que contiene etanol (EtOH). Estas botellas se retiran los martes, jueves y sábados (TRS) y se reemplazan con dos botellas de agua. Las ratas beben de las mismas dos botellas de agua los sábados y domingos. Tenga en cuenta que estos métodos se pueden ajustar fácilmente para horarios alternativos de acceso al etanol (por ejemplo, continuo, atracón, etc.) si lo desea. Se proporcionan instrucciones separadas para los enfoques estándar y equipados con lickómetros.

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Protocolo

Todos los datos representativos se recopilaron utilizando ratas adultas Long-Evans mantenidas individualmente, con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago y de acuerdo con las Guías del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Es necesario el alojamiento individual para monitorear con precisión el consumo de líquidos de cada sujeto. Se utilizaron ratas Long-Evans adultas macho (n = 38) y hembra (n = 22), que al llegar tenían entre P50 y P80 y se les permitió aclimatarse al vivario durante una semana antes de comenzar el experimento. Las ratas tuvieron acceso ad libitum a alimento estándar (Teklad 7912, Envigo) y agua, salvo que se indique lo contrario.

1. Preparación antes del experimento

  1. Etiquete las botellas de bebida como H2O o EtOH. Luego, coloque un identificador único para cada rata: una botella de H2O y una de EtOH para los días LMA y dos botellas de H2O para los días MJS.
    NOTA: Opcionalmente, utilice cinta de diferentes colores para identificar las botellas de H2O y EtOH, con el fin de evitar errores durante el cambio de botellas.
  2. Llene las botellas de H2O con agua potable un día antes de la fecha de inicio del experimento. Prepare la solución de EtOH mezclando EtOH de 190 grados con agua potable (20% v/v) un día antes de la fecha de inicio del experimento.
    ADVERTENCIA: Es fundamental utilizar EtOH no desnaturalizado, ya que el EtOH desnaturalizado es venenoso.
  3. Prepare una jaula vacía en el mismo estante que las jaulas de las ratas que participan en el experimento. Esta jaula se utilizará para calcular el derrame.
  4. Equipe las jaulas con el sistema LIQ HDR si se va a utilizar (véase el paso 3, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 y Figura Suplementaria 1).
  5. Determine el momento preciso del día para el cambio de botellas antes del inicio del estudio. Las botellas deben reemplazarse a la misma hora todos los días para obtener una medición precisa del consumo en 24 h.
    NOTA: Investigaciones previas han demostrado que los roedores presentan el mayor grado de consumo poco después del inicio del ciclo oscuro10,31. Por lo tanto, con el fin de registrar el consumo durante este período de alta actividad (véase el paso 2.3.1 para registrar el consumo tipo atracón), se recomienda realizar el cambio de botellas entre 30 y 60 minutos después de que se apaguen las luces. Utilice lámparas rojas durante el cambio de botellas para permitir la visualización sin interrumpir el ciclo luz-oscuridad.

2. Procedimientos diarios y mantenimiento

  1. El primer día del experimento, realice lo siguiente.
    1. Retire las botellas estándar de agua de las jaulas.
    2. Opcional: con frecuencia las ratas mueven la tapa de la jaula mientras buscan alimento, lo que podría causar derrames que no pueden corregirse con la jaula de derrame vacía. El uso de tazones para alimento dentro de la jaula puede aliviar esta preocupación. Si se utiliza, retire el alimento de la parte superior de la jaula, agregue un tazón para alimento dentro de la jaula y llénelo con alimento. Asegúrese de que el espacio en el piso asignado a la rata siga cumpliendo con las directrices institucionales según el tamaño de la jaula para ratas y el tamaño del tazón para alimento.
    3. Indique al personal de cuidado y manejo, según corresponda, que el personal de investigación proporcionará alimento y agua durante toda la duración del experimento.
    4. Los cambios de jaula pueden interrumpir la recolección de datos. Realice los cambios de jaula simultáneamente con la obtención de las mediciones de peso corporal. Los investigadores que elijan hacer esto deben informar a su personal de cuidado y manejo en consecuencia.
  2. En los días posteriores, siga los procedimientos descritos a continuación.
    NOTA: Recuerde que cualquier movimiento de jaulas y botellas puede provocar derrames. Por lo tanto, es importante ser cuidadoso con los movimientos y utilizar los mismos métodos para colocar y retirar las botellas en la jaula de derrame que los utilizados para las jaulas de ratas.
    1. Ingrese a la habitación antes de la hora de cambio de botellas, asegurándose de tener suficiente tiempo para realizar los pasos siguientes, y coloque botellas nuevas en las jaulas a la hora de inicio programada para la sesión.
    2. Retire las tapas con filtro de las jaulas. Si es LMA, continúe con el paso 2.2.3. Si es MTR, continúe con el paso 2.2.4.
    3. Los lunes, miércoles y viernes, retire las botellas MTR de la parte superior de las jaulas. Pese las botellas LMA (una de EtOH y una de H2O). Registre el peso inicial de la botella para la sesión de consumo de hoy. Proporcione alimento adicional en la parte superior de la jaula o en los tazones para alimento si es necesario. A la hora designada de inicio de la sesión, coloque las botellas en la parte superior de la jaula de cada rata con la cinta hacia arriba para que las ratas no muerdan la etiqueta de la botella.
      NOTA: Normalmente, el consumo de agua no se registra ni se informa para MTR, pero los investigadores pueden recopilar opcionalmente estos datos obteniendo los pesos de las botellas antes y después, como se describe a continuación en el paso 2.2.3 y el paso 2.2.4, si así lo desean. El lado para la botella de EtOH debe alternarse después de cada sesión de consumo para evitar el desarrollo de una preferencia lateral, lo que podría sesgar involuntariamente los datos de consumo.
      1. Opcional: trabajos previos han demostrado que muchas ratas presentan un consumo similar al atracón al inicio de la sesión de consumo8,32,33. La mayoría de los investigadores que registran el consumo compulsivo durante este periodo informan la ingesta durante los primeros 30-60 minutos de la sesión. Para obtener datos de ingesta durante este posible episodio de atracón, siga los pasos descritos a continuación.
      2. Configure un temporizador después de colocar las botellas en la última jaula. Deje la habitación sin interrupciones durante el periodo cronometrado.
      3. Vuelva a ingresar a la habitación cuando suene el temporizador. Retire las botellas de EtOH y H2O y registre sus pesos. Devuelva las botellas de EtOH y H2O a las jaulas.
        NOTA: Este paso no es necesario para registrar episodios de atracón cuando se utiliza un sistema equipado para la detección de lamidos.
    4. Los martes, jueves y sábados, retire las botellas LMA de las jaulas a la hora designada de finalización de la sesión, correspondiente a 24 h después de la hora de inicio. Pese cada botella y registre el peso final de la botella para la sesión de consumo LMA. Obtenga y registre el peso corporal de cada rata. Si es necesario, proporcione alimento adicional en la parte superior de la jaula o en los tazones para alimento. Coloque las botellas de H2O MTR en la parte superior de la jaula de cada rata con la cinta hacia arriba para que las ratas no muerdan la etiqueta de la botella.
    5. Devuelva las tapas con filtro a las jaulas y salga de la sala de animales.
      NOTA: Opcionalmente, cubra los bebederos de las botellas de EtOH para evitar la evaporación. Si los cambios de jaula los realiza el personal de investigación, designe 1 día a la semana durante las tareas MTR para realizar esta actividad. Coloque a cada rata en una jaula limpia después de obtener su peso corporal.
  3. Lave las botellas y renueve los líquidos de forma regular, semanal o quincenal, según los procedimientos institucionales de cuidado y manejo de animales. Tenga cuidado de realizar estas tareas de manera que no interrumpan las sesiones de consumo. Por ejemplo, las botellas de H2O MTR pueden lavarse y rellenarse después de retirarlas los días LMA. De manera similar, las botellas de H2O y EtOH LMA pueden lavarse y rellenarse después de retirarlas los días MTR.

3. Detección de lamidos durante experimentos de elección de dos botellas

NOTA: Los investigadores interesados en obtener datos de consumo de bebida de alta resolución pueden modificar el procedimiento anterior agregando capacidades de detección de lamidos a las botellas. LIQ HD30 es un sistema de bajo costo hecho por uno mismo (DIY) que permite este tipo de recolección de datos en ratones. Los procedimientos descritos a continuación detallan las modificaciones necesarias para adaptar LIQ HD para su uso en ratas (denominado LIQ HDR). Véase la Tabla de Materiales para obtener una lista de todas las piezas vendidas comercialmente y las piezas personalizadas impresas en 3D necesarias para construir un sistema de detección de lamidos, el cual puede capturar datos de elección entre dos botellas para hasta 18 ratas. Los archivos .stl para impresión 3D y las instrucciones están disponibles en el sitio web del autor (www.ejgloverlab.com/3dprints).

  1. Configuración de unidades de sensores capacitivos
    NOTA: Cada sistema LIQ HDR consta de tres unidades de sensores capacitivos, que en conjunto capturan datos de lamidos de 36 botellas en paralelo, correspondientes a 18 ratas alojadas individualmente. Cada unidad de sensor consiste en un diferencial I2placa de expansión C y una placa sensora capacitiva de 12 teclas, que se conectará a los lickómetros de seis jaulas separadas mediante seis pares de cables de 2 pines codificados por colores para cada lickómetro (Figura 2A).
    1. Reúna los materiales necesarios para construir las tres unidades del sensor capacitivo, como se muestra en Figura 2B, junto con las herramientas de soldadura necesarias.
    2. Para comenzar a armar la unidad sensora A, cubra un cable con conector hembra de 2 pines con un tubo termoretráctil rojo de 7 pulgadas de largo, e inserte los extremos de los cables rojo y negro en los pines #0 y #1 de la placa sensora (Figura 2C-1) y soldar en su lugar (Figura 2C-2). Asegúrese de que el cable esté en la parte frontal de la placa del sensor, tal como se muestra, para poder disponer las jaulas en orden numérico de izquierda a derecha en el vivario sin que los cables se superpongan y puedan interrumpir la grabación (véase el paso 3.6 y Figura 6).
    3. Cubra cinco cables más con tubos termorretráctiles de colores claramente distintos y suéldelos a los pines del 2 al 11 como se muestra (Figura 2C-3). Asegúrese de que todos los cables rojos estén soldados a los pines pares, que se conectarán a todas las botellas del lado izquierdo, y de que todos los cables negros estén soldados a los pines impares, que se conectarán a todas las botellas del lado derecho.
    4. Cubra las uniones de soldadura con pegamento caliente por todos los lados para protegerlas (Figura 2C-4). Etiquete los conectores en orden numérico, asignando un ID único a cada lickómetro (Figura 2C-4).
    5. Para ensamblar la unidad sensora A, conecte la placa sensora A a un punto final de comunicación (EndPoint) mediante un cable de 4 pines de 50 mm, y conecte el punto final al puerto de salida de 3,3 V del conversor nivelador de 5 V a 3 V mediante un cable de 4 pines de 100 mm (Figura 2D-1). Aunque tanto la placa del sensor como la placa de comunicación tienen dos conectores idénticos de 4 pines, es importante asegurarse de que el cableado sea exactamente como se muestra (Figura 2D-1 y Figura 2F) para utilizar las carcasas impresas en 3D para sensores y la configuración sugerida del vivario (ver paso 3.6 y Figura 6). Coloque la unidad sensora A dentro de la carcasa impresa en 3D (Figura 2D-2). Cierre suavemente la tapa, teniendo cuidado de no aplastar el cable del convertidor de nivel (Figura 2D-3).
    6. Modificar el I2C direcciones de las placas sensoras B y C soldando un cable puente desde el pin ADDR hasta el pin 3Vo o SDA según se indica (Figura 2E).
    7. Soldar seis cables conectores hembra codificados por colores a las placas sensoras B y C utilizando el mismo orden que se usó para la placa A. Etiquetar cada conector con el número de identificación correspondiente del lickómetro. Conectar la placa B al punto medio de comunicación (MidPoint) y la placa C a un punto final (EndPoint) con cables de 4 pines de 50 mm (Figura 2F).
    8. Coloque las unidades sensoras B y C en sus respectivas cajas impresas en 3D. Conecte en cadena las tres unidades sensoras mediante cables Ethernet para completar la configuración del sensor (Figura 2G).
  2. Configuración de la interfaz del microcontrolador
    NOTA: La interfaz del microcontrolador LIQ HDR (Figura suplementaria 1A) es el mismo que el descrito para LIQ HD30 con modificaciones muy menores. Los procedimientos descritos a continuación ofrecen una visión general de los pasos necesarios para configurar la interfaz, con las modificaciones descritas en los pasos 3.2.6 y 3.2.8. Se remite a los investigadores al protocolo original y al tutorial en video proporcionado en la página de GitHub del autor para obtener instrucciones detalladas paso a paso más completas30.
    1. Reúna los materiales y las herramientas de soldadura necesarios para construir la interfaz del microcontrolador (Figura suplementaria 1B). En el lado posterior del escudo táctil (Figura suplementaria 1C-1), cree un puente de soldadura a través de las pistas de soldadura traseras (Figura suplementaria 1C-2).
    2. En el lado posterior del escudo de registro de datos, corte la pista del puente del pin CS (Figura suplementaria 1D-1). En el lado frontal del registrador de datos, suelde un cable puente corto desde el pin CS hasta el pin #7 (Figura suplementaria 1D-2).
    3. Para instalar los encabezados apilables del blindaje, primero apílelos en la parte trasera del blindaje de la pantalla táctil (Figura suplementaria 1E-1). Apile el registrador de datos sobre la pantalla táctil, use cinta para estabilizarlo y suelde todos los pines de conexión al registrador de datos (Figura suplementaria 1E-2). Luego retire la pantalla táctil.
    4. Apile el encabezado 2 x 3 restante al microcontrolador (Figura suplementaria 1F-1), luego apile el registrador de datos sobre el microcontrolador antes de soldar los pines de encabezado en su lugar (Figura suplementaria 1F-2).
    5. Inserte la batería de tipo moneda en el registrador de datos (Figura suplementaria 1G-1). Coloque la pantalla táctil sobre el registrador de datos (Figura suplementaria 1G-1). Inserte la tarjeta microSD junto con su adaptador en el registrador de datos (Figura suplementaria 1G-2).
    6. Para hacer el cable de conexión a tierra adicional, corte un conector macho de un cable puente y retire el aislamiento del extremo hasta dejar aproximadamente 1/4 de pulgadaFigura suplementaria 1H-1). Suelda un tramo de cable sólido pelado a un cable puente y cubre la unión soldada con un tubo termorretráctil (Figura suplementaria 1H-2).
    7. Conecte los cables jumper de 4 pines y el cable de conexión a tierra adicional al microcontrolador (Negro - GND, Rojo - 5V, Amarillo - pin #21, Azul - pin #20, Figura suplementaria 1I-1). Sujete las conexiones con pegamento caliente (Figura suplementaria 1I-2). Opcionalmente, envuelva los cables puente con tubo termorretráctil (Figura suplementaria 1I-2).
    8. Coloque la interfaz del microcontrolador completamente ensamblada en la carcasa impresa en 3D, pasando los cables jumper de 4 pines y el cable de tierra a través de la abertura en la parte superior (Figura suplementaria 1J).
    9. Siga el protocolo original para la instalación del software de interfaz del microcontrolador30.
  3. Construcción de lickómetros LIQ HDR
    NOTA: La impresión 3D personalizada que sostiene las botellas está diseñada para usarse con una botella estándar para roedores con un tubo dispensador de diámetro de 8 mm (ver Tabla de materiales Figura 3A). Este portabotellas puede adaptarse fácilmente para su uso con botellas y tubos bebedores similares, con modificaciones menores o sin necesidad de modificaciones.
    1. Reúna los materiales, las piezas impresas en 3D y las herramientas de soldadura necesarios para construir un lickómetro, como se muestra en Figura 3B. Tenga en cuenta que cada sistema LIQ HDR acomoda un máximo de 18 lickómetros para 36 botellas.
    2. Para prolongar el cable del conector macho, retire el aislamiento de ambos extremos hasta dejar aproximadamente 1/4 de pulgada de longitud expuesta, así como de los cables de extensión rojo y negroFigura 3C-1).
    3. Soldar los cables de extensión al cable conector (Figura 3C-2) y cubra las uniones de soldadura con tubo termorretráctil (Figura 3C-3). Cubra el cable del conector macho con un tubo termorretráctil que haga juego en color con el cable del conector hembra correspondiente en la unidad del sensor (Figura 3C-4).
    4. Para ser coherente con el cableado del tablero del sensor (Figura 2), pase el cable rojo y el cable negro a través del pasaje izquierdo y derecho del portafrascos, respectivamenteFigura 3D-1).
    5. Soldar cada cable al extremo mismo del 1 ¾ cinta de cobre conductora de una pulgada (Figura 3D-2) y doble las cintas de cobre por la mitad (Figura 3D-3).
    6. Despegue la cinta de cobre y use un par de pinzas para colocarla cuidadosamente dentro del soporte del bebedero (Figura 3E-1) antes de adherirlo firmemente a las paredes internas del soporte del bebedero (Figura 3E-2). Asegúrese de que el lado con soldadura de la cinta de cobre quede adherido a la pared más cercana a la línea media del soporte del frasco, como se indica (Figura 3E-2). Introduzca un tubo bebedero a través del soporte para presionar firmemente la cinta contra la pared y cebado el soporte.
    7. Para reforzar el lado de soldadura de la cinta de cobre, que no es tan adhesivo y tiende a desprenderse, aplique un poco de pegamento caliente sobre la unión soldadaFigura 3E-3). Extender el pegamento para cubrir tanto la cinta de cobre como cualquier parte adyacente expuesta de la impresión 3D (Figura 3E-4).
    8. Pase el cable a través del conducto interno del protector de cableFigura 3F). Asegúrese de seleccionar el protector de cable adecuado (orientado hacia la izquierda o hacia la derecha) para cada lickómetro, a fin de utilizar la configuración sugerida del vivario (véase el paso 3.6 y Figura 6)."NOTA: Los lickómetros 5-6, 11-12 y 17-18, que se muestran con cables de color azul o morado en la configuración actual, requieren un protector de cable orientado hacia la izquierdaFigura 4D-1), mientras que todos los demás lickómetros requieren un protector de cable orientado hacia la derecha (Figura 4D-2).
    9. Para instalar la abrazadera del cable, primero coloque un cable en la ranura de una de las mitades de la abrazadera (Figura 3G-1), luego coloque la otra mitad sobre el segundo cable y, a continuación, cierre firmemente ambas mitades con la tuerca (Figura 3G-2).
    10. Etiquetar el conector macho con el número de identificación correspondiente del lickómetro (Figura 3H). Repita estos pasos hasta que se hayan construido todos los 18 lickómetros.
  4. Instalación de lickómetros LIQ HDR
    NOTA: LIQ HDR está diseñado para su instalación en una jaula estándar para ratas tipo caja de zapatos con tapa de alambre metálico (Figura 4A-1).
    1. Identifique dos pares de varillas con una distancia centro a centro de aproximadamente 75 mm en la parte superior de la jaula de alambre para acomodar el portabotellas. Utilice un par de alicates para abrir ligeramente las varillas metálicas alrededor de las aberturas del bebedero. Aísle estas varillas con cinta aislante para evitar el contacto metal con metal entre los bebederos y la parte superior de la jaulaFigura 4A-2).
      NOTA: Aunque la cinta aislante no es accesible para las ratas y, por lo tanto, no está expuesta a mordeduras, se recomienda desecharla al final del estudio y no reutilizarla entre estudios.
    2. Instale el lickómetro y el panel de acrílico láser de 1/8 de pulgada de espesor en la parte superior de la jaula con dos juegos de tornillos y tuercas M5 (Figura 4B). Asegúrese de que las aberturas de los bebederos en el lickómetro y en el panel de acrílico coincidan, y de que los bebederos no estén en contacto con ninguna parte de la tapa de la jaula.
    3. Fije el sujetador de cable al poste más externo (~4 mm de diámetro) de la parte superior de la jaula de alambreFigura 4C). Ajuste el clip del cable si es necesario para asegurarse de que la tapa de la jaula quede bien ajustada sobre la base de la jaula y de que el cable no esté sometido a tracción excesiva ni doblado con tensión excesiva. Asegúrese de que se esté utilizando el protector de cable adecuado para cada lickómetro (Figura 4D y vea el paso 3.8.8).
    4. Ajuste los tubos de sorber según sea necesario para que solo unos ~2 cm del sorber sobresalgan de la tapa (Figura 4E-1). Para instalar las botellas, inserte el tubo dispensador a través del soporte del tubo en el portabotellas hasta que se detenga (Figura 4E-2). Solo la punta más extremas del tubo del bebedero debe sobresalir más allá del panel de acrílico (Figura 4E-3). Es fundamental que ninguna otra parte del tubo dispensador esté expuesta para evitar lamidas falsas positivas derivadas de comportamientos no consumatorios, como cuando la rata toca o juega con el tubo dispensador. La tapa del filtro debe poder colocarse firmemente sobre la tapa de alambre de la jaula y el sujetador de cable sin alterar el cable mismo (Figura 4F).
      NOTA: Se puede utilizar un panel de acrílico más grueso o una pila de varios paneles de 1/8 de pulgada para encapsular completamente tubos bebederos de mayor longitud en experimentos que requieran que los tubos se extiendan más hacia el interior de la jaula, como cuando se mide la ingesta de líquidos en ratas jóvenes que podrían tener dificultades para alcanzar un tubo bebedero corto.
  5. Instalación y uso de bloqueadores sipper
    ​NOTA: El bloqueador del sorbete (Figura 5Aestá diseñado para restringir el acceso de la rata al bebedero durante el cambio de botellas y para garantizar una calibración precisa del lickómetro al inicio de cada sesión de consumo.
    1. Reúna las piezas impresas en 3D y un tornillo, tuerca y arandela M5 para un bloqueador de bebedero, como se muestra en Figura 5B.
    2. Inserte el SIPPER_Gear en el SIPPER_Base (Figura 5C-1). Asegúrese de que el SIPPER_Gear esté orientado exactamente como se muestra en la inserción del renderizado 3D. Introduzca el SIPPER_Worm en la abertura en la parte superior del SIPPER_Base. Gire el tornillo sinfín en sentido horario mientras lo inserta, hasta que la cabeza quede al ras con la base (Figura 5C-2).
    3. Atornille la tuerca SIPPER al extremo del tornillo sinfín desde la parte inferior de la base (Figura 5C-3). Utilice pinzas para apretar la tuerca mientras gira el dial de tornillo sinfín. Introduzca los cuellos redondos y estrechos de los SIPPER_Blockers en las ranuras del engranaje (Figura 5C-4).
    4. Instale el bloqueador de sorber montado en la parte superior de la jaula utilizando el juego de tornillos M5 (Figura 5D). Asegúrese de que ambos bloqueadores de sorbete estén alineados con las aberturas del sorbete.
    5. Para bloquear el acceso a los bebederos, gire el dial del tornillo sinfín en sentido horario para bajar los bloqueadores hasta que cubran completamente las aberturas de los bebederos (Figura 5E).
    6. Para permitir el acceso a los bebederos, gire el dial en sentido antihorario hasta que los bloqueadores estén en posición vertical y perpendicular a la parte superior de la jaula (Figura 5F-1). Tire manualmente hacia arriba de cada brazo del bloqueador hasta que las cabezas queden justo debajo de la parte superior de la jaula de alambre. Gire los bloqueadores 90° de modo que las cabezas queden paralelas a las varillas metálicas en la parte superior de la jaula y los brazos queden fijos en su lugar (Figura 5F-2). Siga girando el dial en sentido antihorario hasta que ambos bloqueadores estén elevados por encima de la parte superior de la jaula (Figura 5F-3) y los bebedores son completamente accesibles (Figura 5F-4).
  6. Uso del sistema LIQ HDR en el vivario
    NOTA: La siguiente configuración de vivario está optimizada para registrar el consumo en la prueba de elección de dos botellas mediante una única interfaz de microcontrolador conectada a 18 jaulas estándar para ratas tipo caja de zapatos. Todos los componentes electrónicos, incluyendo la interfaz de microcontrolador, las unidades sensoras y diversos cables, se fijan a estantes metálicos de alambre montados en la pared que sostienen las jaulasFigura 6A). Es posible que se requieran algunas modificaciones para adaptarse a las instalaciones para animales y a las necesidades del usuario.
    1. Monte cada unidad sensora en los estantes del vivario utilizando el tornillo de montaje personalizado impreso en 3D (Figura 6B). Asegúrese de que cada unidad sensora esté montada directamente debajo de la jaula con el lickómetro de color amarillo para evitar tensiones innecesarias en el cableado (Figura 6A).
    2. Organice y asegure cada cable con conector hembra, asegurándose de que no se superpongan entre sí ni se doblen excesivamente en sus extremos soldados, lo que podría provocar una detección deficiente de lamidosFigura 6B). Si se utiliza estantería con varillas metálicas, esto puede lograrse fácilmente sujetando los cables del conector a varillas separadas en el estante, como se muestra.
    3. Monte la interfaz del microcontrolador junto a la unidad del sensor A utilizando el mismo tornillo de montaje impreso en 3D y conecte su conector de 4 pines al puerto de entrada de 5 V del convertidor de niveles de 5 V a 3 V conectado a la unidad del sensor A (Figura 6C).
    4. Utilice cinta aislante para asegurar el cable de tierra adicional a una fuente de conexión a tierra, como la estantería metálica (Figura 6D).
    5. Organice cada jaula según el color y el ID del lickómetro instalado según Figura 6A representación para minimizar el solapamiento y la tensión de los cables.
    6. Conecte de forma segura todos los cables conectores macho del lickómetro a los cables conectores sensoras hembra correspondientes (Figura 6E). Conecte la fuente de alimentación para encender la interfaz del microcontrolador (Figura 6F).
    7. En la página principal de la GUI (interfaz gráfica de usuario)Figura 6G), pulse el Configuración de símbolo para abrir la página de Configuración. Los usuarios pueden cambiar los horarios de encendido y apagado de las luces según el programa del vivario para asegurar que la pantalla de la interfaz se atenúe automáticamente cuando comience el ciclo oscuro (Figura 6H-1).
    8. Golpear suavemente Editar configuración del sensor (Figura 6H-1) para ajustar el umbral de contacto a 8 y el umbral de liberación a 2, lo cual hemos encontrado que permite la detección de lamidos más consistente en ratas utilizando la configuración actual (Figura 6H-2). Téngase en cuenta, sin embargo, que es posible que los usuarios deban experimentar con diferentes configuraciones si se introducen modificaciones al sistema actual.
    9. Desmarcar Auto Calibración si los datos se recopilan únicamente durante un período de 24 horas o menosFigura 6H-2).

4. Procedimientos diarios para la elección de dos botellas en jaula domiciliaria utilizando detección de lamidos

  1. Siga los pasos descritos en el paso 2 para procedimientos estándar de elección entre dos botellas con las siguientes modificaciones.
  2. Los lunes, miércoles y viernes, antes de colocar las botellas MWF, utilice los bloqueadores de bebederos para cubrir las aberturas de los bebederos en todas las jaulas (véase el paso 3.5.5 y Figura 5E).
  3. Antes de grabar, seleccione el correcto Lado experimental en la página principal de la interfaz gráfica de usuario, que será el lado de la botella de EtOH para ese día (Figura 6G).
  4. Después de instalar todas las botellas de MWF, toque ¡EMPEZAR! en la página principal (Figura 6G) para comenzar la calibración de los sensores, momento en el que se recomienda que el usuario dé un paso atrás desde el sistema y se asegure de que las ratas no estén lamiendo los bebederos (Figura 6I-1). La calibración tarda unos segundos en completarse, tras lo cual el sistema entra en la página principal de registro, que muestra el número acumulado de lamidos en cada botella para cada lickómetroFigura 6I-2).
  5. Eleve todos los bloqueadores de sorberos por encima de la parte superior de la jaula para permitir el acceso a los sorberos (véase el paso 3.5.6 y Figura 5F) y devuelva suavemente todas las tapas de filtro como se describe (véase el paso 3.4.4 y Figura 4F).
  6. Golpear suavemente Actualizar para actualizar el número de lamidos en la pantalla, ya que este no se actualiza en tiempo real por sí solo (Figura 6I-2).
  7. Los martes, jueves y sábados, toque Guardar & Salir para detener la grabación y volver a la página principal (Figura 6I-2) antes de retirar los frascos de MWF.
  8. Para retirar la tarjeta SD para la transferencia de datos, toque Expulsar SD antes de desconectar la tarjeta SD (Figura 6G). Inserte la tarjeta SD en cualquier computadora y copie/pegue el archivo de datos .csv, nombrado según la fecha de inicio del frasco, en esa computadora (Figura 6K). Para volver a colocar la tarjeta SD para la siguiente grabación, inserte la tarjeta en la interfaz y toque Montar SD (Figura 6J).
    NOTA: Recomendamos hacer copias de seguridad de los archivos de datos diariamente.
  9. Es recomendable limitar las mediciones del peso corporal a una vez por semana, siempre que sea compatible con el modelo animal y el protocolo de uso de animales, y realizar esta tarea el día designado para el cambio de jaula con el fin de minimizar las perturbaciones innecesarias a los lickómetros y sensores. Desconecte todos los cables macho de los lickómetros de los cables hembra correspondientes de los sensores antes de mover las jaulas. Después de pesar cada rata, devuélvala a una jaula limpia. Transfiera el lickómetro a una nueva tapa de jaula y vuelva a conectar cada lickómetro al sensor correspondiente cuando sea necesario.
  10. Para experimentos que evalúan el efecto de una intervención (por ejemplo, inyección de un fármaco) sobre la ingesta de EtOH y la microestructura del consumo de bebidas, programe dichas intervenciones antes del inicio de la sesión de consumo siempre que sea posible. En ocasiones en que esto no sea posible, los investigadores pueden interrumpir la detección de lamidos golpeando ligeramente Pausa (Figura 6I-2) y reanudar la captura de datos tocando Resumen después de que finalice la intervención. Sugerimos recoger los pesos de las botellas durante cada pausa en la sesión de consumo para registrar los cambios en la ingesta de EtOH antes y después de la intervención, así como para tener en cuenta cualquier derrame que pueda ocurrir al retirar la tapa de la jaula para acceder al animal.
  11. Al final del estudio, todos los componentes dentro de la jaula deben desinfectarse minuciosamente antes de ser utilizados con animales nuevos, con el fin de limitar la transmisión de contaminantes entre los animales. Se recomienda rociar suavemente el lickómetro con una solución de EtOH al 70 % y luego limpiarlo con una toalla, teniendo cuidado de no alterar los componentes eléctricos internos. El bloqueador de bebedero y el panel de acrílico pueden lavarse con agua tibia y jabón.

5. Análisis de datos

  1. Antes de evaluar las medidas dependientes, corrija los datos de ingesta para tener en cuenta el derrame que inevitablemente ocurre al cambiar las botellas cada día. Para ello, calcule el promedio del cambio en el peso de la botella de EtOH y de las botellas de H2O en la jaula de derrame durante todo el período del estudio.
  2. Excluya cualquier valor mayor de dos desviaciones estándar respecto a la media para cada botella. Después de excluir estos valores atípicos, reste las medias calculadas a los cambios en el peso de las botellas de EtOH y H2O obtenidos de las jaulas que contienen animales. Al restar esta cantidad, los investigadores pueden estar seguros de que la pérdida promedio debida al derrame de una solución determinada no se considera en las medidas de consumo. La resta de la cantidad promedio de derrame puede dar como resultado un valor negativo para algunos animales en ciertas ocasiones. Convierta estos valores a cero e interprételos como la ausencia de ingesta para esa solución.
  3. Las medidas dependientes principales en los experimentos de elección con dos botellas son la ingesta de EtOH (g/kg) y la preferencia (%). Calcule la ingesta a partir del cambio en el peso de la botella de EtOH (g) y normalícela respecto al peso corporal (kg) siguiendo los pasos siguientes.
    1. Convierta el cambio en el peso de la botella (g) al cambio en volumen (mL) utilizando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-1
      La densidad del etanol puro es 0,789 g/mL. Por lo tanto, la densidad aportada por el EtOH al 20% es 0,1578 g/mL. El H2O pesa 1 g/mL. Por consiguiente, la densidad aportada por el 80% de H2O = 0,80 g/mL. En consecuencia, cada mL de una solución de EtOH al 20% (v/v) está compuesto por 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H2O) = 0,9578 g/mL. Por lo tanto, la ecuación final al utilizar una concentración de EtOH al 20% (v/v) es:
      figure-protocol-2
    2. Calcule la dosis de etanol consumida utilizando la ecuación siguiente. Utilice los pesos corporales obtenidos durante la misma semana que los datos de ingesta para calcular el etanol consumido en relación con el peso corporal del animal.
      figure-protocol-3
    3. Calcule la preferencia utilizando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-4
  4. Al igual que su contraparte en ratones30, LIQ HDR registra una variedad de variables de microestructura de la ingesta, incluyendo la duración de lamidos, número de episodios, duración de episodios, número de lamidos por episodio y duración de lamidos por episodio (Figura 6K). Un episodio de ingesta se define como una serie de lamidos que comienza con al menos 3 lamidos realizados en menos de 1 segundo y termina tras transcurrir 3 segundos sin lamidos adicionales. Estas medidas pueden utilizarse luego para calcular la duración promedio individual de cada lamido, la duración promedio individual de cada episodio, el número promedio de lamidos por episodio, la frecuencia promedio de lamidos, el intervalo estimado entre lamidos y el intervalo estimado entre episodios.
    NOTA: La interfaz del microcontrolador proporciona estos datos de microestructura con una resolución de 1 minuto en un archivo .csv (Figura 6K). Los investigadores pueden utilizar la aplicación de análisis proporcionada con el protocolo original de LIQ HD30 o su plataforma de postprocesamiento preferida para agrupar y resumir los datos según las necesidades de la investigación. Los datos de microestructura normalmente se suman durante todo el período de 24 h para comparar diferencias promedio a nivel macroscópico, o en intervalos de 30 min a 1 h para examinar las variaciones en los patrones de ingesta a lo largo de un ciclo luz-oscuridad.

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Resultados

Datos estándar de consumo de EtOH en jaula domiciliaria con elección intermitente de dos botellas
Mediante el procedimiento estándar (Figura 7A), los investigadores pueden registrar la ingesta durante 24 h (Figuras 7B-D) así como el consumo similar a atracón si se registran los pesos de las botellas poco después del inicio de la sesión de consumo (Figuras 7E-F). Al calcular la...

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Discusión

El protocolo actual proporciona instrucciones paso a paso para capturar datos de consumo de etanol utilizando un procedimiento de jaula casera de dos botellas de acceso intermitente. Este método se puede implementar con relativa facilidad y con poco o ningún costo o necesidad de equipo de investigación especializado. Utilizando los procedimientos proporcionados aquí para construir e implementar LIQ HDR, un sistema de detección de lamidas para su uso en ratas, los investigadores pueden capturar datos de microestructura de...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Joseph Pitock y Katie Przybysz, PhD por su asistencia técnica durante el desarrollo de LIQ HDR. También agradecemos a Nicholas Petersen y Marie Doyle, PhD, por muchas conversaciones útiles durante el desarrollo de LIQ HDR. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional sobre el Abuso del Alcohol y el Alcoholismo de los Institutos Nacionales de Salud (P50 AA022538 y R01 AA029130 a EJG).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Componentes disponibles en el mercadoCantidad
12 teclas Conexión del sensor táctil capacitivo (MPR121)Adafruit19823
de cable de 2 pines (JST XH 2.5mm paso)Adafruit487218
Puente de placa de pruebas de 4 pines (Qwiic)SparkFunPRT-179121
Cable de 4 pines (Qwiic de 100 mm)SparkFunPRT-172591
cable de 4 pines (Qwiic de 50 mm)SparkFunPRT-172603
Salida de cambio de nivel de 5 V a 3 VAdafruit56371
Pantalla táctil capacitiva (2,8 pulgadas)Adafruit19471
Cinta conductora de cobre (1/4 de pulgada)DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
Datos escudo de registroAdafruit11411
Kit de conexión de comunicación diferencial I2C (QwiicBus)SparkFunKIT-172501
Cinta aislanteDigiKey3M156004-ND1
Tubo termorretráctil (3/16 pulgadas varios colores)Bridas y másHS357-S106
Kit de tubos termorretráctiles (4 pulgadas negro)Jameco20959631
Batería de botón de litio (3V 12.5mm)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
arandela plana M5Grainger54FN661
tuerca hexagonal M5Grainger6CA721
de máquina M5 (12mm)Grainger6GU881
de máquina M5 (25mm)Grainger  6GU912
Cable de puente macho/machoAdafruit19571
Placa de microcontrolador (Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
filamento PETG (plata de 2.85mm)MatterHackersM-DDH-UZR22
filamento PLA (2.85mm negro)Filamento MatterHackersM-SEW-RUAW2
PLA (plata de 2.85mm)MatterHackersM-66P-6CLE1
Fuente de alimentación (DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
tarjeta de memoria SD/microSD (8GB)Adafruit12941
Cabezales de apilamientoShield Adafruit851
Cable de núcleo sólido (22AWG rojo)Adafruit2881
Cable de núcleo trenzado (22AWG negro)Adafruit29761
Alambre de núcleo trenzado (22AWG rojo)Adafruit30681
Tubo sorbedor de tapa giratoria con bolaDiseño alternativoTCCN8.5-ST2.5SB38
Botella de agua (8oz)Diseño alternativoWB8FS38
Componentes impresos en 3D personalizadosCantidad
Fondo de caja Arduino impreso en 3DN/AARDUINO_Bottom.stl1
tapa de caja Arduino impresa en 3DN/AARDUINO_Top.stl1
pinza de cable impresa en 3D LN/ACLIP_L.stl18
tuerca de clip de cable impresa en 3DN/ACLIP_Nut.stl18
pinza de cable impresa en 3DN/A CLIP_R.stl18
portabotellas de lickómetro impreso en 3DN/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
Protector de cable de lickómetro impreso en 3D LN/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
Protector de cable de lickómetro impreso en 3D RN/A LICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
letras de lickómetro impresas en 3DN/ALICKOMETER_Letters.stl19
tornillo de montaje impreso en 3DN/ATornillo de montaje.stl4
Caja de sensor impresa en 3D A inferiorN/ASENSOR_A_Bottom.stl1
Caja de sensor impresa en 3D A topN/ASENSOR_A_Top.stl1
caja de sensor impresa en 3D B inferiorN/ASENSOR_B_Bottom.stl1
caja de sensor impresa en 3D B topN/ASENSOR_B_Top.stl1
caja de sensor impresa en 3D C inferiorN/ASENSOR_C_Bottom.stl1
Caja de sensor impresa en 3D C topN/ASENSOR_B_Top.stl1
Letras de la caja del sensor impresa en 3D/ASENSOR_Letters.stl1
Bloqueador de sorbos impreso en 3DN/ASIPPER_Blocker.stl36
Base de bloqueador de sorbos impresa en 3DN/ASIPPER_Base.stl18
Engranaje de bloqueo de sorbos impreso en 3DN/ASIPPER_Gear.stl18
Tuerca bloqueadora de sorbos impresa en 3DN/ASIPPER_Nut.stl18
Gusano bloqueador de sorbos impreso en 3DN/ASIPPER_Worm.stl18
Panel acrílico de lickómetro cortado con láserN/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19
pares tornillo tornillo R N

Referencias

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