Modelado del consumo de alcohol en roedores mediante el consumo de alcohol en jaulas caseras de dos botellas y análisis microestructural

Resumen

Este protocolo describe un paradigma estándar de consumo de alcohol en jaula en casa de acceso intermitente y dos botellas para modelar el consumo de alcohol en ratas. Además, proporciona instrucciones paso a paso para aumentar el protocolo estándar con un sistema de detección de lamidos de bricolaje que permite el análisis microestructural del comportamiento de la bebida.

Resumen

La elección de dos botellas para beber en jaulas en casa es uno de los paradigmas más utilizados para estudiar el consumo de etanol en roedores. En su forma más simple, los animales tienen acceso a dos botellas de bebida, una de las cuales contiene agua del grifo regular y la otra etanol, con una ingesta diaria medida por el cambio en el peso de la botella durante el período de 24 horas. En consecuencia, este enfoque no requiere equipo de laboratorio especializado. Si bien esta facilidad de implementación es probablemente el mayor contribuyente a su adopción generalizada por parte de los investigadores preclínicos del alcohol, la resolución de los datos de consumo de alcohol adquiridos con este enfoque está limitada por el número de veces que el investigador mide el peso de la botella (por ejemplo, una vez al día). Sin embargo, el deseo de examinar los patrones de consumo de alcohol en el contexto de la ingesta general, las intervenciones farmacológicas y las manipulaciones neuronales ha impulsado el desarrollo de sistemas de detección de lamidos en jaulas caseras que pueden adquirir datos a nivel de lamidos individuales. Aunque varios de estos sistemas se han desarrollado recientemente, el sistema de código abierto, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), ha atraído una atención significativa en el campo por su asequibilidad y facilidad de uso. Aunque emocionante, este sistema fue diseñado para su uso en ratones. Aquí, revisamos los procedimientos apropiados para el consumo de agua en jaula en casa estándar y equipado con un lickómetro de dos botellas. También introducimos métodos para adaptar el sistema LIQ HD a las ratas, incluidas modificaciones de hardware para acomodar un tamaño de jaula más grande y un soporte de botella impreso en 3D rediseñado compatible con botellas de bebida estándar listas para usar. Con este enfoque, los investigadores pueden examinar los patrones diarios de bebida, además de los niveles de ingesta en muchas ratas en paralelo, aumentando así la resolución de los datos adquiridos con una inversión mínima en recursos adicionales. Estos métodos proporcionan a los investigadores la flexibilidad de utilizar botellas estándar o un aparato equipado con un lickómetro para interrogar los mecanismos neurobiológicos que subyacen al consumo de alcohol, en función de sus necesidades experimentales precisas.

Introducción

Aunque el consumo moderado de alcohol se ha asociado históricamente con beneficios moderados para la salud, recientes estudios exhaustivos a gran escala han revelado que ninguna cantidad de consumo de alcohol es segura^1,2. De hecho, el consumo de alcohol es el^7º factor de riesgo principal de muerte y discapacidad a nivel mundial¹ y las personas que beben incluso pequeñas cantidades de alcohol tienen un mayor riesgo de cáncer, enfermedades infecciosas y lesiones^1,3. En los Estados Unidos, las muertes por consumo de alcohol aumentaron casi un 30% entre 2016 y 2021⁴. Es importante destacar que el riesgo de muerte y discapacidad aumenta monótonamente con el aumento del consumo¹.

Aunque los estudios en humanos han proporcionado información valiosa sobre la neurobiología del uso y abuso del alcohol, el control experimental proporcionado por los modelos animales es crucial para una comprensión profunda de los mecanismos que subyacen al comportamiento de consumo y el riesgo de consumo excesivo de alcohol. Estos modelos también son herramientas valiosas para el desarrollo de tratamientos destinados a reducir el consumo descontrolado. El consumo de alcohol en jaulas en casa con dos biberones es uno de los paradigmas preclínicos más utilizados para estudiar el consumo de alcohol en roedores. Esto se debe, en gran parte, a su facilidad de implementación, ya que permite medir el consumo voluntario total de alcohol y la preferencia sin necesidad de equipos de investigación especializados o análisis complejos. Con este enfoque, los investigadores pueden recopilar mediciones a intervalos deseados (por ejemplo, horas, días, semanas) calculando el cambio en el peso de la botella desde el principio hasta el final de una sesión de bebida. Las variaciones de este método básico han sido utilizadas por muchos en el campo para facilitar los niveles bajos a moderados o atracones de ingesta de alcohol durante períodos cortos y largos de tiempo. Por ejemplo, se han utilizado procedimientos continuos e intermitentes de elección de dos botellas para facilitar niveles bajos y moderados de ingesta de alcohol, respectivamente, tanto en ratones^{5 como en} rats^6,7,8. Los mismos paradigmas pueden promover altos niveles de ingesta en cepas que prefieren el alcohol^7,9. Alternativamente, se ha demostrado que una adaptación de este método que limita el acceso al alcohol a 2-4 horas diarias a partir de aproximadamente 3 horas después del inicio del ciclo de oscuridad genera atracones de bebida en ratones (es decir, beber en la oscuridad)^10,11. Se han utilizado variaciones adicionales de estos métodos junto con métodos que facilitan la dependencia del alcohol (es decir, la exposición crónica intermitente al vapor de etanol) para examinar la escalada del consumo voluntario de alcohol durante la abstinencia^{12,13,14,15,16,17,18,19}.

Aunque ampliamente adoptado por el campo, el enfoque estándar de medir la ingesta de alcohol por cambio en el peso de la botella se limita en resolución al consumo total por sesión de bebida. En consecuencia, este enfoque es incapaz de capturar los patrones de consumo, que se sabe que afectan tanto el riesgo como la gravedad del trastorno por consumo de alcohol (AUD)^20,21,22. De hecho, la ingesta media de un individuo a lo largo del tiempo puede ser consecuencia de varios episodios de consumo excesivo de alcohol o de muchos episodios de bebida, cada uno de ellos asociado a un consumo relativamente bajo, y estos matices pasan desapercibidos cuando el consumo se mide como la ingesta total por sesión de bebida. Es importante destacar que se observan significativamente más episodios de consumo de alcohol asociados con grandes episodios de bebida (es decir, tragar) en individuos con AUD en relación con controles sanos²³ y los datos en primates no humanos sugieren que los individuos que establecen un patrón de consumo de alcohol que incluye grandes episodios de bebida al principio de su historial de consumo de alcohol tienen un riesgo significativo de AUD²². Además, los episodios de consumo de alcohol que incluyen grandes episodios de consumo aumentan significativamente el riesgo de morbilidad y mortalidad independientemente del diagnóstico de AUD²¹. En conjunto, estos datos han llevado a un mayor interés en examinar los patrones de bebida, además de los niveles de ingesta general en modelos preclínicos, y han impulsado el desarrollo de una serie de sistemas de diversa complejidad que son capaces de capturar datos de bebida a nivel de lamidas individuales.

Entre los primeros se encuentra el desarrollo de un sistema de dos botellas equipado con detección de lamido de fotohaz diseñado para su uso en ratones²⁴. Este sistema fue adaptado posteriormente por un grupo separado para su uso en rats²⁵. En los años transcurridos desde entonces, se han utilizado variaciones sobre este tema para desarrollar sistemas similares contenidos en alojamientos personalizados para roedores²⁶, que permiten la detección de lamidas de animales individuales alojados socialmente^27,28, y que capturan tanto el comportamiento de alimentación como de bebida²⁹. Entre estos, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ ha atraído una atención significativa por ofrecer un sistema para su uso en ratones que es paralelo a la facilidad de implementación y asequibilidad del sistema desarrollado por Godnyuck et al.²⁴. Este sistema utiliza la detección capacitiva para detectar directamente el contacto entre la lengüeta y el tubo de sorbo de metal conductor, a diferencia de las medidas indirectas como el enfoque o la interacción del sorbedor que se proporcionan mediante el sistema de detección de fotohaz. Los autores proporcionan datos que demuestran que su sistema de detección capacitiva ofrece una precisión y sensibilidad significativamente mayores en la detección de lamidos, produciendo correlaciones más fuertes entre el número de lamidos y el cambio en el peso de la botella que la detección de fotohaz. Los autores demuestran además la capacidad de utilizar este sistema junto con un paradigma de acceso continuo de dos botellas para capturar medidas de la microestructura del consumo de alcohol, además de medidas de la ingesta diaria general³⁰.

Aquí, describimos los procedimientos para el consumo de alcohol en jaula en casa con dos botellas utilizando un enfoque estándar, así como métodos que permiten la detección de lamidos (Figura 1). También presentamos métodos para construir e implementar LIQ HDR, una adaptación de LIQ HD³⁰ para su uso en ratas que incluye modificaciones de hardware para acomodar tamaños de jaula más grandes y un portabotellas rediseñado impreso en 3D compatible con botellas estándar listas para usar. Estos métodos proporcionan a los investigadores la flexibilidad necesaria para utilizar un enfoque estándar o equipado con un lickómetro, en función de sus recursos experimentales y de sus necesidades de recopilación de datos.

A continuación se muestra una descripción de los materiales necesarios e instrucciones paso a paso para capturar el consumo de alcohol en jaula en casa utilizando el procedimiento de bebida de elección de dos botellas de acceso intermitente adaptado de Simms et al.⁷. En este procedimiento, las ratas tienen acceso las 24 horas del día a dos botellas de bebida, 7 días a la semana. Los lunes, miércoles y viernes (MWF), las ratas reciben una botella que contiene agua (_H2O) y otra botella que contiene etanol (EtOH). Estas botellas se retiran los martes, jueves y sábados (TRS) y se reemplazan con dos botellas de agua. Las ratas beben de las mismas dos botellas de agua los sábados y domingos. Tenga en cuenta que estos métodos se pueden ajustar fácilmente para horarios alternativos de acceso al etanol (por ejemplo, continuo, atracón, etc.) si lo desea. Se proporcionan instrucciones separadas para los enfoques estándar y equipados con lickómetros.

Protocolo

Todos los datos representativos se recopilaron utilizando ratas Long-Evans adultas alojadas individualmente con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago y de acuerdo con las Directrices de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Se requiere una sola carcasa para controlar con precisión el consumo de líquidos por parte de cada sujeto. Las ratas Long-Evans adultas macho (n = 38) y hembra (n = 22) tenían entre 50 y 80 pesos a su llegada y se les permitió aclimatarse al vivero durante una semana antes de comenzar el experimento. Las ratas tenían acceso ad libitum a la comida estándar (Teklad 7912, Envigo) y al agua, a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación antes del experimento

1. Etiquete las botellas para beber como H,₂, O o EtOH. A continuación, etiquete con un identificador único para cada rata: una botella de H₂O y una de EtOH para MWF y dos botellas de H₂O para TRS.
   NOTA: Opcionalmente, use cinta adhesiva de diferente color para identificar las botellas de H,₂O y EtOH para ayudar a evitar posibles errores durante el cambio de botella.
2. Llene las botellas de_H2O con agua potable 1 día antes de la fecha de inicio del experimento. Prepare la solución >
3. Prepara una jaula vacía en la misma estantería que las ratas que participan en el experimento. Esta jaula se utilizará para calcular el derrame.
4. Equipe las jaulas con el sistema LIQ HDR si lo utiliza (consulte el paso 3, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 y Figura complementaria 1).
5. Determine la hora precisa del día para el cambio de biberón antes del inicio del estudio. Los biberones deben reemplazarse a la misma hora todos los días para obtener una medición precisa de la ingesta de 24 horas.
   NOTA: Investigaciones anteriores han demostrado que los roedores exhiben el mayor grado de consumo temprano después del inicio del ciclo oscuro^10,31. Por lo tanto, para capturar la ingesta durante este período altamente activo (consulte el paso 2.3.1 para capturar el consumo excesivo de alcohol), se recomienda que el cambio de botella ocurra entre 30 y 60 minutos después de que se apaguen las luces. Use lámparas rojas durante el cambio de botella para permitir la visualización sin interrumpir el ciclo de luz y oscuridad.

2. Procedimientos diarios y mantenimiento

1. El primer día del experimento, haz lo siguiente.
   1. Retire las botellas de agua estándar de las jaulas.
   2. Opcional: Las ratas a menudo empujan la parte superior de la jaula mientras buscan comida, lo que podría causar derrames que no pueden ser corregidos por la jaula de derrame vacía. El uso de tazas de comida dentro de la jaula puede aliviar esta preocupación. Si lo usa, retire la comida de la parte superior de la jaula ahora, agregue una taza de comida dentro de la jaula y llénela con comida. Asegúrese de que el espacio asignado a la rata aún cumpla con las pautas institucionales basadas en el tamaño de la jaula para ratas y el tamaño de la taza de comida.
   3. Indique al personal de cuidado y cría, según corresponda, que el personal de investigación proporcionará alimentos y agua durante la duración del experimento.
   4. Los cambios en la jaula pueden ser perjudiciales para la recopilación de datos. Realice cambios de jaula junto con la obtención de mediciones de peso corporal. Los investigadores que decidan hacer esto deben informar a su personal de cuidado y cría en consecuencia.
2. En los días siguientes, siga los procedimientos que se describen a continuación.
   NOTA: Recuerde que cualquier movimiento de jaulas y botellas puede crear derrames. Por lo tanto, es importante ser cuidadoso con los movimientos y utilizar los mismos métodos de aplicación y extracción de botellas en la jaula de derrame que se utilizan para las jaulas de ratas.
   1. Ingrese a la sala antes de la hora de cambio de botellas, asegurándose de tener tiempo suficiente para llevar a cabo los pasos a continuación, y coloque las botellas nuevas en jaulas a la hora de inicio de la sesión adecuada.
   2. Retire la parte superior de los filtros de las jaulas. Si es MWF, continúe con el paso 2.2.3. Si es TRS, continúe con el paso 2.2.4.
   3. Los lunes, miércoles y viernes, retire las botellas TRS de la parte superior de las jaulas. Pesar botellas de MWF (una de EtOH y una de_H2O). Registre el peso inicial de la botella para la sesión de bebida de hoy. Proporcione comida adicional a la parte superior de la jaula o tazas de comida si es necesario. A la hora designada para el inicio de la sesión, coloque los biberones en la parte superior de la jaula de cada rata con cinta adhesiva hacia arriba para que las ratas no mastiquen la etiqueta de la botella><. NOTA: Por lo general, el consumo de agua no se registra ni se informa para TRS, pero los investigadores pueden recopilar opcionalmente estos datos obteniendo los pesos de las botellas de encendido y apagado como se describe a continuación en los pasos 2.2.3 y 2.2.4 si lo desean. El lado de la botella de EtOH debe alternarse después de cada sesión de bebida para evitar el desarrollo de posibles preferencias de lado, que pueden sesgar inadvertidamente los datos de consumo.
      1. Opcional: Trabajos previos han demostrado que muchas ratas exhiben atracones de bebida al inicio de la sesión de bebida^8,32,33. La mayoría de los investigadores que capturan el consumo excesivo de alcohol durante este tiempo informan de la ingesta durante los primeros 30-60 minutos de la sesión de bebida. Para obtener datos de ingesta durante este posible episodio de atracón, siga los pasos que se describen a continuación.
      2. Configure un temporizador después de que se coloquen los biberones en la última jaula. Deje la habitación tranquila durante el período cronometrado.
      3. Vuelva a entrar en la habitación cuando suene el temporizador. Retire las botellas de EtOH y H₂O y registre el peso de las botellas. Devolver las botellas de EtOH y H₂O a las jaulas.
         NOTA: Este paso no es necesario para capturar episodios de atracones cuando se utiliza un sistema equipado para la detección de lamidos.
   4. Los martes, jueves y sábados, retire las botellas de MWF de las jaulas a la hora de finalización de la sesión designada, correspondiente a 24 horas después de la hora de inicio. Pese cada botella y registre el peso final de la botella para la sesión de bebida de MWF. Obtenga y registre el peso corporal de cada rata. Si es necesario, proporcione comida adicional a la parte superior de la jaula o a los vasos de comida. Coloque los frascos TRS H₂O en la parte superior de cada jaula para ratas con cinta adhesiva hacia arriba para que las ratas no mastiquen la etiqueta del frasco.
   5. Regrese las tapas de los filtros a las jaulas y abandone la habitación del animal.
      NOTA: Opcionalmente, cubra los sorbos de botellas de EtOH para evitar la evaporación. Si el personal de investigación está realizando cambios de jaula, designe 1 día a la semana durante las tareas de TRS para realizar esta tarea. Coloque cada rata en una jaula limpia después de obtener el peso corporal.
3. Lave los biberones y los líquidos refrescantes de forma regular, semanal o quincenal, de acuerdo con los procedimientos de cuidado y cría de animales de la institución. Tenga cuidado de realizar estas tareas de una manera que no interrumpa las sesiones de bebida. Por ejemplo, las botellas TRS H₂O se pueden lavar y rellenar después de retirarlas en MWF. Del mismo modo, las botellas MWF H₂O y EtOH se pueden lavar y rellenar después de retirarlas en TRS.

3. Detección de lamidos durante experimentos de elección de dos botellas

NOTA: Los investigadores interesados en capturar datos de alta resolución sobre el consumo de alcohol pueden modificar el procedimiento anterior añadiendo capacidades de detección de lamido a las botellas. LIQ HD³⁰ es un sistema de bricolaje de bajo costo que permite este tipo de recopilación de datos en ratones. Los procedimientos que se describen a continuación describen las modificaciones necesarias para adaptar LIQ HD para su uso en ratas (denominado LIQ HDR). Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de todas las piezas impresas en 3D personalizadas y vendidas comercialmente necesarias para construir un sistema de detección de lamidos, que puede capturar datos de elección de dos botellas para hasta 18 ratas. Los archivos .stl de impresión 3D y las instrucciones se pueden encontrar en el sitio web del autor (www.ejgloverlab.com/3dprints).

1. Configuración de unidades de sensor capacitivo
   NOTA: Cada sistema LIQ HDR consta de tres unidades de sensores capacitivos, que en conjunto capturan datos de lamido de 36 botellas en paralelo correspondientes a 18 ratas de un solo alojamiento. Cada unidad de sensor consta de una placa de conexión de comunicación diferencial I²C y una placa de sensor capacitiva de 12 teclas, que se conectará a los lickómetros desde seis jaulas separadas a través de seis pares de cables de 2 pines codificados por colores para cada lickómetro (Figura 2A).
   1. Reúna los materiales necesarios para construir las tres unidades de sensor capacitivo, como se muestra en Figura 2B, junto con las herramientas de soldadura necesarias.
   2. Para comenzar a construir la unidad de sensor A, cubra un cable conector hembra de 2 pines con un tubo termorretráctil rojo de 7 pulgadas de largo, inserte sus extremos de cable rojo y negro en los pines #0 y #1 en la placa del sensor (Figura 2C-1), y suelde en su lugar (Figura 2C-2). Asegúrese de que el cable esté en la parte delantera de la placa del sensor como se muestra para organizar las jaulas en orden numérico de izquierda a derecha en el vivero sin superponer los cables y potencialmente interrumpir la grabación (consulte el paso 3.6 y Figura 6).
   3. Cubra cinco cables más con un tubo termorretráctil de color distintivo y suelde hasta el pin #2-11 como se muestra (Figura 2C-3). Asegúrese de que todos los cables rojos estén soldados a pines pares, que se conectarán a todas las botellas del lado izquierdo, y que todos los cables negros estén soldados a pines impares, que se conectarán a todas las botellas del lado derecho.
   4. Cubra las uniones de soldadura con pegamento caliente en todos los lados para protegerlas (Figura 2C-4). Etiquete los conectores en orden numérico, proporcionando un ID único para cada lickómetro (Figura 2C-4).
   5. Para ensamblar la unidad de sensor A, conecte la placa de sensor A a un punto final de conexión de comunicación con un cable de 4 pines de 50 mm y conecte el punto final a la salida de 3,3 V de la palanca de cambios de 5 V a 3 V con un cable de 4 pines de 100 mm (clase Figura 2D-1). Aunque tanto la placa del sensor como la placa de conexión de comunicación tienen dos conectores idénticos de 4 pines, es importante asegurarse de que el cableado sea exactamente como se muestra (Figura 2D-1 y Figura 2F) para utilizar las cajas de sensores impresas en 3D y la configuración de vivero sugerida (consulte el paso 3.6 y Figura 6). Aloje la unidad de sensor A dentro de la caja impresa en 3D (Figura 2D-2). Cierre suavemente la parte superior, teniendo cuidado de no aplastar el cable de la palanca de cambios de nivel (Figura 2D-3).
   6. Modifique las direcciones I²C de las placas de sensores B y C soldando un cable de puente desde el pin ADDR al pin 3Vo o SDA como se indica (Figura 2E).
   7. Suelde seis cables conectores hembra codificados por colores a las placas de sensores B y C utilizando el mismo orden que se utiliza para la placa A. Etiquete cada conector con el número de identificación del lickómetro correspondiente. Conecte la placa B al punto medio de conexión de comunicación y C a un punto final con cables de 4 pines de 50 mm (Figura 2F).
   8. Guarde las unidades de sensor B y C en sus respectivas cajas impresas en 3D. Conecte en cadena las tres unidades de sensor con cables Ethernet para completar la configuración del sensor (Figura 2G).
2. Configuración de la interfaz del microcontrolador
   NOTA: La interfaz del microcontrolador LIQ HDR (Figura suplementaria 1A) es la misma que se describe para LIQ HD³⁰ con modificaciones muy menores. Los procedimientos que se describen a continuación proporcionan una descripción general de los pasos necesarios para configurar la interfaz con las modificaciones descritas en los pasos 3.2.6 y 3.2.8. Se remite a los investigadores al protocolo original y al video tutorial proporcionado en la página de GitHub del autor para obtener instrucciones paso a paso más detalladas³⁰.
   1. Reúna los materiales y las herramientas de soldadura necesarios para construir la interfaz del microcontrolador (Figura complementaria 1B). En la parte posterior del escudo táctil (Figura complementaria 1C-1), cree un puente de soldadura a través de las almohadillas de soldadura lite traseras (Figura complementaria 1C-2).
   2. En la parte posterior del escudo de registro de datos, corte el rastro de la almohadilla de puente del pin CS (Figura complementaria 1D-1). En la parte frontal del registrador de datos, suelde un cable de puente corto desde el pin CS hasta el pin #7 (Figura suplementaria 1D-2).
   3. Para instalar los cabezales de apilamiento de escudos, primero apílelos en la parte posterior del escudo de la pantalla táctil (Figura complementaria 1E-1). Apile el registrador de datos en la pantalla táctil, use cinta adhesiva para estabilizar y suelde todos los pines del encabezado al registrador de datos (Figura complementaria 1E-2). A continuación, retire la pantalla táctil.
   4. Apile el cabezal 2 x 3 restante en el microcontrolador (Figura complementaria 1F-1), luego apile el registrador de datos en el microcontrolador antes de soldar los pines del cabezal en su lugar (Figura complementaria 1F-2).
   5. Inserte la pila de botón en el registrador de datos (Figura complementaria 1G-1). Apile la pantalla táctil en el registrador de datos (Figura complementaria 1G-1). Inserte la tarjeta microSD junto con su adaptador en el registrador de datos (Figura complementaria 1G-2).
   6. Para hacer el cable de conexión a tierra adicional, corte un conector macho de un cable de puente y pele el extremo a ~ 1/4 de pulgada (Figura complementaria 1H-1). Suelde una hebra de alambre de núcleo sólido pelado al cable de puente y cubra la unión de soldadura con un tubo termorretráctil (Figura suplementaria 1H-2).
   7. Conecte los cables de puente de 4 pines y el cable de conexión a tierra adicional al microcontrolador (Negro - GND, Rojo - 5V, Amarillo - pin #21, Azul - pin #20, Figura suplementaria 1I-1). Asegure las conexiones con pegamento caliente (Figura suplementaria 1I-2). Opcionalmente, envuelva los cables de puente con un tubo termorretráctil (Figura complementaria 1I-2).
   8. Guarde la interfaz del microcontrolador completamente ensamblada en la caja impresa en 3D, con los cables de puente de 4 pines y el cable de conexión a tierra roscados a través de la abertura en la parte superior (Figura complementaria 1J).
   9. Siga el protocolo original para la instalación del software de interfaz del microcontrolador³⁰.
3. Edificio LIQ HDR lickometers
   NOTA: La impresión 3D personalizada que sostiene las botellas está diseñada para su uso con una botella estándar de bebida para roedores con un diámetro de tubo de sorbo de 8 mm (consulte la Tabla de Materiales, Figura 3A). Este portabotellas se puede adaptar fácilmente para su uso con botellas similares y tubos de sorbo con pequeñas o ninguna modificación.
   1. Reúna los materiales, las impresiones 3D y las herramientas de soldadura necesarias para construir un lickómetro como se muestra en Figura 3B. Tenga en cuenta que cada sistema LIQ HDR tiene capacidad para un máximo de 18 lickómetros para 36 botellas.
   2. Para extender el cable conector macho, pele ambos extremos a ~1/4 de pulgada de longitud, así como los cables negros y rojos de extensión (Figura 3C-1).
   3. Suelde los cables de extensión al cable conector (Figura 3C-2) y cubra las uniones de soldadura con un tubo termorretráctil (Figura 3C-3). Cubra el cable conector macho con un tubo termorretráctil que tenga el mismo color que un cable conector hembra correspondiente en la unidad del sensor (Figura 3C-4).
   4. Para ser coherente con el cableado de la placa del sensor (Figura 2), pase el cable rojo y negro a través del paso de cable interno izquierdo y derecho del portabotellas, respectivamente (Figura 3D-1).
   5. Suelde cada cable hasta el extremo de la cinta de cobre conductora de 1 3/4 de pulgada (Figura 3D-2) y doble las cintas de cobre por la mitad (Figura 3D-3).
   6. Despegue la cinta de cobre y use un par de pinzas para maniobrarla con cuidado dentro del soporte del sorbo (Figura 3E-1) antes de adherirla firmemente a las paredes internas del soporte del sorbo (Figura 3E-2). Asegúrese de que el lado de soldadura de la cinta de cobre esté adherido a la pared más cercana a la línea media del portabotellas, como se indica (Figura 3E-2). Empuje un tubo de sorbo a través del soporte para presionar la cinta firmemente contra la pared y cebar el soporte.
   7. Para reforzar el lado de soldadura de la cinta de cobre, que no es tan adhesivo y tiende a despegarse, aplique una cucharada de pegamento caliente a la unión de soldadura (Figura 3E-3). Unta el pegamento para cubrir tanto la cinta de cobre como cualquier parte adyacente expuesta de la impresión 3D (Figura 3E-4).
   8. Pase el cable a través del paso interno del protector de cable (Figura 3F). Asegúrese de seleccionar el protector de cable apropiado (orientado hacia la izquierda o hacia la derecha) para cada lickómetro con el fin de utilizar la configuración de vivero sugerida (consulte el paso 3.6 y Figura 6)."NOTA: Los lickómetros 5-6, 11-12 y 17-18, que se representan en cables de color azul o púrpura en la configuración actual, requieren un protector de cable orientado hacia la izquierda (Figura 4D-1), mientras que todos los demás lickómetros requieren un protector de cable orientado hacia la derecha (Figura 4D-2).
   9. Para instalar el clip de cable, primero coloque un cable en la ranura de la mitad del clip de cable (Figura 3G-1), luego coloque la otra mitad sobre el segundo cable y luego cierre firmemente ambas mitades con la tuerca (Figura 3G-2).
   10. Etiquete el conector macho con el número de identificación del lickómetro correspondiente (Figura 3H). Repita estos pasos hasta que los 18 lickómetros estén construidos.
4. Instalación de liq HDR lickometers
   NOTA: LIQ HDR está diseñado para su instalación en una jaula de ratas de caja de zapatos estándar con una parte superior de alambre metálico (Figura 4A-1).
   1. Identifique dos pares de varillas con una distancia de centro a centro de ~ 75 mm en la parte superior de la jaula de alambre para acomodar el soporte de la botella. Use un par de alicates para abrir ligeramente las varillas de metal alrededor de las aberturas de los sorbos. Aísle estas varillas con cinta aislante para evitar el contacto de metal con metal entre los sorbos y la parte superior de la jaula (Figura 4A-2).
      NOTA: Aunque la cinta aislante no es accesible para las ratas y, por lo tanto, no es susceptible de masticar, recomendamos desecharla al final del estudio y no reutilizarla entre estudios.
   2. Instale el lickómetro y el panel acrílico láser de 1/8 de pulgada de espesor en la parte superior de la jaula con dos juegos de tornillos y tuercas M5 (Figura 4B). Asegúrese de que las aberturas de los sorbos en el lickómetro y el panel acrílico estén alineadas, y que los sorbos no estén en contacto con ninguna parte de la parte superior de la jaula.
   3. Asegure el clip de cable a la varilla más externa (~4 mm de diámetro) de la parte superior de la jaula de alambre (Figura 4C). Ajuste el clip del cable si es necesario para asegurarse de que la parte superior de la jaula descanse cómodamente en la parte inferior de la jaula y que el cable no se tire o se doble bajo demasiada tensión. Asegúrese de que se está utilizando el protector de cable correcto para cada lickómetro (Figura 4D y consulte el paso 3.8.8).
   4. Ajuste los tubos del sorbedor según sea necesario para que solo ~ 2 cm del sorbedor se extienda desde la tapa (Figura 4E-1). Para instalar botellas, inserte el tubo del sorbedor a través del soporte del portabotellas hasta que se detenga (Figura 4E-2). Solo la punta del tubo sorbedor debe extenderse más allá del panel acrílico (Figura 4E-3). Es crucial que no se exponga ninguna otra parte del tubo del sorbo para evitar falsos positivos de comportamientos no consumatorios, como que la rata toque o juegue con el tubo del sorbo. La parte superior de un filtro debe poder descansar cómodamente sobre la parte superior de la jaula de alambre y el clip del cable sin perturbar el cable mismo (Figura 4F).
      NOTA: Se puede usar un panel acrílico más grueso o una pila de paneles múltiples de 1/8 de pulgada para encerrar completamente tubos de sorbo de longitudes más largas para experimentos que requieren que los tubos de sorbo se extiendan más adentro de la jaula, como cuando se mide el consumo de alcohol en ratas jóvenes que pueden tener problemas para alcanzar un sorbo corto.
5. Instalación y uso de bloqueadores de sipper
   NOTA: El bloqueador de sorbos (Figura 5A) está diseñado para restringir el acceso de la rata al sorbo durante los cambios de botella y para garantizar una calibración precisa del lickómetro al inicio de cada sesión de bebida.
   1. Reúna las piezas impresas en 3D y un tornillo, tuerca y arandela M5 para un bloqueador de sorbos como se muestra en Figura 5B.
   2. Inserte el SIPPER_Gear en el SIPPER_Base (Figura 5C-1). Asegúrese de que el SIPPER_Gear esté orientado exactamente como se muestra en el recuadro de renderizado 3D. Inserte el SIPPER_Worm en la abertura en la parte superior del SIPPER_Base. Gire el tornillo sin fin en el sentido de las agujas del reloj mientras lo inserta hasta que la cabeza esté al ras de la base (Figura 5C-2).
   3. Atornille el SIPPER_Nut al extremo del tornillo sin fin desde la parte inferior de la base (Figura 5C-3). Use pinzas para apretar la tuerca mientras gira el dial helicoidal. Inserte los cuellos redondos y estrechos del SIPPER_Blockers en las ranuras del engranaje (Figura 5C-4).
   4. Instale el bloqueador de sorbos ensamblado en la parte superior de la jaula usando el juego de tornillos M5 (Figura 5D). Asegúrese de que ambos bloqueadores de sorbos estén alineados con las aberturas de los sorbos.
   5. Para bloquear el acceso a los sorbos, gire el dial helicoidal en el sentido de las agujas del reloj para bajar los bloqueadores hasta que cubran completamente las aberturas de los sorbos (Figura 5E).
   6. Para proporcionar acceso a los sorbos, gire el dial en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que los bloqueadores estén en una posición vertical perpendicular a la parte superior de la jaula (Figura 5F-1). Tire manualmente hacia arriba de cada brazo bloqueador hasta que las cabezas estén justo debajo de la parte superior de la jaula de alambre. Gire los bloqueadores 90° para que las cabezas queden paralelas a las varillas de metal en la parte superior de la jaula y los brazos queden bloqueados en su lugar (Figura 5F-2). Siga girando el dial en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que ambos bloqueadores se eleven por encima de la parte superior de la jaula (Figura 5F-3) y los sorbos sean completamente accesibles (Figura 5F-4).
6. Uso del sistema LIQ HDR en el vivarium
   NOTA: La siguiente configuración del vivero está optimizada para capturar el consumo de bebidas de dos botellas utilizando una sola interfaz de microcontrolador conectada a 18 jaulas de ratas de caja de zapatos estándar. Todos los componentes electrónicos, incluida la interfaz del microcontrolador, las unidades de sensor y varios cables, están asegurados a una estantería de alambre metálico montada en la pared que sostiene las jaulas (Figura 6A). Es posible que se requieran algunas modificaciones para adaptarse a las instalaciones de los animales y a las necesidades de los usuarios.
   1. Monte cada unidad de sensor en la estantería del vivero utilizando el tornillo de montaje personalizado impreso en 3D (Figura 6B). Asegúrese de que cada unidad de sensor esté montada directamente debajo de la jaula con el lickómetro de color amarillo para evitar tensiones innecesarias en el cable (Figura 6A).
   2. Organice y asegure cada cable conector hembra asegurándose de que no se superpongan entre sí ni se doblen excesivamente en sus extremos de soldadura, lo que podría resultar en una mala detección de lamido (Figura 6B). Si se utilizan estanterías de varillas de metal, esto se puede lograr fácilmente atando los cables del conector a varillas separadas en el estante como se muestra.
   3. Monte la interfaz del microcontrolador junto a la unidad de sensor A utilizando el mismo tornillo de montaje impreso en 3D y conecte su conector de 4 pines en el puerto de entrada de 5 V del cambiador de nivel de 5 V a 3 V conectado a la unidad de sensor A (Figura 6C).
   4. Use cinta aislante para asegurar el cable de tierra adicional a una fuente de conexión a tierra, como la estantería metálica (Figura 6D).
   5. Organice cada jaula según el color y la identificación del lickómetro instalado según la representación de Figure 6A para minimizar la superposición y la tensión del cable.
   6. Conecte de forma segura todos los cables conectores del lickómetro macho a los cables conectores del sensor hembra correspondientes (Figura 6E). Conecte la fuente de alimentación para encender la interfaz del microcontrolador (Figura 6F).
   7. En la página principal de la GUI (interfaz gráfica de usuario) (Figura 6G), toque el símbolo de configuración para abrir la página de configuración. Los usuarios pueden cambiar el tiempo de encendido y apagado de las luces según el horario del vivero para asegurarse de que la pantalla de la interfaz se atenúe automáticamente cuando comienza el ciclo de oscuridad (Figura 6H-1).
   8. Toque Editar configuración del sensor (Figura 6H-1) para ajustar el umbral táctil a 8 y el umbral de liberación a 2, que hemos encontrado que permite la detección de lamidos más consistente para ratas utilizando la configuración actual (Figura 6H-2). Tenga en cuenta, sin embargo, que es posible que los usuarios deban experimentar con diferentes configuraciones si se introducen modificaciones en el sistema actual.
   9. Desmarque Calibrar automáticamente si los datos solo se recopilan durante un período de 24 horas o menos (Figura 6H-2).

4. Procedimientos diarios para beber en jaula en casa con dos biberones utilizando la detección de lamidos

1. Siga los pasos descritos en el paso 2 para los procedimientos estándar de elección de dos botellas con las siguientes modificaciones.
2. Los lunes, miércoles y viernes, antes de colocar los biberones MWF, use los bloqueadores de sorbos para cubrir las aberturas de los sorbos en todas las jaulas (consulte el paso 3.5.5 y Figura 5E).
3. Antes de grabar, seleccione el lado experimental correcto en la página principal de la GUI, que será el lado de la botella de EtOH para ese día (Figura 6G).
4. Después de instalar todas las botellas MWF, toque START! en la página principal (Figura 6G) para comenzar a calibrar los sensores, durante el cual se recomienda a los usuarios que se alejen del sistema y se aseguren de que las ratas no estén lamiendo los sorbos (Figura 6I-1). La calibración tarda unos segundos en completarse, después de lo cual el sistema ingresa a la página principal de registro que muestra los números de lick acumulados en cada botella para cada lickómetro (Figura 6I-2).
5. Levante todos los bloqueadores de sorbos por encima de la parte superior de la jaula para permitir el acceso a los sorbos (consulte el paso 3.5.6 y Figura 5F), y devuelva suavemente todas las tapas de los filtros como se describe (consulte el paso 3.4.4 y Figura 4F).
6. Toque Refresh (Actualizar) para actualizar los números de lick en la pantalla, que no se actualizarán en tiempo real por sí solos (Figura 6I-2).
7. Los martes, jueves y sábados, toque Guardar y salir para detener la grabación y volver a la página principal (Figura 6I-2) antes de quitar las botellas de MWF.
8. Para extraer la tarjeta SD para la transferencia de datos, toque Expulsar SD antes de desconectar la tarjeta SD (Figura 6G). Inserte la tarjeta SD en cualquier computadora y copie/pegue el archivo de datos .csv con el nombre de la fecha de encendido de la botella en esa computadora (Figura 6K). Para volver a montar la tarjeta SD para la próxima grabación, inserte la tarjeta en la interfaz y toque Montar SD (Figura 6J).
   NOTA: Recomendamos hacer una copia de seguridad de los archivos de datos a diario.
9. Es aconsejable limitar las mediciones de peso corporal a una vez por semana cuando sea compatible con el modelo animal y el protocolo de uso animal y realizar esta tarea el día designado para el cambio de jaula con el fin de minimizar las molestias innecesarias a los lickómetros y sensores. Desconecte todos los cables del lickómetro macho de los cables del sensor hembra correspondientes antes de mover las jaulas. Después de pesar cada rata, devuélvala a una jaula limpia. Transfiera el lickómetro a una nueva parte superior de la jaula y vuelva a conectar cada lickómetro al sensor correspondiente cuando sea necesario.
10. En el caso de los experimentos en los que se evalúe el efecto de una intervención (p. ej., inyección de fármacos) sobre la ingesta de EtOH y la microestructura de la bebida, programe dichas intervenciones antes del inicio de la sesión de bebida, siempre que sea posible. En ocasiones en las que esto no es posible, los investigadores pueden interrumpir la detección de lamidos pulsando Pausa (Figura 6I-2) y reanudar la captura de datos pulsando Reanudar una vez finalizada la intervención. Sugerimos recoger los pesos de las botellas durante cada pausa en la sesión de bebida para capturar los cambios en la ingesta de EtOH antes y después de la intervención, así como para tener en cuenta los derrames que pueden ocurrir al retirar la tapa de la jaula para acceder al animal.
11. Al final del estudio, todos los componentes de la jaula deben desinfectarse a fondo antes de ser utilizados con animales nuevos para limitar la transmisión de contaminantes entre los animales. Recomendamos rociar y limpiar suavemente el lickómetro con una solución de EtOH al 70%, asegurándose de no interrumpir los componentes eléctricos internos. El bloqueador de sorbos y el panel acrílico se pueden lavar con agua tibia y jabón.

5. Análisis de datos

1. Antes de evaluar las medidas dependientes, corrija los datos de ingesta para los derrames que inevitablemente ocurren como resultado del cambio de botellas cada día. Para ello, promedie el cambio en el peso de las botellas de EtOH y H₂O en la jaula de derrame en el transcurso de todo el período de estudio.
2. Excluya los valores superiores a dos desviaciones estándar de la media de cada botella. Después de excluir estos valores atípicos, reste las medias calculadas de los cambios en el peso de las botellas de EtOH y H₂O obtenidas de las botellas en jaulas que contienen animales. Al restar esta cantidad, los investigadores pueden estar seguros de que la pérdida promedio resultante del derrame de una solución dada no se considera en las medidas de consumo. La resta de la cantidad promedio de derrame puede resultar en un valor negativo para algunos animales en algunas ocasiones. Conviértalos en cero e interprete como la ausencia de cualquier ingesta para esa solución.
3. Las principales medidas dependientes para los experimentos de bebida con dos botellas son la ingesta de EtOH (g/kg) y la preferencia (%). Calcule la ingesta a partir del cambio en el peso de la botella de EtOH (g) y normalice al peso corporal (kg) siguiendo los siguientes pasos.
   1. Convierta el cambio en el peso de la botella (g) a el cambio en el volumen (mL) usando la siguiente ecuación:
      
      La densidad del etanol puro es de 0,789 g/mL. Por lo tanto, la densidad contribuyente del 20% de EtOH es de 0,1578 g/mL. H₂O pesa 1 g/mL. Por lo tanto, la densidad contribuyente del 80% H₂O = 0,80 g/mL. En consecuencia, cada mL de una solución de EtOH al 20% (v/v) se compone de 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 g/mL. Por lo tanto, la ecuación final cuando se utiliza una concentración de EtOH del 20% (v/v) es:
      
   2. Calcule la dosis de etanol consumida utilizando la siguiente ecuación. Utilice los pesos corporales obtenidos durante la misma semana que los datos de ingesta para calcular el etanol consumido en términos de peso corporal animal.
      
   3. Calcule la preferencia utilizando la siguiente ecuación:
      
4. Al igual que su contraparte de ratón³⁰, LIQ HDR captura una variedad de variables de microestructura de bebida, incluida la duración del lamido, el número de combate, el número de lamidos y la duración del lamido (Figura 6K). Una sesión de bebida se define como una serie de lamidas que comienza con al menos 3 lamidas realizadas en menos de 1 segundo y termina después de que hayan pasado 3 segundos sin lamidas adicionales. Estas medidas se pueden utilizar para calcular la duración media de los licks individuales, la duración media de los combates individuales, el número medio de licks por combate, la frecuencia media de los licks, el intervalo estimado entre licks y el intervalo estimado entre ellos
   NOTA: La interfaz del microcontrolador proporciona estos datos de microestructura con una resolución de 1 minuto en un archivo de .csv (Figura 6K). Los investigadores pueden usar la aplicación de análisis provista con el protocolo LIQ HD original³⁰ o su plataforma de posprocesamiento preferida para recopilar y resumir los datos de acuerdo con las necesidades de la investigación. Los datos de la microestructura generalmente se suman durante todo el período de 24 horas para comparar las diferencias promediadas a nivel macro, o en un intervalo de 30 minutos a 1 hora para examinar las variaciones del patrón de bebida a lo largo de un ciclo de luz y oscuridad.

Resultados

Estándar intermitente de dos botellas elección jaula en casa EtOH datos de bebida
Utilizando el procedimiento estándar (Figura 7A), los investigadores pueden capturar la ingesta de 24 horas (Figuras 7B-D) así como el consumo excesivo de alcohol si se recogen los pesos de las botellas poco después del inicio de la sesión de bebida (Figuras 7E-F). Al calcular la ingesta de etanol en relación con la ingesta de agua, los investigadores también pueden obtener datos de preferencia en todos los puntos de tiempo medidos (Figuras 7D,F). Como se muestra en Figura 7C, las ratas frecuentemente exhiben un período de escalada en la ingesta de etanol en el transcurso de los primeros días de acceso a la elección de dos botellas. A esto le sigue una meseta durante la cual la ingesta se mantiene relativamente estable. Aunque se observa consistentemente en ratas machos^{7,32,33,34,35,36}, este patrón no siempre se observa en las hembras. En cambio, algunos estudios informan de niveles estables de ingesta de etanol durante todo el período de estudio en ratas hembras^37,38. Además, algunos estudios sugieren que la ingesta de etanol puede aumentar aún más con períodos más prolongados de acceso^36,39. La ingesta diaria puede variar significativamente de un individuo a otro. Sin embargo, la ingesta diaria promedio ha sido bien caracterizada para las cepas más comúnmente utilizadas en la investigación sobre el alcohol y se puede usar como punto de referencia para el éxito cuando se observan los datos agrupados^{7,8,33,34,35,39}.

Como se muestra en Figura 7E, muchas ratas consumen una porción significativa de su ingesta diaria de etanol poco después del inicio de la sesión de bebida^8,33. Este patrón de consumo de etanol a menudo se asocia con una preferencia significativa por el etanol sobre el agua (Figura 7F). Sin embargo, los investigadores no deben sorprenderse si la preferencia de 24 horas no supera el 50%. Esto es particularmente cierto para las cepas de roedores endogámicos o que no prefieren el alcohol y los estudios limitados a períodos relativamente cortos de acceso a elección de dos botellas^{7,32,33,35,37}.

Validación de LIQ HDR para el análisis de la microestructura de bebida de dos botellas
La adición del sistema LIQ HDR al paradigma estándar de elección de dos botellas para ratas permite a los investigadores predecir con exactitud y precisión la ingesta utilizando los datos de bebida capturados. Esto se confirma por la presencia de una correlación fuerte y significativa entre el número acumulado de lamidas detectadas y el cambio en el peso de las botellas tanto para el EtOH (R² = 0,7789, F_(1,113) = 398,1, p < 0,0001) como para la botella H₂O (R² = 0,7910, F_(1,117) = 442,9, p < 0,0001) durante un período de 24 horas (Figura 8A). Esto también es cierto para los días en que las ratas recibieron dos botellas que contenían H₂O (R² = 0,8875, F_(1,188) = 1484, p < 0,0001; Figura 8B).

LIQ HDR también permite un análisis preciso de los patrones de consumo a una alta resolución temporal que no ofrece el paradigma estándar de elección de dos botellas. Con este enfoque, los investigadores tienen la oportunidad de examinar las diferencias en los patrones de consumo de alcohol entre diferentes soluciones, a través del ciclo de luz, entre sexos, grupos de drogas y más. A modo de ejemplo, agrupar el promedio de lamidas en intervalos de 30 minutos permite un análisis fácil de los patrones de consumo promedio de 24 horas. Como se esperaba, este análisis revela ingestas significativamente más altas de EtOH y H₂O durante el ciclo de oscuridad, cuando las ratas están despiertas, que en el ciclo de luz, cuando las ratas suelen dormir (Figura 8C). Usando un enfoque similar, los investigadores pueden explorar las diferencias grupales en los patrones de bebida. Por ejemplo, la microestructura de bebida se puede comparar entre ratas macho y hembra examinando el número promedio de lamidas de EtOH (Figura 8D) o agua (Figura 8E) durante un período de 24 horas. Para investigar el consumo de alcohol de carga frontal y/o de forma compulsiva, los investigadores pueden aumentar la resolución de su análisis para centrarse en el consumo de alcohol que se produce poco después del inicio de la sesión utilizando una ventana de agrupación más pequeña para resumir los datos. Hacerlo permite a los investigadores investigar períodos de consumo excesivo de alcohol sin necesidad de recolectar varios pesos de botellas dentro de un período de 24 horas. Como se muestra en Figura 8C (recuadro), este análisis revela que la mayor parte de la bebida capturada por el peso de una botella obtenida 30 minutos después del inicio de la sesión ocurre en los primeros 5 minutos, en lugar de durante todo el período de 30 minutos. Datos como estos pueden ayudar en la identificación de puntos de tiempo óptimos para la recolección de muestras de sangre para medir la concentración de etanol en sangre (BEC). De hecho, se observó un patrón similar de carga frontal en un día de consumo separado durante el cual se capturaron patrones de consumo de alta resolución en un período tan corto como 15 minutos (Figura 8F). El promedio de lamidas registrado durante esta sesión predijo de manera confiable el cambio en el peso de la botella (EtOH: R² = 0.6316, F_(1,10) = 17.15, p = 0.0020; H₂O: R² = 0,8601, F_(1,10) = 61,47, p < 0,0001; Figura 8G). Por otra parte, los BEC tomados de muestras de sangre obtenidas 15 min después del inicio de la sesión se correlacionaron bien con el número de lamidos detectados (R² = 0,4327, F_(1,10) = 7,627, p = 0,0201; Figura 8H) incluso para niveles relativamente bajos de ingesta de EtOH.

LIQ HDR captura varias medidas de la microestructura de la bebida que se detectan y calculan en tiempo real durante las sesiones de bebida y se guardan en contenedores de 1 minuto similares a la detección de lamidos (Figura 6K). Estas medidas se describen brevemente en el paso 5.4 y se definen anteriormente³⁰. Los investigadores pueden realizar análisis detallados de los cambios en la microestructura individual de la bebida y examinar cómo y hasta qué punto los patrones de bebida contribuyen a las diferencias en la ingesta general. A modo de ilustración, encontramos que aunque las ratas macho y hembra exhibieron un número similar de lamidas, episodios de bebida y duración del ataque (Figura 9A-C) cuando bebían agua, esto se asoció con una mayor ingesta total (g/kg) en las hembras que en los machos (t-test; t=2,882, df=10, p=0,0163; Figura 9D). Esto es esperable dado el dimorfismo sexual en el peso corporal, que facilita mayores niveles de ingesta por peso corporal para las hembras que para los machos para un número equivalente de lamidas. Sorprendentemente, esto contrasta con la comparación de las diferencias de sexo en los patrones de microestructura para el EtOH, que reveló una microestructura de bebida similar asociada con niveles similares de ingesta de EtOH (Figuras 9E-H). Estos datos sugieren que, si bien el volumen de lamido para el agua es similar entre sexos, en comparación con los machos, las ratas hembra tienen un volumen de lamido más pequeño para EtOH. En conjunto, estos datos microestructurales respaldan la idea de que las ratas macho y hembra probablemente difieren en las estrategias de bebida voluntaria según el tipo de líquido consumido en el entorno de la jaula doméstica. Trabajos anteriores también han reportado diferencias de sexo en las estrategias de bebida que dependen del tipo de líquido^40,41, aunque las diferencias observadas en estos estudios no solo se limitaron al consumo de agua. La duración del historial de consumo de alcohol puede desempeñar un papel en las diferencias observadas entre los estudios, ya que el consumo de dos botellas se limitó a 5 semanas en el conjunto de datos actual, mientras que superó las 12 semanas en trabajos anteriores^40,41.

Figura 1: Elección de dos botellas para beber en jaula en casa. (A) Los investigadores pueden medir la ingesta y preferencia voluntaria de etanol en jaulas caseras (en relación con el agua) utilizando un enfoque estándar que calcula la ingesta en función del cambio en el peso de la botella. (B) Mediante el uso de LIQ HDR, un sistema de detección de lamidas en jaulas caseras de bajo costo diseñado para ratas, los investigadores pueden adquirir las mismas medidas que en el procedimiento estándar de elección de dos botellas y, al mismo tiempo, capturar la microestructura de bebida de alta resolución durante todo el período de registro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Construcción de unidades de sensor capacitivas. (A) Piezas electrónicas y diagrama de cableado. (B) Materiales para construir tres unidades de sensores capacitivos necesarios para construir un sistema LIQ HDR. (C) Suelde los cables de conector hembra de 2 pines para las jaulas # 1-6 para el tablero del pin A # 0-11 y asegure las juntas de soldadura con pegamento caliente. Cables codificados por colores con tubos termorretráctiles de colores y etiquete cada uno con un número de identificación de lickómetro único. (D) Conecte la placa A y el cambiador de nivel de 5 V a 3 V a un punto final de conexión de comunicación diferencial I²C con cables de 4 pines (1), y la placa de la casa A y la conexión de comunicación en la carcasa impresa en 3D (2-3). (E) Cambie las direcciones I²C de las placas B y C soldando un cable de puente desde el pin ADDR a los pines 3Vo y SDA, respectivamente. (F) Suelde los cables conector hembra de 2 pines a las placas de sensores B y C, etiquételos con los ID de lickómetro correspondientes y conecte la placa B a un punto medio de conexión de comunicación y la placa C a un punto final con cables de 4 pines. (G) Aloje las unidades de sensor B y C en sus respectivas cajas impresas en 3D y conecte en cadena las tres unidades con cables Ethernet. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Construya el lickómetro LIQ HDR. (A) Renderizado 3D de los componentes de la jaula. (B) Materiales para la instalación de un lickómetro de dos botellas. Tenga en cuenta que un sistema LIQ HDR tiene capacidad para 18 lickómetros de dos botellas. (C) Extienda la longitud del cable conector macho de 2 pines con un par de cables negros y rojos y código de color con tubo termorretráctil. (D) Pase los cables negro y rojo a través de las aberturas izquierda (L) y derecha (R) del portabotellas (1) y suelde los extremos a las cintas de cobre (2-3). (E) Adherir las cintas de cobre a las paredes internas de los soportes del sorbedor (1-2) y reforzarlas con pegamento caliente (3-4). (F) Pase el cable a través del protector de cable. (G) Instale el clip de cable. (H) Etiquete el conector con el número de identificación del lickómetro correspondiente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Instalación del Lickometer. (A) Use cinta aislante para aislar las varillas de metal alrededor de las aberturas del sorbo en la parte superior de la jaula de metal. (B) Instale el lickómetro y el panel acrílico en la parte superior de la jaula con dos juegos de tornillos y tuercas M5. (C) Asegure el clip de cable a la varilla más externa de la parte superior de la jaula de alambre. (D) Asegúrese de utilizar el protector de cable adecuado (L izquierda o R derecha) para cada jaula. (E) Asegúrese de que solo ~ 2 cm de los sorbos de botellas esté expuesto (1), de modo que cuando las botellas se coloquen en la jaula (2) solo las puntas de los sorbos se extiendan más allá del panel acrílico y sean accesibles para las ratas. (F) La parte superior del filtro debe encajar sobre el clip del cable sin perturbar el cable en sí. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Instalación y uso del bloqueador de sorbos. (A) Renderizado 3D del bloqueador de sorbos. (B) Piezas personalizadas impresas en 3D para un bloqueador de sorbos. (C) Ensamble las piezas impresas en 3D. (D) Instale el bloqueador de sorbos ensamblado en la parte superior de la jaula con un tornillo M5 + tuerca + arandela. (E) Gire el dial en el sentido de las agujas del reloj para bloquear el acceso a los sorbos. (F) Gire el dial en sentido contrario a las agujas del reloj para quitar los bloqueadores de los sorbos (1), levante los bloqueadores y gírelos 90° (2), y continúe girando el dial en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que los bloqueadores estén por encima de la parte superior de la jaula (3-4). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Configuración del vivero y funcionamiento de la GUI. (A) Configuración recomendada del vivero y diagrama de cableado. (B) Monte cada unidad de sensor en la estantería y organice y estabilice los cables del sensor en la estantería. (C) Monte la interfaz del microcontrolador en la estantería y conecte su puente de 4 pines al cambiador de nivel de 5 V a 3 V conectado a la unidad de sensor A. (D) Asegure el cable de tierra adicional con cinta eléctrica. (E) Conecte los cables del sensor a los cables del lickómetro correspondiente. (F) Conecte la fuente de alimentación para encender la interfaz del microcontrolador. (G) Página principal de la interfaz gráfica de usuario. (H) Toque Configuración para ajustar el tiempo de encendido/apagado de las luces al horario de luz del vivero (1) y toque Configuración del sensor para ajustar los umbrales de tacto y liberación para ratas (2). (I) Para registrar datos, seleccione el lado de la botella de EtOH en la página principal, toque INICIAR! para calibrar los sensores (1) e iniciar la grabación (2). Pulsa Actualizar para actualizar el número de lick que se muestra en la pantalla y pulsa Guardar y salir para detener la grabación. (J) Toque Expulsar SD en la página principal para quitar la tarjeta SD y transferir datos. Toque Montar SD después de insertar la tarjeta SD. (K) Captura de pantalla de un archivo de datos sin procesar representativo que ilustra cómo la interfaz del microcontrolador guarda los datos de microestructura en una bandeja de 1 minuto. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Datos representativos de consumo de dos botellas capturados utilizando el procedimiento estándar. En el paradigma de acceso intermitente de dos botellas con jaula en casa de EtOH, (A) las ratas reciben una solución de EtOH al 20% (v/v) (naranja) y H₂O (azul) los lunes, miércoles y viernes (MWF), y dos botellas que contienen H₂O los martes, jueves y fines de semana. (B) Las mediciones de la ingesta diaria de líquidos revelan que, mientras que las ratas mantienen un nivel relativamente constante de ingesta total de líquidos (mL) durante todo el período de estudio, (C) las ratas a menudo exhiben un aumento en la ingesta de EtOH en el transcurso de las primeras sesiones de bebida, después de las cuales los niveles de ingesta se estabilizan. (D) Este patrón de escalada y mantenimiento se refleja de manera similar en la preferencia por el EtOH. Los investigadores también pueden capturar la ingesta de EtOH (E) similar a un atracón si se recogen los pesos de los biberones después de los primeros 30-60 minutos del inicio de la sesión. (F) Esto a menudo se asocia con una alta preferencia por EtOH sobre H₂O. Las barras de error sombreadas representan ± SEM (n = 32 para los hombres y n = 16 para las mujeres). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: LIQ HDR captura con precisión el consumo a alta resolución temporal. La precisión y exactitud del sistema LIQ HDR se confirma, en parte, por la presencia de una correlación positiva significativa entre el número de lamidas y el cambio en el peso de la botella en los días en que las ratas reciben (A) H₂O y EtOH, así como (B) días en que ambas botellas contienen H₂O. (C) Diferencias en los patrones de bebida entre H₂El O (azul) y el EtOH (naranja) a lo largo del período de consumo de 24 horas se pueden evaluar fácilmente agrupando los lamidos promedio en intervalos de 30 minutos. El recuadro corresponde a los lamidos promedio en los contenedores de 5 minutos durante los primeros 30 minutos de acceso a la botella (resaltados en gris), durante los cuales las ratas a menudo exhiben un comportamiento significativo de carga frontal. Las diferencias entre los grupos en los patrones de bebida también se pueden examinar utilizando un enfoque similar, como lo ejemplifica la microestructura de lamido para (D) EtOH y (E) H₂O representada para ratas macho y hembra durante un período de 24 horas. (F) Los patrones de consumo de alcohol también se pueden evaluar en alta resolución temporal a lo largo de un período de prueba más corto, (G) durante el cual LIQ HDR continúa rastreando con precisión la ingesta y (H) predecir la concentración de etanol en sangre (BEC) incluso para niveles relativamente bajos de ingesta de EtOH. Las barras de error sombreadas representan ± SEM (n = 6 para cada sexo). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Datos representativos de la microestructura de bebida. LIQ HDR permite la captura de medidas de la microestructura de bebida, incluyendo (A) el número de lamidas, (B) el número de episodios de bebida y (C) la duración de la bebida, además de (D) la medición de la ingesta total de agua por un cambio en el peso de la botella. (E-H) Se pueden obtener medidas similares para el etanol. Las comparaciones entre grupos de estas medidas pueden identificar distintos patrones de bebida, como es el caso en el ejemplo actual, que revela diferencias de sexo en las estrategias de bebida en función de la solución consumida. La línea continua indica la mediana y las líneas punteadas indican cuartiles (n = 6 para cada sexo); prueba t no apareada; *p < 0,05. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Configuración de la interfaz del microcontrolador. (A) Piezas electrónicas y diagrama de cableado. (B) Materiales para construir la interfaz de microcontrolador requerida para un sistema LIQ HDR. (C) En la parte posterior del escudo táctil capacitivo, agregue un puente de soldadura a través de las almohadillas de soldadura traseras lite. (D) En la parte posterior del escudo de registro de datos, corte el rastro de la almohadilla de puente del pin CS (1). Suelde un cable de puente desde el pin CS hasta el pin #7 (2). (E) Suelde los pines del cabezal al registrador de datos utilizando el escudo táctil como base. (F) Apile el cabezal 2x4 restante en el microcontrolador (1), apile el registrador de datos en el microcontrolador y suelde el cabezal en su lugar (2). (G) Inserte la pila de botón en el registrador de datos (1), apile la pantalla táctil en el registrador de datos e inserte la tarjeta SD en el registrador de datos (2). (H) Para hacer el cable de tierra adicional, corte un conector macho del cable de puente y suelde el extremo a un cable de núcleo sólido pelado. (I) Conecte los cables de puente de 4 pines y el cable de tierra adicional al microcontrolador (1) y asegúrelo con pegamento caliente (2). (J) Aloje la interfaz del microcontrolador en la carcasa personalizada impresa en 3D. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo actual proporciona instrucciones paso a paso para capturar datos de consumo de etanol utilizando un procedimiento de jaula casera de dos botellas de acceso intermitente. Este método se puede implementar con relativa facilidad y con poco o ningún costo o necesidad de equipo de investigación especializado. Utilizando los procedimientos proporcionados aquí para construir e implementar LIQ HDR, un sistema de detección de lamidas para su uso en ratas, los investigadores pueden capturar datos de microestructura de consumo de alta resolución además de medidas estándar de ingesta y preferencia.

El programa de acceso intermitente descrito en el protocolo actual es un procedimiento ampliamente utilizado en gran parte porque es bien sabido que genera niveles más altos de ingesta de etanol que muchos programas alternativos de acceso al etanol. De hecho, investigaciones anteriores han demostrado que las ratas con acceso en un horario intermitente tienen una ingesta diaria promedio de etanol más alta que las ratas con acceso continuo de 24 h ^6,7. Sin embargo, pueden ser deseables diferentes programas de acceso al etanol dependiendo de la pregunta de investigación u otros parámetros de diseño experimental. Los investigadores pueden modificar muy fácilmente el protocolo actual para adaptarse a diferentes horarios (por ejemplo, acceso continuo, beber en la oscuridad, etc.) simplemente cambiando la hora y los días de encendido / apagado de la botella.

Aunque el consumo de dos botellas es un paradigma relativamente simple de implementar, pueden surgir problemas que tienen el potencial de comprometer la recopilación de datos. Por lo tanto, es crucial que los experimentadores inspeccionen los datos a diario para identificar rápidamente posibles problemas. En particular, los investigadores deben prestar mucha atención a los cambios muy grandes o muy pequeños en el peso de las botellas que pueden ser indicativos de un sorbo con fugas u obstruido, respectivamente. Detectar signos de estos problemas a tiempo puede evitar la exclusión de todos los datos de un tema determinado del análisis. De hecho, si los investigadores notan cambios drásticos (o ausencia de cambios) en el peso de la botella durante un período de 24 horas, un simple cambio a una nueva botella puede ayudar a confirmar si una botella determinada debe retirarse de la circulación. Por estas razones, es aconsejable tener botellas y sorbos adicionales a mano. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que algunas ratas exhiben naturalmente niveles muy bajos de consumo de etanol, por ^ejemplo,35. Esto es particularmente cierto para las ratas de ciertas cepas, ver⁸ para una revisión. Por lo tanto, los investigadores no deben alarmarse si una pequeña población de animales en un experimento determinado tiene un consumo de etanol bajo o nulo. Del mismo modo, algunos animales son propensos a jugar con el sorbo/botella de manera que pueda promover el derrame. Aunque son raros, los casos repetidos de cambios altos en el peso de la botella que no están asociados con el consumo pueden requerir que un animal en particular sea retirado del experimento.

Nuestro detallado protocolo paso a paso demuestra la facilidad de implementación y uso del sistema LIQ HDR para ratas. Los investigadores sin conocimientos o habilidades previas en electrónica y programación de microcontroladores pueden adaptar fácilmente este sistema a sus necesidades experimentales con poca o ninguna modificación. Nuestros datos representativos demuestran aún más su aplicación exitosa para estudios de consumo de agua en jaulas caseras de ratas y su poderosa capacidad para capturar numerosas medidas de microestructura de consumo de agua a alta resolución temporal. LIQ HDR incluye varias modificaciones de diseño en relación con su predecesor de mouse³⁰. Esto se hizo no solo como una necesidad para una adaptación exitosa para su uso en ratas, sino también para mejorar la funcionalidad y la experiencia del usuario. Los componentes de la jaula, incluido el portabotellas impreso en 3D, el bloqueador de sorbos y los componentes electrónicos, se reubican en la parte superior de la jaula para protegerlos contra la masticación, lo que puede provocar una pérdida frecuente y significativa de datos y rotación de hardware. La adición de un panel acrílico cortado con láser ayuda a prevenir la destrucción de estos componentes vulnerables. Aparte del panel acrílico, que es el mismo material que una jaula de ratas de caja de zapatos estándar, todos los demás componentes LIQ HDR son inaccesibles para el animal desde el interior de la jaula o solo accesibles por un breve momento durante el cambio de botella. Este diseño limita el potencial de destrucción de los componentes del dispositivo y el riesgo para el animal a través de la ingestión de artículos no alimentarios. A diferencia de las botellas hechas a medida que requieren mucha mano de obra utilizada en el diseño LIQ HD, el portabotellas impreso en 3D de LIQ HDR está diseñado para ser compatible con las botellas comerciales para roedores listas para usar. Las botellas se instalan en la parte superior de la jaula y son accesibles para las ratas de la misma manera que se aplican las botellas para beber durante el cuidado y la cría estándar. La adición de bloqueadores de sorbos es una solución simple pero efectiva que mejora la confiabilidad del sistema y evita la pérdida de datos valiosos que, en ausencia del bloqueador, puede resultar de la bebida que ocurre antes de iniciar la captura de datos en la interfaz Arduino o las medidas erróneas de lamido que ocurren cuando las ratas interactúan con los sorbos durante la calibración diaria. Si bien las jaulas para ratas considerablemente más grandes requieren aumentar el tamaño del diseño de hardware original, el uso de cables significativamente más largos puede afectar negativamente la sensibilidad y precisión de la detección capacitiva debido a la interferencia, así como la integridad de la comunicación I²C entre las placas de sensores conectadas en cadena y la interfaz Arduino. Evitamos este problema con la adopción del sistema de comunicación diferencial I²C para lograr una transmisión de señal de ultra largo alcance y casi sin pérdidas a través de cables Ethernet. Los materiales utilizados para los componentes de la jaula permiten una fácil limpieza y desinfección entre usos. El lickómetro se puede esterilizar y limpiar con una solución de EtOH al 70%, mientras que se debe tener cuidado para garantizar que los componentes eléctricos, como la cinta de cobre conductora, permanezcan intactos. Los equipos no eléctricos que están en contacto directo con el animal, como el bloqueador de sorbos y el panel acrílico, se pueden lavar a fondo con agua tibia y jabón.

La confiabilidad y efectividad de cualquier sistema de detección de lamidas requiere una construcción e instalación adecuadas, así como pruebas exhaustivas, monitoreo diligente de errores y resolución de problemas efectiva. Todos los componentes de bricolaje deben fabricarse y ensamblarse con habilidad y cuidado. Esto es especialmente importante para los pasos que involucran soldadura, que pueden requerir práctica para principiantes. Independientemente, se requieren pruebas exhaustivas de todos los lickómetros antes de su uso en experimentos reales. Si el sistema debe modificarse para adaptarse a las necesidades experimentales individuales, es posible que sea necesario ajustar aún más la configuración del sensor (por ejemplo, los umbrales de toque y liberación) para una detección precisa de lamidos. Para los usuarios primerizos, sugerimos probar el sistema en un breve estudio piloto de muestra pequeña utilizando una solución altamente apetecible que generará altos niveles de consumo de alcohol. La detección de lamidas se puede verificar en tiempo real inspeccionando visualmente la placa del sensor mientras el LED parpadea cada vez que se registra una lamida. Las correlaciones fuertes, significativas y consistentes entre el número de lamidas y el cambio en el peso de la botella deben usarse como punto de referencia para la configuración adecuada del hardware y el software. Incluso después de finalizar la configuración, recomendamos iniciar la grabación de un experimento determinado en un día en que las ratas reciben dos botellas que contienen agua para solucionar problemas del equipo que pueden ser evidentes al comienzo de un experimento. También puede ser ventajoso probar la función del lickómetro en el día del agua asociado con el cambio de jaula, ya que esto requiere que los lickómetros se desconecten y se vuelvan a conectar al sensor. La falla aleatoria del lickómetro o sensor individual, que daría como resultado datos atípicos muy obvios (por ejemplo, no se detectaron o se detectaron pocos licks a pesar de un cambio sustancial en el peso de la botella) de manera consistente para el mismo lickometer, es indicativo de componentes defectuosos. Recomendamos preparar con anticipación los componentes adicionales para cada elemento del sistema de lickometer para permitir un fácil reemplazo según sea necesario. Finalmente, no se puede exagerar la importancia de asegurarse de que los cables de los sensores no se superpongan o se doblen excesivamente. Si lo hace, puede resultar en casos aleatorios de detección deficiente de lamidos, evidentes por un número de lamidos irrazonablemente bajo para un cambio dado en el peso de la botella o duraciones de lamido extremadamente grandes (cerca de 60,000 ms para un contenedor de 1 minuto) que abarcan minutos u horas. Sin embargo, las pequeñas pérdidas de datos son inevitables en los estudios que recopilan datos durante 24 horas para muchos animales durante muchos días utilizando el enfoque estándar o equipado con un lickómetro. Los investigadores pueden excluir datos erróneos para las raras sesiones de bebida cuando los pesos de las botellas y / o lamidas claramente no reflejan la ingesta (por ejemplo, obstrucción del sorbo, error de calibración, etc.). En ocasiones como estas, el valor promedio para una medida determinada (por ejemplo, ingesta (g / kg), lamidas, etc.) durante el período de estudio para ese sujeto en particular puede sustituirse por el valor faltante durante el análisis de datos. El ANOVA de efectos mixtos también se puede utilizar como alternativa para acomodar los puntos de datos faltantes.

Una de las ventajas del paradigma de consumo de dos botellas es el aspecto voluntario de la ingesta de etanol. Esto ofrece una excelente validez aparente, particularmente a la luz de los hallazgos que muestran que el alcohol administrado por el experimentador puede producir efectos significativamente diferentes sobre la función cerebral y el comportamiento en comparación con el alcohol autoadministrado voluntariamente⁴². Además, la naturaleza voluntaria del paradigma permite a los investigadores capturar diferencias individuales en la ingesta similares a la variabilidad en la preferencia por el alcohol y los patrones de consumo observados en los humanos. Estas diferencias individuales pueden proporcionar una poderosa oportunidad para que los investigadores correlacionen el consumo (ingesta y/o patrones) con la magnitud de los efectos patológicos observados.

Sin embargo, se deben considerar algunas limitaciones del paradigma de beber en jaulas caseras de dos botellas. Por ejemplo, aunque la variabilidad individual en la ingesta de etanol puede ser ventajosa para algunos experimentos, puede ser una desventaja en otros experimentos en los que puede ser deseable un nivel constante de intoxicación o exposición al etanol. Esto es particularmente cierto para los experimentos que examinan las consecuencias de la dependencia y la abstinencia de la exposición crónica al etanol. Es importante destacar que el consumo de alcohol de dos botellas no se caracteriza como un modelo de dependencia, incluso en ratas con acceso a etanol durante períodos prolongados de tiempo. Por lo tanto, en ausencia de síntomas acompañantes de abstinencia, los investigadores deben tener cuidado al interpretar las consecuencias del consumo prolongado de etanol como efectos de dependencia y/o abstinencia. De hecho, es posible, si no plausible, que las ratas que beben cantidades relativamente grandes de etanol durante el procedimiento de elección de dos botellas presenten síntomas de abstinencia, pero que las ratas que beben volúmenes totales más bajos en un período dado de 24 h no muestren signos similares de dependencia. Los patrones de bebida también pueden desempeñar un papel importante en esta consideración, ya que dos animales que beben la misma cantidad durante un período de 24 h pueden experimentar niveles muy diferentes de intoxicación (es decir, BEC) dependiendo del patrón de su ingesta de etanol²². Esto destaca la utilidad de LIQ HDR en el procedimiento de elección de dos botellas, ya que puede identificar fácilmente a las ratas que consumen una dosis determinada de etanol a un ritmo rápido (es decir, trago) frente a aquellas que consumen la misma dosis a un ritmo mucho más lento (es decir, sorbo). Aunque es potencialmente indeseable para los estudios que investigan los efectos de una dosis controlada de etanol, la detección de cambios en los patrones de consumo (p. ej., reducción de episodios de atracones) después de una intervención experimental en particular tiene un valor traslacional significativo dado el enfoque de reducción de daños que se persigue cada vez más en la clínica. Finalmente, no se requiere esfuerzo para que los animales obtengan acceso al etanol en los paradigmas de consumo de jaulas domésticas, incluido el que se describe aquí. Por lo tanto, la utilidad de este paradigma se limita al análisis de la bebida sola, mientras que los métodos operantes se favorecen para los casos en que los investigadores están interesados en examinar la búsqueda de alcohol, una característica importante del AUD.

En resumen, el protocolo descrito aquí proporciona a los investigadores toda la información y los recursos necesarios para medir la ingesta de etanol en ratas en el entorno de jaulas domésticas. Presentamos opciones para enfoques de resolución relativamente baja y alta que brindan a los investigadores la flexibilidad de elegir el método que sea más adecuado para sus necesidades de investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Componentes disponibles en el mercado			Cantidad
12 teclas Conexión del sensor táctil capacitivo (MPR121)	Adafruit	1982	3
de cable de 2 pines (JST XH 2.5mm paso)	Adafruit	4872	18
Puente de placa de pruebas de 4 pines (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
Cable de 4 pines (Qwiic de 100 mm)	SparkFun	PRT-17259	1
cable de 4 pines (Qwiic de 50 mm)	SparkFun	PRT-17260	3
Salida de cambio de nivel de 5 V a 3 V	Adafruit	5637	1
Pantalla táctil capacitiva (2,8 pulgadas)	Adafruit	1947	1
Cinta conductora de cobre (1/4 de pulgada)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND	1
Datos escudo de registro	Adafruit	1141	1
Kit de conexión de comunicación diferencial I2C (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Cinta aislante	DigiKey	3M156004-ND	1
Tubo termorretráctil (3/16 pulgadas varios colores)	Bridas y más	HS357-S10	6
Kit de tubos termorretráctiles (4 pulgadas negro)	Jameco	2095963	1
Batería de botón de litio (3V 12.5mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
arandela plana M5	Grainger	54FN66	1
tuerca hexagonal M5	Grainger	6CA72	1
de máquina M5 (12mm)	Grainger	6GU88	1
de máquina M5 (25mm)	Grainger	6GU91	2
Cable de puente macho/macho	Adafruit	1957	1
Placa de microcontrolador (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
filamento PETG (plata de 2.85mm)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
filamento PLA (2.85mm negro)	Filamento MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
PLA (plata de 2.85mm)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Fuente de alimentación (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
tarjeta de memoria SD/microSD (8GB)	Adafruit	1294	1
Cabezales de apilamiento	Shield Adafruit	85	1
Cable de núcleo sólido (22AWG rojo)	Adafruit	288	1
Cable de núcleo trenzado (22AWG negro)	Adafruit	2976	1
Alambre de núcleo trenzado (22AWG rojo)	Adafruit	3068	1
Tubo sorbedor de tapa giratoria con bola	Diseño alternativo	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Botella de agua (8oz)	Diseño alternativo	WB8FS	38
Componentes impresos en 3D personalizados			Cantidad
Fondo de caja Arduino impreso en 3D	N/A	ARDUINO_Bottom.stl	1
tapa de caja Arduino impresa en 3D	N/A	ARDUINO_Top.stl	1
pinza de cable impresa en 3D L	N/A	CLIP_L.stl	18
tuerca de clip de cable impresa en 3D	N/A	CLIP_Nut.stl	18
pinza de cable impresa en 3D	N/	A CLIP_R.stl	18
portabotellas de lickómetro impreso en 3D	N/A	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Protector de cable de lickómetro impreso en 3D L	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Protector de cable de lickómetro impreso en 3D R	N/	A LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
letras de lickómetro impresas en 3D	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
tornillo de montaje impreso en 3D	N/A	Tornillo de montaje.stl	4
Caja de sensor impresa en 3D A inferior	N/A	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Caja de sensor impresa en 3D A top	N/A	SENSOR_A_Top.stl	1
caja de sensor impresa en 3D B inferior	N/A	SENSOR_B_Bottom.stl	1
caja de sensor impresa en 3D B top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
caja de sensor impresa en 3D C inferior	N/A	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Caja de sensor impresa en 3D C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Letras de la caja del sensor impresa en 3D	/A	SENSOR_Letters.stl	1
Bloqueador de sorbos impreso en 3D	N/A	SIPPER_Blocker.stl	36
Base de bloqueador de sorbos impresa en 3D	N/A	SIPPER_Base.stl	18
Engranaje de bloqueo de sorbos impreso en 3D	N/A	SIPPER_Gear.stl	18
Tuerca bloqueadora de sorbos impresa en 3D	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
Gusano bloqueador de sorbos impreso en 3D	N/A	SIPPER_Worm.stl	18
Panel acrílico de lickómetro cortado con láser	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19