Sistemas de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro

Resumen

El presente protocolo describe la aplicación de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro. En concreto, el sistema modelo descrito utiliza un epitelio oral de múltiples capas expuesto a microorganismos asociados a biopelículas (placa dental) en el contexto de la salud bucal frente a la enfermedad.

Resumen

Recapitular la interfaz huésped-patógeno en la barrera epitelial o mucosa in vitro sigue siendo una perspectiva desafiante para los biólogos de infecciones. Mientras que las monocapas epiteliales 2D cultivadas internamente carecen de una representación real de la situación in vivo , los modelos de tejido disponibles en el mercado a menudo se pasan por alto debido a su costo y practicidad. Sin embargo, con una planificación cuidadosa, estos modelos proporcionan plataformas reproducibles para una amplia gama de aplicaciones diferentes. Aquí, reportamos el uso de modelos epiteliales que pueden ser utilizados para una amplia variedad de propósitos experimentales para investigar las interacciones huésped-patógeno en varios nichos ecológicos, como la cavidad oral, la piel y la mucosa vaginal. Desde células planctónicas simples hasta cocultivos complejos de biopelículas, los modelos epiteliales se utilizan para evaluar la adherencia microbiana y la invasión, y para evaluar la respuesta del huésped a nivel transcripcional y/o de proteínas, con margen para perfiles más detallados utilizando diferentes enfoques ómicos. Además, estos sistemas biológicos se pueden utilizar como bancos de pruebas más precisos para evaluar la actividad antimicrobiana convencional y novedosa en un microambiente complejo huésped-patógeno in vitro. Los protocolos descritos en este documento documentan cómo se manejan los modelos a su llegada y se preparan en el laboratorio para la estimulación del cocultivo con las comunidades de biopelícula. Los métodos detallan cómo se logran los resultados experimentales de los sistemas modelo, incluido el procesamiento de tejido, la configuración del cocultivo y la generación de datos. Estos experimentos incluyen la expresión génica del huésped a través de análisis de qPCR única y múltiple y la detección de proteínas inflamatorias mediante ELISA. En conclusión, los modelos epiteliales proporcionan sistemas in vitro útiles para estudios de investigación preclínica sobre interacciones huésped-patógeno simples o complejas.

Introducción

Los sistemas de modelos in vitro proporcionan excelentes bancos de pruebas para investigar las interacciones huésped-patógeno. Estos sistemas organotípicos tienen como objetivo recapitular el microambiente de diferentes nichos ecológicos propensos a perturbaciones microbianas. Se han publicado varios artículos de investigación que utilizan modelos de tejido EpiSkin (anteriormente SkinEthic) para evaluar las interacciones huésped-patógeno en la cavidad oral 1,2,3,4,5, la barrera cutánea 6,7,8,9,10,11 y la mucosa vaginal ^5,12,13, entre otros^14,15. A diferencia del cultivo celular "bidimensional" o "2D", que se basa en el uso de monocapas de líneas celulares epiteliales expuestas a microorganismos, estos modelos disponibles comercialmente consisten en múltiples capas de células diferenciadas cultivadas en una interfaz aire-líquido. A pesar de ser más baratos y a menudo considerados más reproducibles, los sistemas de cultivo 2D son propensos al daño celular cuando se cultivan con microorganismos, lo que no siempre representa con precisión las barreras epiteliales o mucosas in vivo^16,17.

Evidencias recientes demuestran que las técnicas de cultivo "tridimensionales" o "3D" son cada vez más populares en diversas disciplinas científicas, incluidas las ciencias del cáncer, la investigación con células madre y el descubrimiento de fármacos^16,18. En el contexto de la biología de la infección, los modelos de tejido 3D se pueden utilizar para investigaciones sobre las interacciones huésped-bacterias, hongos o especies mixtas en la interfaz de barrera epitelial o mucosa dentro de un microambiente controlado in vitro. Estos modelos tienen muchas ventajas para los sistemas de cultivo 2D, ya que permiten evaluar la colonización y/o invasión de tejidos por organismos patógenos o comunidades complejas de biopelículas¹⁷, y evaluar las respuestas del huésped a nivel de múltiples componentes para diferentes biomarcadores donde los modelos 2D a veces están restringidos por sus perfiles transcripcionales o proteómicos 16,17,18 . En última instancia, las aplicaciones preclínicas de estos sistemas 3D son vastas y proporcionan importantes datos exploratorios que pueden llevarse a modelos in vivo o estudios clínicos.

En el contexto de la salud y la enfermedad bucal, la comprensión de las vías inflamatorias implicadas en la superficie de la mucosa oral es importante para los clínicos, ya que esto puede dirigir las modalidades de tratamiento. Estudios previos han demostrado que las biopelículas "asociadas a la salud" pueden provocar respuestas inflamatorias mínimas 3,19,20,21. Esto puede deberse a una menor carga biológica microbiana asociada a la salud bucal o debido a la composición del biofilm con Streptococcus spp., ampliamente considerado inmunomodulador ^22,23. Por otro lado, las biopelículas compuestas por microorganismos asociados a enfermedades como Fusobacterium nucleatum y Porphyromonas gingivalis son de naturaleza proinflamatoria ^{3,20,24,25,26,27}. Una revisión realizada por Mountcastle et al. en 2020 describió todos los modelos de cocultivo relevantes que existían en ese momento para el microambiente oral¹⁷. Aunque estos modelos organotípicos son abundantes, con varios producidos desde^28,29, sigue habiendo una serie de obstáculos desafiantes asociados con la creación de dichos modelos 3D. Por nombrar algunos, estos modelos requieren una optimización significativa y su producción requiere mucha mano de obra y recursos; La reproducibilidad también puede ser muy variable a menos que se controle cuidadosamente^16,17. Los modelos disponibles en el mercado eluden estos problemas, proporcionando plataformas para investigar las interacciones huésped-patógeno dentro de la cavidad oral y en otros nichos ecológicos del cuerpo humano.

En resumen, el protocolo actual tiene como objetivo esbozar la aplicación de modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones huésped-patógeno in vitro en el contexto de la salud y la enfermedad bucal. En concreto, el sistema modelo descrito utiliza un epitelio oral de múltiples capas disponible en el mercado y expuesto a una comunidad de biopelículas definida y representativa de la enfermedad inflamatoria oral, la gingivitis.

Protocolo

El siguiente protocolo consiste en la preparación de un biofilm multiespecie representativo de la gingivitis, que contiene un total de 7 especies (spp.)^7,30. Se incluyen tres Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) y Streptococcus oralis (NTCC 11427) para imitar la salud bucal, actuando como colonizadores iniciales de la película salival. A continuación, se añaden cuatro microorganismos anaerobios asociados con el paso de la salud bucal a la enfermedad: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) y dos subespecies de Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) y Fusobacterium nucleatum (subspp.) vincentii (DSM 19507). Todos los pasos involucrados se llevan a cabo de forma aséptica, ya sea en la llama o en un gabinete de seguridad de clase II. Todos los medios y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizados para las preparaciones microbiológicas se esterilizan en autoclave antes de su uso, y la esterilidad se evalúa a intervalos regulares durante el protocolo. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de las comunidades microbianas para el cocultivo

NOTA: Este protocolo representa la generación de una biopelícula multiespecie representativa de consorcios asociados con la inflamación del tejido de las encías, también conocida como gingivitis. Este modelo se ha utilizado para la evaluación de la respuesta del huésped en la salud y la enfermedad bucal, como se ha descrito anteriormente³.

1. Reviva las tres especies de Streptococcus en placas de agar sangre (base de agar sangre Columbia que contiene un 5% de sangre de caballo desfibrinada estéril) a partir de existencias congeladas de perlas porosas (obtenidas comercialmente) que contienen los microorganismos almacenados a -80 ^{° C.} Esto se logra mediante el uso de un asa de inoculación y la técnica de placa de rayas.
   1. Incubar durante 24 h a 37 °C, 5% de CO₂, luego aislar 3-4 colonias para la propagación en 10 mL de medio de caldo de soja triptona. Caldos de cultivo durante 16-18 h a 37 °C, 5% CO₂.
2. Para los patógenos intermedios, reviva V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum y F. nucleatum subspp. vincentii anaeróbicamente en una base de agar anaeróbico fastidioso que contiene un 5% de sangre de caballo estéril desfibrilada durante 48 h a 37 °C, antes del cultivo en caldo Schaedler durante 24-48 h adicionales en las mismas condiciones.
3. Después del crecimiento, las células de pellets se suspenden por centrifugación durante 5 min, 20 °C a 3000 x g, luego lavan los pellets en 10 mL de PBS estéril (pH 7.2-7.6). La célula de pellets se suspende nuevamente mediante centrifugación durante 5 min, 20 °C a 3000 x g, luego repita los pasos de lavado por segunda vez. Vuelva a suspender las células lavadas en 10 mL de PBS estéril para su estandarización.
4. Estandarizar los tres Streptococcus spp. individualmente utilizando un espectrofotómetro a 550 nm. Los valores de absorbancia de 0,50 (rango de 0,45 a 0,55 aceptable) son indicativos de un recuento de células de ~1 x 10⁸ células/mL, como se determinó previamente utilizando la técnica de recuento de células de Miles y Misra³¹. Para lograr esta lectura de absorbancia, diluya aún más 10 mL de suspensiones de células lavadas en PBS estéril.
5. Después de la estandarización, diluya todos los Streptococcus spp. 1:10 a 1 x 10⁷ células/mL en una mezcla 1:1 de caldo Todd Hewitt (THB) y medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Añadir 500 μL de suspensiones celulares por pipeteo a una placa de cultivo de tejidos con microtitulación de 24 pocillos que contenga un disco de hidroxiapatita de 13 mm de diámetro. Dejar madurar los biofilms durante 24 h a 37 °C, 5% de CO₂.
   NOTA: Las biopelículas multiespecie se pueden cultivar en diferentes sustratos orales relevantes, como el esmalte, la dentina³² y las superficies postizas de poli(metacrilato de metilo)^33,34. También se pueden utilizar medios alternativos para estos modelos, como la saliva artificial o sintética, aunque se debe tener muy en cuenta en función de los consorcios de microorganismos utilizados: los estudios han demostrado que la selección del medio de crecimiento tiene implicaciones importantes para el crecimiento de biopelículas de comunidades mixtas^35,36.
6. Al día siguiente, estandarizar los cuatro microorganismos anaeróbicos de manera similar a los anteriores (pasos 1.2-1.4). Suspensiones de células de pellets, lavar dos veces, luego estandarizar V. dispar a 0.50 de absorbancia (rango de 0.45-0.55) y los tres microorganismos restantes a 0.20 absorbancia (rango de 0.18-0.22). Una vez estandarizado, diluya aún más todas las suspensiones 1:10 a 1 x 10⁷ células/mL en una mezcla 1:1 de THB y RPMI.
7. Retire con cuidado las células no adheridas y los medios gastados y deséchelos de las biopelículas de Streptococcus mediante pipeteo. Reemplace los pocillos de placa de microtitulación con 500 μL de suspensiones estandarizadas de 1 x 10⁷ celdas/mL de los cuatro anaerobios. Cultivo de biofilms durante 24 h en condiciones anaeróbicas a 37 °C.
8. Después de 24 horas, retire las células no adheridas y los medios usados de las biopelículas de 7 especies y reemplácelos con 500 μL de mezcla estéril 1:1 de medios THB: RPMI. Las biopelículas se dejan madurar anaeróbicamente a 37 °C durante 4 días, con medios retirados y repuestos diariamente (cuatro cambios de medios en total).
9. El día 7, la biopelícula multiespecie está completamente madura y lista para los experimentos posteriores. Lave las biopelículas dos veces con 500 μL de PBS estéril para su uso en cocultivo.
   NOTA: Las biopelículas se pueden perfilar utilizando una variedad de metodologías biológicas como qPCR (para la evaluación de la composición) y perfiles microscópicos con microscopía confocal o electrónica como se describió anteriormente³.

2. Manipulación de tejidos organotípicos y configuración experimental

NOTA: La configuración experimental que se describe a continuación involucra tejido de epitelio oral humano (HOE) compuesto por células TR146 cultivadas en un filtro de membrana de policarbonato inerte. Existen otros modelos, como los de epidermis, vesical, esofágico, córnea, gingival y vaginal. Todos los modelos se manejan y preparan de una manera similar a la que se describe a continuación para investigar las interacciones huésped-patógeno.

1. A su llegada, desempaque y transfiera el papel y los medios de HOE a un gabinete de seguridad de clase II. Agregue un total de 1 mL de medio de mantenimiento suministrado con el tejido a las placas de 12 pocillos.
2. Retire los insertos de policarbonato que contienen el HOE con pinzas estériles de las placas de 24 pocillos y el agar nutriente utilizados para el envío y transfiéralos a las placas de 12 pocillos que contienen el medio, asegurándose de que no queden burbujas de aire debajo del tejido. Asegúrese de que cualquier exceso de agar adherido a los lados o a la parte inferior de los insertos se elimine con cuidado con un par de pinzas adicionales o papel de seda.
3. Incubar modelos de tejido durante 24 h a 37 °C, 5% de CO₂ antes de la configuración experimental para aclimatarse a las condiciones de laboratorio después del envío. Cabe destacar que se dispone de medios de mantenimiento adicionales o medios de crecimiento para un mantenimiento más prolongado o una mayor maduración de los modelos de tejido.
4. Ahora se pueden llevar a cabo experimentos de cocultivo. Para el ejemplo proporcionado aquí, retire las biopelículas de 7 especies creadas como se ha indicado anteriormente (pasos 1.1-1.9) de sus sustratos mediante sonicación. Para lograr esto, retire los discos de HA que contienen biopelículas de la parte inferior de las placas de 24 pocillos con una aguja de 19 G y pinzas, luego transfiera una joya que contenga 1 ml de PBS estéril de Dulbecco. Sonicar a 35 kHz durante 10 min en un baño de agua de sonicación.
5. Retire con cuidado los insertos que contienen los modelos de tejido con pinzas de la aclimatación nocturna y agregue 100 μL de suspensión de sonicateto de biopelícula directamente al tejido mediante pipeteo. Utilice tejidos de control no estimulados con fines comparativos. Para estos insertos de tejido de control, agregue 100 μL de PBS estéril de Dulbecco sin la suspensión de biopelícula.
   NOTA: Las células planctónicas, los sobrenadantes de biopelícula gastados que contienen células dispersas o las biopelículas completas se pueden utilizar para el modelo de cocultivo en lugar de sinicato de biopelícula. En la Figura 1 se esquematizan las diferentes aplicaciones de estos modelos de huésped-patógeno que utilizan diferentes estimulantes microbianos, como se documenta en otros lugares 3,5,6,8,13,37,38.
6. Después de la adición, transfiera los insertos a otra placa de 12 pocillos que contenga 1 mL de medios de mantenimiento nuevos, asegurándose nuevamente de que no haya burbujas de aire debajo de los insertos. Incubar las placas que contienen modelos de tejido durante 24 h a 37 °C, 5% de CO₂ antes del procesamiento de tejidos para aplicaciones posteriores.
   NOTA: Los proveedores de tejido pueden proporcionar medios adicionales para apoyar el cultivo continuo del tejido después de la exposición a agregados sonicados o biopelículas. Con este fin, se han publicado varios modelos previos que investigan la inoculación prolongada de biofilm^tisular 21,28,39. Para lograr resultados similares utilizando el modelo organotípico actual, sonique el tejido (como se indicó anteriormente, paso 2.6) y deje que los microorganismos se adhieran durante 24 horas. Deseche cualquier suspensión microbiana restante y continúe el cultivo en la interfaz aire-líquido durante el curso de tiempo experimental requerido.

3. Procesamiento de tejidos para resultados experimentales

NOTA: Después del cocultivo, los modelos de tejido se procesan para obtener resultados experimentales. Los siguientes pasos documentan cómo se extrae el ARN del tejido para la elaboración de perfiles transcripcionales y cómo se utilizan los medios tisulares gastados para la detección de proteínas. El tejido también puede fijarse en formol, paraformaldehído o un fijador similar para la evaluación histológica, como se describió anteriormente ^3,6.

1. En primer lugar, prepare 350 μL de tampón de lisis RLT en tubos de junta tórica con tapón de rosca de 2,0 mL que contengan un 1% de β-mercaptoetanol y ~100 μL equivalentes a perlas de vidrio lavadas con ácido de 0,5 mm.
2. Retire los insertos que contienen el tejido del medio con pinzas y deseche cualquier suspensión microbiana restante del inserto. A continuación, manténgalo invertido a la altura de los ojos para mayor facilidad. Con una aguja de 19 G, corte con cuidado el tejido y la membrana desde la parte inferior del inserto y transfiéralo al tampón RLT.
   1. Homogeneizar el tejido a los 30 s utilizando un homogeneizador batidor de perlas de sobremesa y, a continuación, extraer el ARN del lisado siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de extracción de ARN (véase la tabla de materiales).
      NOTA: El ARN extraído se utiliza para la síntesis de ADNc para perfilar la expresión de genes de citocinas y quimiocinas como marcadores de inflamación mediante PCR cuantitativa (qPCR) o secuenciación de ARN. La qPCR se logra utilizando matrices multiplex como la matriz de perfiladores RT₂ PCR que contiene pocillos con cebadores listos para usar para genes específicos, o el reactivo SYBR basado en verde con secuencias de cebadores diseñadas internamente y ddH₂O³ sin nucleasas.
3. Recoja el resto de los medios de tejido gastados (~850-900 μL) para realizar análisis proteómicos utilizando metodologías de bajo y alto rendimiento, como ELISA, inmunoensayos multiplex o análisis de biomarcadores de proteínas multiplex⁷.
4. Utilizando los medios de tejido gastados, evalúe una serie de marcadores asociados con la inflamación a nivel de proteínas. Los medios gastados pueden utilizarse directamente para las metodologías anteriores (paso 3.3) o almacenarse a -20 °C o -80 °C. Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación de los medios para dichos análisis.
   NOTA: Es posible que sea necesario diluir el medio 1:10 dependiendo del estimulante tisular para obtener un perfil proteómico preciso mediante ELISA.

Resultados

En este experimento, HOE fue expuesto a 7 especies de biofilm que contienen un organismo representativo del cambio de la salud bucal a la inflamación de las encías (conocida como gingivitis). Esta enfermedad surge de la inflamación del tejido epitelial gingival u oral debido a las perturbaciones microbianas de la acumulación de placa dental en la superficie del diente. Después de la estimulación, el tejido y los medios gastados se utilizan para los análisis transcripcionales y proteómicos, como se ha comentado anteriormente. Para este experimento, se detectó la expresión génica de un panel de biomarcadores inflamatorios en el tejido post-estimulación con biofilm sonicato (Figura 2). Esto se logró mediante el uso de una matriz de perfiles de PCR RT₂ hecha a medida que contenía 16 genes diferentes, y la expresión génica se mostró como un cambio de pliegue en relación con el tejido no estimulado después de la normalización al gen de mantenimiento GAPDH. La estimulación microbiana aumentó la expresión de todos los genes con la excepción de CXCL5, observándose diferencias estadísticas para NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B y TLR4 (Figura 2A). El mayor cambio en el pliegue se observó para CCL2, CXCL1 y CSF3, con aumentos de 16,9, 10,3 y 15,1, respectivamente (Figura 2B).

Los medios HOE gastados se utilizaron para los análisis proteómicos con el fin de detectar las proteínas producidas y liberadas por el tejido después de la estimulación. Esto es útil para determinar si la expresión génica se correlaciona con la producción de proteínas. Para ello, se evaluó la expresión génica de IL8 y la liberación de proteínas IL-8 en tejido control y tejido estimulado por biofilm-sonicato (Figura 3). La expresión génica se evaluó mediante qPCR basada en SYBR-green con cebadores para IL8 y GAPDH como se describió anteriormente³. La expresión de ARNm de IL8 en HOE se incrementó 8,67 veces tras la estimulación con sonicato de biofilm (Figura 3A). A nivel de proteínas, los niveles de IL-8 se cuantificaron utilizando un kit ELISA de IL-8. La concentración de IL-8 en los medios gastados aumentó de ~1,005 ng/mL en el tejido control a ~4,245 ng/mL en el tejido estimulado por biofilm-sonicato (Figura 3B).

Figura 1: Diferentes aplicaciones para modelos de cocultivo de tejidos organotípicos. Las suspensiones estandarizadas de microorganismos se aplican directamente al tejido para investigar las interacciones especie-huésped (A). A menudo se utilizan para evaluar la colonización microbiana durante un corto período de tiempo (por ejemplo, <24 h). Las biopelículas complejas se sonican para investigar los efectos de las células dispersas o de los agregados de biopelículas en los tejidos (B). Esto es importante ya que anteriormente se ha demostrado que dichas células tienen fenotipos únicos en comparación con sus contrapartes planctónicas o de biopelícula; con este fin, las biopelículas intactas se pueden agregar directamente al tejido utilizando insertos adicionales más pequeños para crear una exposición adyacente con el huésped (C). Finalmente, las células planctónicas se agregan al tejido en un medio de cultivo apropiado para evaluar la colonización microbiana, la formación de biopelículas y la dinámica de crecimiento en el tejido (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Expresión génica del tejido HOE después de la estimulación con sonicate de biofilm de 7 especies. Cambio en el pliegue de la expresión de ARNm de un total de 15 genes inflamatorios normalizados al gen de limpieza, GAPDH, en tejido HOE en muestras control, no estimuladas y expuestas a 100 μL de biofilm de 7 especies de sonicato (A). Los tres genes (CCL2, CXCL1, CSF3) con los mayores cambios en la expresión de ARNm se muestran en (B). Los análisis estadísticos se realizaron mediante una prueba T paramétrica no apareada, con cambios significativos representados como *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001, respectivamente. Los datos se trazaron y analizaron mediante software estadístico y gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Expresión génica de IL8 y niveles de proteína IL-8 producidos por el tejido HOE. Cambio en el pliegue de expresión de ARNm de IL8 en el tejido HOE determinado por qPCR (A) basada en SYBR-green y niveles de proteína IL-8 cuantificados a partir de medios tisulares gastados utilizando la metodología ELISA (B). Los análisis estadísticos se realizaron mediante una prueba T paramétrica no apareada, con cambios significativos representados como *p < 0,05 y ****p < 0,0001, respectivamente. Los datos se trazaron y analizaron mediante software estadístico y gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aquí, se describen metodologías para producir un modelo complejo de biopelícula multiespecie representativo de la gingivitis para el co-cultivo con tejido HOE para evaluar la respuesta del huésped después de la estimulación microbiana. Este protocolo se puede adaptar para su uso en la investigación de las interacciones huésped-patógeno entre células planctónicas, biopelículas de especies simples, dobles o mixtas, o células dispersas por biopelículas con tejido epitelial de diferentes nichos ecológicos en el cuerpo humano. El uso de modelos tisulares para investigar las interacciones huésped-patógeno proporciona un avance importante con respecto a los sistemas de cocultivo anteriores que se limitan a monocapas 2D que no siempre recapitulan realmente la situación in vivo, en la que el tejido epitelial contiene múltiples capas celulares 16,17,18. Además, los desafíos asociados con el crecimiento in vitro de modelos de tejido multicapa son abundantes, con el uso de múltiples líneas celulares y/o el crecimiento de capas celulares en una interfaz aire-líquido propensa a la contaminación. Los tejidos disponibles comercialmente proporcionan una plataforma reproducible con modelos consistentemente de alta calidad que son comparables entre réplicas y lotes, como se muestra en publicaciones anteriores ^3,7.

Para la sección "preparación de comunidades microbianas para el cocultivo", se eligió la inclusión de estos microorganismos para el modelo de gingivitis de 7 especies en función de los comensales y patógenos comúnmente identificados asociados con el cambio de la salud bucal a la enfermedad. Al igual que con todos los sistemas complejos de modelos de biopelículas in vitro, la inclusión de microorganismos está dirigida por estudios de microbioma relacionados con el nicho ecológico particular sano o enfermo. Con este fin, nosotros y otros hemos informado sobre el uso de un modelo de biopelícula asociado a la salud bucal que contiene microorganismos comensales (por ejemplo, Streptococcus y Rothia spp.)^3,40,41. Además, se pueden añadir patógenos adicionales a estos modelos para crear biopelículas asociadas a otras enfermedades. Por ejemplo, se pueden añadir tres microorganismos a las 7 especies descritas aquí para crear un modelo de enfermedad asociada a la periodontitis³, mientras que el patógeno fúngico Candida albicans puede añadirse para aumentar la polimicrobialidad, así como añadir una capa de complejidad interreino³³. De hecho, la promoción de las interacciones entre hongos y bacterias puede tener enormes implicaciones en varios resultados experimentales que utilizan estos modelos de biopelículas in vitro en comparación con las biopelículas solo bacterianas⁴². En última instancia, se recomienda encarecidamente que se tenga muy en cuenta la creación de un nuevo modelo de biopelícula multiespecie para este tipo de estudios. Si bien los microorganismos incluidos deben ser fácilmente identificables a partir de búsquedas bibliográficas extensas, para la mayoría de los nichos y/o enfermedades, es posible que estos no se integren bien en un modelo complejo in vitro por diferentes razones. A continuación se describen algunas otras posibles consideraciones que deben tenerse en cuenta:

Dinámica de formación de biopelículas
La formación de biopelículas in vivo a menudo implica una colonización temprana, intermedia y tardía por microorganismos particulares. La formación de placa dental supra y subgingival se caracteriza en gran medida por la adhesión inicial de la película salival que se encuentra en el esmalte por especies pioneras (por ejemplo, especies de Streptococcus ), con patógenos intermedios y posteriores que las requieren como andamiaje para la colonización⁴³. Un fenómeno similar se ha propuesto en el ambiente vaginal durante la vaginosis bacteriana, donde se cree que Gardnerella vaginalis es el colonizador inicial, seguido por los anaerobios posteriores⁴⁴. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este puede no ser el caso de otras enfermedades en otros nichos ecológicos.

Densidad de siembra para cada microorganismo
Los microorganismos tendrán diferentes tamaños y/o dinámicas de crecimiento cuando se cultiven in vitro; Por lo tanto, es importante tener esto en cuenta durante el proceso de estandarización. Por ejemplo, C. albicans es de 100 a 150 veces el tamaño de las células bacterianas^45,46, por lo tanto, puede justificar la adición a una concentración más baja, por ejemplo, 1 x 10⁶ células/mL, a dichos modelos de biopelícula.

Antagonismo de las especies
Algunos microorganismos (incluyendo la misma especie pero diferentes aislados, cepas de laboratorio y/o clínicas) utilizados para estos modelos pueden competir con otros durante la formación de biopelículas, lo que lleva a la inhibición del crecimiento de algunas especies microbianas⁴⁷. Un estudio de Sadiq et al. puso de manifiesto cómo diferentes combinaciones de microorganismos pueden influir en la biomasa de biofilm resultante de la sinergia (o antagonismo) ^microbiana48. Aunque la investigación de tales interacciones dentro de un modelo de biopelícula puede ser de interés para los grupos de investigación (por ejemplo, probar el tratamiento prebiótico o probiótico), otros pueden no tener en cuenta dicho antagonismo, lo que podría afectar la complejidad de múltiples especies al crear el modelo.

Duración de la maduración del biofilm
Es fundamental optimizar los plazos de maduración de la biopelícula, ya que esto puede depender de la dinámica de crecimiento de los microorganismos incluidos y del sistema modelo (incluidos los sustratos) utilizado para el cultivo. Los tiempos de maduración más largos podrían resultar en una mejor colonización para patógenos tardíos, pero más muerte celular dentro de los modelos, particularmente de los colonizadores más tempranos. Por el contrario, los tiempos de incubación más cortos podrían ser importantes si se desea investigar los efectos de modelos de biopelícula inmaduros en el huésped. Un estudio de Brown et al. describió cómo el mismo modelo de biopelícula de herida de 10 especies tenía diferentes perfiles inflamatorios en células THP-1 humanas cuando maduraban durante 24 h, 48 h y 72 h, lo que sugiere que cuanto menos madura es la biopelícula, más proinflamatoria es⁷. Se pudieron observar resultados similares en modelos de tejido multicapa. También es importante tener en cuenta que los cambios diarios regulares de medios son necesarios para minimizar la muerte celular en la biopelícula, aunque esto puede modificarse dependiendo de los regímenes de tratamiento en curso, por ejemplo, si se evalúan los efectos de intervenciones antimicrobianas prolongadas.

Para la sección "manipulación de tejidos organotípicos, configuración experimental y procesamiento de tejidos", los plazos de incubación se pueden ajustar de acuerdo con las necesidades del investigador. Las interacciones huésped-patógeno pueden investigarse en puntos de tiempo más tempranos, por ejemplo, de 1 a 12 h, hasta puntos de tiempo posteriores de 48 h y 72 h, dependiendo de la pregunta de investigación. En segundo lugar, se suministran todos los medios de mantenimiento que contienen antibióticos; Por lo tanto, es necesario solicitar a la empresa que realice el pedido que los elimine en función del diseño experimental. Aunque el medio debajo del inserto no entra en contacto directo con la periferia superior del tejido, a menos que se inflija una herida en el modelo ^6,8, la eliminación de antibióticos puede merecer consideración si se investiga la invasión microbiana en el tejido.

El material microbiano utilizado para la estimulación del cocultivo también se puede cambiar, como se ha comentado anteriormente, con el objetivo de evaluar el planctónico, los sobrenadantes de biopelícula gastados (filtrados y sin filtrar), las biopelículas completas o las incubaciones de biopelículas sonicas con el tejido. Por ejemplo, la evidencia previa ha demostrado que los modelos de tejido como los proporcionados por EpiSkin proporcionan modelos útiles para investigar las interacciones planctónicas entre hongos y huéspedes: se ha demostrado que las células de C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur y Trichophyton rubrum se adhieren e interactúan con capas de tejido periférico en HOE, epidermis humana reconstruida (RHE) o epitelio vaginal humano, y algunos de estos estudios muestran la estimulación de la respuesta del huésped después de una infección fúngica 1,5,6,11,12,49. Existen publicaciones similares para las interacciones bacteriano-huésped, por ejemplo, la formación de biopelículas de Cutibacterium acnes, un patógeno común asociado con la microbiota del cuero cabelludo en la caspa, se ha estudiado en la superficie de RHE, cuando se cultiva solo y con el organismo fúngico de la piel, Malassezia restricta¹⁰. Otros han investigado la capacidad de Staphylococcus spp. para adherirse a la RHE, midiendo las características fisicoquímicas y microbiológicas de esta interacción bacteriano-huésped⁵⁰. N'Diaye y los coautores exploraron cómo el neuropéptido derivado de humanos, el péptido relacionado con el gen de la calcitonina, influyó en la virulencia del Staphylococcus aureus en el modelo de tejido RHE⁵¹. Otros han investigado los efectos protectores de las intervenciones probióticas en la infección por Pseudomonas aeruginosa del epitelio corneal^{humano 14}. Mientras tanto, desde una perspectiva polimicrobiana, diferentes grupos han estudiado los efectos de las biopelículas de especies mixtas sobre diferentes sustratos tisulares 2,3,7,13.

En general, estos protocolos y estudios a los que se hace referencia anteriormente documentan la amplia gama de aplicaciones de los modelos de tejidos organotípicos para investigar las interacciones entre el huésped y el patógeno. Aunque los estudios han demostrado que los modelos EpiSkin, en particular el modelo de piel RHE, tienen una buena aplicabilidad para probar productos cosméticos para la corrosión/irritación 52,53,54,55, existen algunas limitaciones entre estos y los explantes de tejido ex vivo del mundo real u otros proveedores de tejido disponible comercialmente^56,57. Una limitación obvia sería que todos los modelos de tejido disponibles comercialmente se generan a partir de líneas celulares en un entorno estéril y "libre de gérmenes", lo que significa que el tejido nunca ha estado expuesto a perturbaciones microbianas: esto puede exacerbar cualquier respuesta inflamatoria en el huésped, mucho más allá de lo que se vería in vivo o después de la estimulación de explantes de tejido ex vivo ⁵⁷. Por el contrario, estos sistemas modelo de laboratorio no contendrán capas conectivas subyacentes o vasculatura que uno asociaría con tejido in vivo, características que pueden preservarse durante la explantación de tejido ex vivo y características que afectan las respuestas inflamatorias. De hecho, una revisión sistemática reciente puso de manifiesto que se debe considerar cuidadosamente la utilización de modelos de tejidos con una vasculatura adecuada creados utilizando diversas tecnologías de ingeniería, incluidos los biomateriales⁵⁸. Por ejemplo, un estudio reciente utilizó una matriz a base de fibrina incrustada con fibroblastos gingivales y células endoteliales microvasculares para crear un equivalente de tejido gingival vascularizado. Los autores describieron una respuesta inflamatoria diferencial en el modelo tras la exposición a microorganismos asociados a la salud o a la enfermedad⁵⁹. Desde un punto de vista comercial, ahora existen modelos más complejos, como el "modelo T-Skin", que contiene un tejido de espesor completo que consiste en una dermis compuesta por fibroblastos superpuestos con la epidermis. Sería interesante ver cómo se comparan estos modelos complejos con los sistemas de solo epidermis.

Si bien ningún modelo es perfecto, los modelos de tejidos organotípicos representan alternativas prometedoras para las pruebas preclínicas, alineándose con el marco descrito por las tres R, para Reemplazo, Reducción y Refinamiento en la realización de investigaciones con animales. Con este fin, aunque los modelos animales proporcionan información importante sobre la compleja naturaleza fisiopatológica de las enfermedades humanas relacionadas con el biofilm, tienen desventajas obvias. Estos modelos 3D son fácilmente manipulables, lo que permite cambios grandes y sutiles en las investigaciones sin aprobación ética. La combinación de estos modelos con los complejos sistemas de biopelículas existentes descritos anteriormente puede mejorar en gran medida nuestra comprensión de las interacciones huésped-patógeno y predecir mejor el éxito de las nuevas terapias antes de las investigaciones in vivo .

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Discos de hidroxiapatita (HA) de 13 mm	Plasma Biotal Limited	n/a (hecho bajo pedido)	Sustrato para la formación de biopelículas orales, que imita la superficie del diente
Aguja de 19 G (40 mm)	VWR	613-2028	Se utiliza para ayudar a retirar los discos de HA de las placas y para cortar el tejido de los insertos
24 placas de microtitulación de fondo plano bien tratadas con TC y tapas	Suministros de laboratorio científico	3524 (paquete de 100)	Placas para el cultivo de biopelículas y experimentos de cocultivo de tejidos
Perlas de vidrio lavadas con ácido (425-600 μ m)	Merck: Sigma-Aldrich	G8772	Para la lisis de tejidos para mejorar el rendimiento de la extracción de ARN
Actinomyces naeslundii DSM 17233	Instituto Leibniz DSMZ	n/a	Uno de los microorganismos utilizados para el modelo de biopelícula compleja
Bead Mill 24 Homogeneizador (o equivalente)	Fisher Scientific	15-340-163	Para la lisis de tejidos para mejorar el rendimiento de la extracción de ARN
Bisutería  (7 ml)	Greiner Bio-One	189170 (700 por bolsa)	Utilizado para la sonicación de biopelículas
Kit de síntesis de ADNc (alta capacidad)	Thermo Fisher Scientific	4368814 (para 200 reacciones)	Síntesis de ADNc a partir de la base de ARN tisular
Columbia Blood Agar (CBA)	Thermo Fisher Scientific CM0331B	(para 500 gramos)	Se utiliza para preparar placas de CBA para el cultivo de microorganismos aeróbicos Sangre
caballo desfibrinada	E& O Laboratorios	DHB	Se utiliza para complementar las placas de CBA y FAA para el cultivo de microorganismos aeróbicos y anaeróbicos
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (dPBS: sin CaCl2 y MgCl2)	Merck: Sigma-Aldrich	DB537	dPBS para cocultivo celular con biofilm sonicato
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953	American Type Culture Collection	n/a	Uno de los microorganismos utilizados para el modelo de biopelícula compleja
Fusobacterium nucleatum subespecie (subspp.) vincentii DSM 19507	Instituto Leibniz DSMZ	n/a	Uno de los microorganismos utilizados para el modelo de biopelícula complejo
GraphPad Prism (Versión 10)	GraphPad Software, Inc	n/a	Para la creación de gráficos y análisis de datos
Kit ELISA IL-8 humano (kit ELISA sin recubrimiento con placas)	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	88-8086-86 (para pruebas de 10 x 96)	Kit y placas ELISA para la evaluación de proteínas de medios tisulares gastados
Epitelio oral humano (HOE)	Episkin	n/a (hecho por encargo)	El tejido epitelial utilizado para el sistema modelo de cocultivo
Asas de inoculación (desechables, 10 y micro; L, o equivalente)	Fisher Scientific 12870155	(paquete de 1000)	Para el cultivo microbiológico en medios sólidos y líquidos
placas qPCR MicroAmp Fast Reaction de 96 pocillos (0,1 ml)	Thermo Fisher Scientific 4346907	(para 10 placas)	Para la expresión génica de qPCR Perfiles de tejido
Microbank Beads	Pro-Lab Diagnostics	PL.170	Almacenamiento y ciropreservación de microorganismos
Agua sin nucleasas	Thermo Fisher Scientific	AM9935 (10 x 1,5 mL)	Agua de grado RT-PCR para experimentos de qPCR
Placas de Petri (90 mm)	Fisher Scientific (Sterilin)	11309283 (paquete de 500)	Se utiliza para la preparación de placas de agar para el cultivo microbiano
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014 (paquete de 100 comprimidos)	PBS para la estandarización de microorganismos y los pasos de lavado de biofilm
Rneasy mini kit	Qiagen	74106 (para 250 reacciones)	Kit de extracción de ARN en columna para tejidos
Roswell Park Memorial Institute 1640 medio	Merck: Sigma-Aldrich	R7755-10L (para 10 L)	Medios para el cultivo de biopelículas
Matriz de perfiladores RT2	Qiagen	330171 (a medida)	Matriz de qPCR que contiene cebadores listos para usar para la elaboración de perfiles de expresión génica
Base de agar anaerobio Schaedler	Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)	91019 (para 500 g)	Se utiliza para preparar placas de agar anaeróbico Fastdious
Caldo anaerobio Schaedler	Thermo Fisher Scientific	CM0497B (para 500 g)	Medios líquidos para el crecimiento de microorganismos anaeróbicos
Tubo de junta tórica Beadbug con tapón de rosca	Suministros de laboratorio científico	Z763837-1000EA (paquete de 1000)	Para uso en el homogeneizador Bead Mill 24, para lisar tejidos
Baño de sonicación	Fisher Scientific (Fisherbrand)	n/a	Para la sonicación de biopelículas a partir de discos de AH
Streptococcus intermedius DSM 20753	Instituto Leibniz DSMZ	n/a	Uno de los microorganismos utilizados para el modelo de biopelícula compleja
Streptococcus mitis NCTC 12261	Colección Nacional de Cultivos Tipo	n/a	Uno de los microorganismos utilizados para el modelo de biopelícula compleja
Streptococcus oralis NTCC 11427	Colección Nacional de Cultivos Tipo	n/a	Uno de los microorganismos utilizados para el modelo de biopelícula compleja
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)	PCR Biosystems	PB20.12	SYBR-green mix para qPCR
Caldo Todd Hewitt	Merck: Sigma-Aldrich	T1438	Medios para el cultivo de biopelículas
Caldo de soja triptona (TSB) medio	Merck: Sigma-Aldrich	22092 (para 500 g)	Medio líquido para el crecimiento de microorganismos aeróbicos
Pinzas (150 mm, Acero inoxidable, Dentado)	RS-Pro	545-187	Se utiliza para mover discos de HA e insertos de tejido/extractos de tejido
Tubos universales  (30 mL)	Greiner Bio-One	201150 (400 por bolsa)	Recipientes para el cultivo de microorganismos en cultivo líquido
Veillonella dispar NCTC 11831	Colección Nacional de Cultivos Tipo	n/a'Uno	de los microorganismos utilizados para el modelo de biopelícula compleja
β-metacapthoethanol	Merck: Sigma-Aldrich	M3148	Desactivación de RNasa en muestras de tejido