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Artículo de método

Preparación de neutrófilos derivados de la médula ósea murina

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DOI:

10.3791/67490

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3 de enero de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Innovation Center, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, 2Beijing Key Laboratory for Therapeutic Cancer Vaccines

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para la preparación de una biblioteca ATAC-seq de neutrófilos de médula ósea murina, con el objetivo de garantizar una viabilidad óptima de los neutrófilos y una alta calidad de la biblioteca. Ofrece instrucciones paso a paso sobre la preparación de BMC, la clasificación inmunomagnética y la construcción de bibliotecas, lo que sirve como una guía valiosa, especialmente para los recién llegados al estudio de los neutrófilos.

Resumen

El ensayo de cromatina accesible a la transposasa con secuenciación (ATAC-seq) es una técnica potente y de alto rendimiento para evaluar la accesibilidad de la cromatina y comprender la regulación epigenómica. Los neutrófilos, como un tipo de leucocitos crucial en las respuestas inmunitarias, experimentan cambios sustanciales en la arquitectura de la cromatina durante la diferenciación y activación, lo que afecta significativamente la expresión génica necesaria para sus funciones. ATAC-seq ha sido fundamental para descubrir factores de transcripción clave en la maduración de neutrófilos, revelar firmas epigenómicas específicas de patógenos e identificar objetivos terapéuticos para enfermedades autoinmunes. Sin embargo, la sensibilidad de los neutrófilos al medio externo complica la producción de datos de alta calidad ATAC-seq. Aquí, proponemos un protocolo escalable para preparar bibliotecas ATAC-seq a partir de neutrófilos derivados de médula ósea de roedores, con una separación inmunomagnética mejorada para garantizar una viabilidad celular óptima y bibliotecas de alta calidad. Se discuten en detalle los elementos vitales que influyen en la calidad de la biblioteca y los principios de optimización para la extensión metodológica. Este protocolo apoyará a los investigadores que estén dispuestos a estudiar la arquitectura de la cromatina y la reprogramación epigenómica de los neutrófilos, avanzando en los estudios de inmunología básica y clínica.

Introducción

Los neutrófilos son uno de los tipos de células inmunitarias más abundantes y cruciales en los vertebrados, constituyendo entre el 50% y el 70%de los leucocitos humanos. Los neutrófilos desempeñan un papel central en la detección y eliminación de microorganismos en los huéspedes. Durante la sepsis, los neutrófilos maduros se encuentran entre los primeros respondedores2. Se movilizan rápidamente a los sitios de infección a través de la quimiotaxis3, donde combaten los patógenos mediante la ingesta de microorganismos (fagocitosis), la producción de especies reactivas de oxígeno dependientes de la NADPH oxidasa (ráfagas respiratorias), la secreción de gránulos (degranulación) y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) que atrapan y matan a las bacterias extracelulares una vez que llegan al sitio de la inflamación4. Los neutrófilos inmaduros también son movilizados rápidamente desde la médula ósea a la circulación periférica por quimiocinas 5,6. Estos neutrófilos atraídos por el sitio infeccioso también liberan citocinas, que están involucradas en varios procesos fisiológicos, como la hematopoyesis, la angiogénesis y la cicatrización de heridas 7,8. Los pacientes con enfermedades congénitas o adquiridas que resultan en una disminución de los recuentos de neutrófilos son más susceptibles a las infecciones 9,10. Sin embargo, la activación de los neutrófilos es un arma de doble filo. La activación excesiva y la liberación de citocinas pueden causar daño a tejidos y órganos, lo que lleva a una disfunción orgánica múltiple si las infecciones no se controlan rápidamente11,12. Además, los neutrófilos también contribuyen a diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunes y pueden influir en la progresión del cáncer y la metástasis13,14. Esto subraya la necesidad de estudiar la regulación de la actividad de los neutrófilos para equilibrar la respuesta inmunitaria eficaz y prevenir el daño al huésped.

En los neutrófilos, la arquitectura de la cromatina experimenta cambios distintos y dinámicos en su diferenciación, migración y activación, ejerciendo funciones reguladoras fundamentales a lo largo de la vida celular. Este viaje, desde el núcleo grande, redondo y rico en eucromatina de los mieloblastos a un núcleo más dentado en los mielocitos y metamielocitos, y luego a una célula en forma de C o S en banda y altamente lobulada con cromatina densamente empaquetada en neutrófilos polimorfonucleares15,16, es un testimonio de la complejidad de la biología de los neutrófilos. La configuración especializada de la cromatina asegura la expresión selectiva de genes esenciales para la función de los neutrófilos, como los implicados en la producción de gránulos y las rápidas respuestas transcripcionales necesarias para la eliminación efectiva de patógenos17. Cuando los neutrófilos son movilizados a sitios inflamatorios a través de la quimiotaxis, la migración transendotelial ejerce presión sobre el complejo enlazador del complejo nucleoesqueleto/citoesqueleto (LINC), lo que provoca la remodelación de la cromatina y un mayor potencial de activación18. En la sepsis, los neutrófilos activados exhiben un "desplazamiento nuclear a la izquierda", con una morfología anormal de la cromatina, como núcleos bilobulados o no lobulados y unacondensación de cromatina significativamente más laxa. Esto da como resultado una mayor accesibilidad dentro de las regiones génicas asociadas con la respuesta inflamatoria, induciendo así una expresión significativa de estos genes. Si las infecciones no están debidamente controladas, es necesaria la citrulinación de histonas y la posterior deconstrucción de la cromatina para formar NETs20,21. Por lo tanto, comprender la arquitectura de la cromatina de los neutrófilos es crucial para avanzar en la biología de los neutrófilos y desarrollar tratamientos para enfermedades inflamatorias y autoinmunes, lo que ofrece esperanzas para el tratamiento de futuras enfermedades.

La accesibilidad de la cromatina sirve como métrica para la arquitectura de la cromatina a nivel epigenómico. Indica cómo las regiones genómicas son físicamente permisibles para los potenciadores, promotores, aislantes y factores de unión a la cromatina y cómo estos elementos influyen en la expresión génica22. El ensayo de cromatina accesible transposasa con secuenciación (ATAC-seq) es una técnica ampliamente utilizada para evaluar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma23. No requiere conocimientos previos de elementos reguladores, lo que lo convierte en una potente herramienta para la investigación epigenética. Este método implica el aislamiento de núcleos de muestras, la fragmentación del ADN genómico mediante la transposasa Tn5 y la adición de cebadores de secuenciación para la preparación de bibliotecas, la secuenciación y el análisis de datos23. ATAC-seq ha sido fundamental en el estudio del mapeo de nucleosomas, el análisis de unión a factores de transcripción, los mecanismos reguladores en varios tipos de células o enfermedades, la identificación de nuevos potenciadores, el descubrimiento de biomarcadores, etc.22,23. A menudo se combina con otras técnicas, como la secuenciación de ARN, para un análisis exhaustivo de la expresión génica.

ATAC-seq ha avanzado en nuestro conocimiento de la biología de los neutrófilos al descubrir mecanismos epigenéticos precisos en la salud y la enfermedad. Ha revelado varios factores de transcripción clave (es decir, RUNX1, KLF6, PU.1, etc.) en la maduración de los neutrófilos y las respuestas efectoras24,25, ha descubierto firmas específicas de patógenos con potencial de biomarcadores en la sepsis26, ha dilucidado los mecanismos epigenómicos de la memoria inmunitaria innata12 y ha identificado dianas terapéuticas en la leucemia mieloide aguda (LMA) pediátrica27. Sin embargo, como componente celular prominente en la vigilancia inmunitaria, los neutrófilos exhiben una alta sensibilidad a su medio externo y, por lo tanto, plantean un desafío para producir datos de alta calidad ATAC-seq. En circunstancias fisiológicas, la vida media de los neutrófilos humanos es de 3,8 días, mientras que la vida media de los neutrófilos de ratón es de 12,5 h. Cabe destacar que su vida media es considerablemente más corta cuando se estudia in vitro28,29. Durante el funcionamiento in vitro de neutrófilos aislados, la exposición a microorganismos o patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), así como los procedimientos experimentales redundantes y las operaciones duras, pueden dar lugar a una activación aberrante de los neutrófilos y a una disminución de la viabilidad celular debido a la apoptosis o la NETosis. Las células fallecidas comúnmente albergan cantidades significativas de ADN no cromatoinizado altamente susceptible a Tn5, lo que eleva el ruido de fondo de ATAC-seq23.

Aquí, proponemos un protocolo escalable para preparar bibliotecas ATAC-seq optimizadas para neutrófilos derivados de muestras de médula ósea de roedores. En la Figura 1 se presenta una descripción gráfica del protocolo, que abarca la separación inmunomagnética de los neutrófilos de la médula ósea, seguida de la secuenciación ATAC. La clasificación inmunomagnética mejorada garantiza la viabilidad óptima de los neutrófilos antes de extraer el núcleo para la biblioteca ATAC-seq, asegurando así la alta calidad de las bibliotecas y facilitando la incorporación de evaluaciones adicionales de neutrófilos en el esquema. La implementación de este protocolo ayudará a los investigadores a comprender las características de la arquitectura de la cromatina y los mecanismos de reprogramación epigenómica de los neutrófilos cuando se exponen a diversos desafíos microambientales. Se espera que esto tenga amplias aplicaciones en estudios de inmunología básica y clínica.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales que se presentan a continuación cumplieron con las pautas y regulaciones nacionales de ética y bienestar animal, que fueron aprobadas por el Comité de Ética de Investigación en Cuidado Animal de la Universidad Médica de la Capital, Beijing, China (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Preparación de suspensiones de células de médula ósea (BMC)

  1. Selección de ratones machos C57BL/6J de 6-8 semanas de edad con un peso de 19-21 g. Eutanasia a los ratones utilizando una cámara de CO2 , seguida de una luxación cervical después de que el reflejo profundo haya desaparecido. Desinfectarlos con etanol en spray al 70% sobre un tapete de disección.
  2. Use tijeras y fórceps pequeñas para separar cuidadosamente el fémur de la articulación de la cadera y la tibia, retire la piel adherida y el músculo esquelético, y enjuague el fémur con solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri de 10 cm.
  3. Corte las epífisis del fémur, inserte suavemente una aguja de 28 g conectada a una jeringa de 2 ml en la cavidad de la médula ósea y enjuague la médula ósea con PBS frío que contenga un 2% de suero fetal bovino (FBS).
  4. Repita el paso anterior hasta que el líquido rojo oscuro enjuagado se vuelva translúcido. Por lo general, se requieren tres descargas.
    NOTA: Evite insertar la aguja demasiado profundamente en la cavidad de la médula ósea para asegurar una adquisición óptima de las células.
  5. Utilice un filtro de células de 70 μm para filtrar la suspensión celular en un tubo de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (5 mL).
  6. Lisar los eritrocitos en BMC con un tampón comercial de lisis de eritrocitos sin poliformaldehído.
    1. Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 min a 25 °C, retirar con cuidado el sobrenadante, dejando aproximadamente 100 μL de líquido en el fondo, y golpear suavemente el tubo para aflojar el pellet.
    2. Añadir 2 mL de tampón de lisis, diluido a partir de tampón de lisis de eritrocitos (10x), y mezclar dando la vuelta al tubo tres veces. A continuación, centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula mediante un suave golpecito.
    3. Lave las células dos veces con el medio RPMI 1640 que contiene un 10% de FBS y vuelva a suspenderlas en un volumen de 2 ml.
      NOTA: Cuando se trata de grupos de células no dispersas, se recomienda utilizar una punta de pipeta de 200 μL para seleccionarlas en lugar de filtrar las suspensiones celulares a través de un filtro de células de 70 μm. Este método puede reducir la pérdida de células.
  7. Calcular la viabilidad celular y el número total de células vivas por muestra con tinción con azul de tripano.

2. Marcaje inmunomagnético de neutrófilos con perlas magnéticas anti-Ly6G

  1. Resuspender las células de la médula ósea (~2 x 10,7 células vivas por ratón) en 2 mL de medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 25 °C.
    NOTA: Dado el requisito limitado de 1 x 105 células para ATAC-seq, los neutrófilos sobrantes se pueden asignar para análisis epigenómicos adicionales (por ejemplo, ChIP-seq y Hi-C) o evaluaciones de la función inmunitaria (por ejemplo, producción de citocinas, fagocitosis y NET) utilizando neutrófilos obtenidos del mismo ratón.
  2. Aspire la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente 100 μL, y golpee suavemente el tubo para aflojar el pellet.
  3. Añadir 30 μL de perlas de Ly6G y mezclar con las BMC dando golpecitos suaves.
    NOTA: Las cuentas magnéticas deben ser vertiginosas durante un mínimo de 10 segundos antes de su uso. Después de la adición de las perlas a las BMC, se recomienda abstenerse de vórtices.
  4. Incubar el tubo a 25 °C durante 15 min.
  5. Añadir 2 mL de PBS para resuspender las perlas y las células, luego centrifugar a 500 x g durante 5 min a 25 °C.
  6. Aspire la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente 100 μL, y golpee suavemente el tubo para aflojar el pellet. Agregue PBS adicional para un volumen final de 1 mL.
    NOTA: Cuando se trata de grupos de células no dispersas, se recomienda utilizar una punta de pipeta de 200 μL para seleccionarlas en lugar de filtrar las suspensiones celulares a través de un filtro de células de 70 μm. Este método puede reducir la pérdida de células.

3. Separación de neutrófilos con clasificación celular inmunomagnética

  1. Trate previamente la columna MS con PBS.
    1. Coloque la columna MS dentro del campo magnético de un separador de clasificación de células activado magnéticamente (MACS) compatible. Coloque un tubo de 5 mL desocupado debajo del fluido que descarga de la columna MS.
    2. Enjuague la columna con 500 μL de PBS. Repita este paso después del flujo completo de PBS en la columna MS.
      NOTA: Se debe permitir que el PBS fluya gradualmente, gota a gota, hacia el tubo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de 5 mL a través de la columna de MS. Asegúrese de que no entre aire en la columna, ya que las burbujas de aire pueden obstruir la columna.
  2. Aplique la suspensión BMC etiquetada magnéticamente a la columna MS agregando 500 μL a la vez, rellenando inmediatamente una vez que el depósito de la columna esté vacío.
    NOTA: Asegúrese de que las suspensiones celulares estén desprovistas de masa celular. Si es necesario, coloque un nuevo tubo FACS de 5 mL debajo de la columna de EM para recolectar las células no marcadas (por ejemplo, monocitos y linfocitos) antes de esta etapa.
    NOTA: Tome nota del caudal de las gotas. Un caudal lento podría sugerir que la columna de clasificación está obstruida.
  3. Lave la columna de MS añadiendo 500 μL de PBS cada vez que el depósito esté vacío, repitiendo este proceso dos veces.
    NOTA: La adición prematura de PBS puede impedir la entrada de ciertas celdas en la columna de clasificación, lo que podría comprometer la pureza de la clasificación de celdas.
  4. Recoja los neutrófilos marcados magnéticamente.
    1. Una vez que se agote el depósito de la columna, retire la columna del campo magnético y colóquela con cuidado en un tubo de 5 ml.
      NOTA: Antes de retirar la columna, asegúrese de que no haya líquido residual en su interior para evitar la pérdida de neutrófilos debido a la descarga de gotas durante el proceso. El residuo de la columna se puede eliminar con una pipeta.
    2. Dispense 2 mL de PBS en la columna, luego empuje inmediata y firmemente el émbolo en la columna para expulsar los neutrófilos marcados magnéticamente.
      NOTA: Para adquirir suficientes neutrófilos, asegúrese de obtener un volumen de elución adecuado y manténgase corto al empujar el émbolo hacia la columna.
  5. Use un hemocitómetro para enumerar las células aisladas. Identificar la pureza de los neutrófilos aislados tomando 100 μL de la suspensión celular post-clasificación y analizándola con citometría de flujo.

4. Extracción del núcleo

  1. Centrifugar las 50.000 suspensiones unicelulares que contienen los neutrófilos a 500 x g durante 5 min a 4 °C en un tubo de 0,2 mL y, a continuación, desechar el sobrenadante.
  2. Vuelva a suspender los neutrófilos en 50 μL de tampón de lisis preenfriado (consulte la Tabla 1), mezcle suavemente la solución con una pipeta e incube en hielo durante 10 minutos.
    NOTA: Si el volumen de la muestra es inferior a 5 μL, se permite agregar directamente el tampón de lisis. La concentración de suspensión celular no excede de 1 x 107 células/mL.
  3. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C, luego desechar el sobrenadante y recoger el núcleo. Coloque el tubo sobre hielo antes de comenzar los procedimientos posteriores.
    NOTA: Para minimizar la pérdida de muestra, denote el lado de la pared del tubo donde se acumulan los gránulos y aspire suavemente el líquido desde el lado opuesto al eliminar el sobrenadante.

5. Marcación anclada a nucleosomas con transposasa

  1. Prepare la mezcla de reacción de etiquetado que contiene transposasa Tn5 en un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de acuerdo con las pautas del kit de preparación de la biblioteca de ADN (consulte la Tabla 2) y precaliente las perlas de purificación de amplicón refrigeradas a 25 °C durante al menos 30 minutos.
  2. Vuelva a suspender el núcleo del neutrófilo con 50 μL de mezcla de reacción de marcación y agite suavemente con una pipeta, seguido de una centrifugación durante 5 segundos con una centrífuga manual (~2600 x g).
  3. Incubar el tubo de reacción en un instrumento de PCR a 37 °C durante 30 min.
  4. Añada 100 μL de perlas de purificación de amplicón pre-vórtice al lisado, luego mezcle bien las perlas magnéticas en la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
    NOTA: Las perlas magnéticas son pegajosas y se pueden adherir fácilmente a las puntas de las pipetas, por lo tanto, asegúrese de aspirar el volumen correcto y dispensarlas lentamente de las puntas al transferir las perlas.
  5. Incubar el tubo de reacción a 25 °C durante 5 min, luego centrifugarlo durante 5 s con una centrífuga manual (~2600 × g).
  6. Purifique el fragmento de ADN interrumpido colocando el tubo de reacción en una rejilla magnética hasta que la solución se vuelva clara (aproximadamente 5 min). Luego, retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas magnéticas.
  7. Lave el cordón magnético con 200 μL de etanol al 80% recién preparado cada vez, mientras mantiene el tubo de reacción en la rejilla magnética durante 30 s. Evite alterar las perlas al agregar etanol. Repita el procedimiento descrito en el paso 5.7.
  8. Centrifugar el tubo de reacción con una centrífuga manual (aproximadamente 2600 × g), aspirar el etanol con puntas de pipeta de 10 μL y, a continuación, secar las perlas magnéticas durante 3-5 minutos mientras se abre la tapa.
    NOTA: La duración del secado de las perlas magnéticas puede variar en las diferentes regiones debido a las variaciones en los niveles de humedad. Las cuentas deben secarse hasta que pierdan su brillo. El secado excesivo puede complicar el proceso de elución, mientras que un secado inadecuado puede dar lugar a la presencia de residuos de alcohol, lo que afecta a los experimentos posteriores. Además, la colocación horizontal de la rejilla magnética es más propicia para el secado uniforme de las perlas magnéticas.
  9. Después de retirar el tubo de reacción de la rejilla magnética, agregue 26 μL de ddH2O para cubrir las perlas magnéticas, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para garantizar una mezcla completa. A continuación, incubar a 25 °C durante 2 min.
    NOTA: Amplíe la duración de la incubación adecuadamente si las perlas magnéticas se han secado demasiado.
  10. Centrifugar brevemente el tubo de reacción con una centrífuga manual (aproximadamente 2600 × g) y separar las perlas magnéticas con una rejilla magnética hasta que la solución se aclare (aproximadamente 5 min).
  11. Transfiera con cuidado el sobrenadante de 24 μL al nuevo tubo de PCR.

6. Construcción de bibliotecas para secuenciación de próxima generación (NGS)

  1. Prepare la mezcla de reacción de PCR en un tubo esterilizado utilizando fragmentos de ADN purificado y cebadores que contengan adaptadores de secuenciación (consulte la Tabla 3).
  2. Llevar a cabo la reacción de PCR siguiendo los procedimientos recomendados (consultar la Tabla 4), que suele requerir aproximadamente 1 h.
    NOTA: El experimento puede detenerse temporalmente después de este procedimiento, y los productos de PCR pueden almacenarse a -20 °C o al menos 2 semanas.
  3. Agregue 27,5 μL de perlas de purificación de amplicón pre-vórtice a 50 μL de productos de PCR, luego mezcle bien las perlas magnéticas en la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
    NOTA: La proporción incorrecta de perlas magnéticas con respecto a los productos de PCR puede dar lugar a discrepancias en las longitudes de los fragmentos clasificados. Utilice ddH2O para llenar el volumen evaporado del producto PCR a 50 μL. Asegúrese de aspirar el volumen correcto de perlas magnéticas y dispensarlas lentamente desde las puntas de la pipeta para minimizar las perlas que puedan estar adheridas.
  4. Incubar el tubo de reacción a 25 °C durante 5 min, luego centrifugarlo durante 5 s con una centrífuga manual (aproximadamente 2600 x g).
  5. Purifique el ADN de la biblioteca colocando el tubo de reacción en una rejilla magnética hasta que la solución se vuelva clara (aproximadamente 5 min). Luego, transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de PCR esterilizado y deseche las perlas magnéticas.
  6. Añada 50 μl de perlas de purificación de amplicones pre-vórtice al sobrenadante, luego mezcle bien las perlas magnéticas en la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
  7. Incubar el tubo de reacción a 25 °C durante 5 min, luego centrifugarlo durante 5 s con una centrífuga manual (aproximadamente 2600 x g).
  8. Coloque el tubo de reacción en una rejilla magnética hasta que la solución se aclare (aproximadamente 5 min), luego retire con cuidado el sobrenadante sin alterar las perlas magnéticas.
  9. Lave la perla magnética dos veces con 200 μL de etanol al 80% recién preparado cada vez, manteniendo el tubo de reacción en la rejilla magnética durante 30 segundos. Evite alterar las perlas al agregar etanol.
  10. Seque las perlas magnéticas durante 5 minutos mientras abre la tapa.
  11. Después de retirar el tubo de reacción de la rejilla magnética, agregue 22 μL de ddH2O para cubrir las perlas magnéticas, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces para garantizar una mezcla completa. A continuación, incubar a 25 °C durante 5 min.
  12. Centrifugar brevemente el tubo de reacción con una centrífuga manual (aproximadamente 2600 × g) y separar las perlas magnéticas con una rejilla magnética hasta que la solución se aclare (aproximadamente 5 min).
  13. Transfiera con cuidado el sobrenadante de 20 μL a un nuevo tubo de PCR esterilizado y guárdelo a -20 °C.
    NOTA: Para lograr una biblioteca con una distribución de longitud más concentrada, considere utilizar un kit de recuperación de gel para clasificar el producto amplificado. Alternativamente, si no hay requisitos específicos para el rango de distribución de longitud, el producto amplificado se puede purificar directamente utilizando un kit de purificación de perlas magnéticas o columnas sin clasificación de longitud.

7. Control de calidad y secuenciación de la biblioteca

  1. Utilice plataformas de análisis de fragmentos de ADN para evaluar la distribución de longitud del ADN de la biblioteca.
  2. Utilice plataformas NGS para realizar secuenciaciones de alto rendimiento en las bibliotecas que han pasado la inspección de calidad.

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Resultados

El protocolo descrito se empleó para aislar neutrófilos de la médula ósea de ratones C57BL/6 y comparar su respectiva varianza en la accesibilidad a la cromatina antes y después de la estimulación con lipopolisacáridos (LPS) mediante ATAC-seq. Por lo general, se pueden recolectar 2 x 107 BMC de ambos fémures de un ratón C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad y, posteriormente, se pueden aislar 2 x 106 neutrófilos. Entre ellas, se emplean 1 x 105 células para la secuenciación ATAC, mientras que ...

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Discusión

Este manuscrito reporta un protocolo experimental para la preparación de librerías ATAC-seq optimizadas para neutrófilos derivados de muestras de médula ósea de roedores. Debido a que los neutrófilos son células inmunitarias altamente susceptibles y fácilmente activas, los esfuerzos de optimización priorizaron el mantenimiento de la viabilidad de los neutrófilos aislados. El tratamiento inadecuado puede conducir a la NETosis y otras formas de muerte celular, lo que provoca la liberación ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación y Desarrollo de la Comisión Municipal de Educación de Beijing (KZ202010025041) y los Institutos Chinos de Investigación Médica, Beijing (Subvención No. CX24PY29).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.4% Trypan BlueScientificT10282
1x solución salina tamponada con fosfatoBiosharpBL302A
20 bp– Marcador de alineación de 5000 bpBiopticC109102-100AAnalizador de fragmentos de ADN productos de soporte
5k Marcador de tamaño (escalera estándar de 50 bp)BiopticC109101-100AAnalizador de fragmentos de ADN productos de soporte
Amplicons Perlas de purificaciónBeckmanA63881Amplicons Purification Beads es un kit de purificación de ácidos nucleicos para obtener productos de ADN de alta calidad.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, ratónmiltenyi130-120-337Los MicroBeads Anti-Ly-6G UltraPure, ratón fueron desarrollados para la selección positiva o el agotamiento de neutrófilos de ratón a partir de suspensiones unicelulares de médula ósea de ratón.
Anti-ratón CD11b-BV605 (1:200)BDCat#563015
Anti-ratón CD48-PE-Cy7 (1:400)BDCat#560731
Anti-ratón Ly6G-BV510 (1:200)BDCat#740157
C57BL/6J ratones, tipo salvaje, 8 semanas de edad, machoInstituto de Ciencia de Animales de Laboratorio, Academia China de Ciencias MédicasInstituto de Ciencia de Animales de Laboratorio, Academia China de Medicina Ciencias
separación de ADNBiopticC104406analizador de fragmentos de ADN productos de soporte
LPS ultrapuro derivado de E. coli (serotype0111: B4)Sigma-AldrichCat#L-2630
DNA Quantitative ReagentvazymeEQ111DNA Quantitative Reagentt es un kit de ensayo cuantitativo de fluorescencia de ADN bicatenario (dsDNA) simple, sensible y preciso.
Tampón de lisis eritrocitaria (10x)BioLegendCat#420301
Suero fetal bovinoGibcoCat#10099141C
MS Columnas de separaciónmiltenyi130-042-201Las columnas MS están diseñadas para la selección positiva de células.
RPMI 1640 medianoGibcoC11875500BT
S2 Aguja de electroforesis en gel Analizador de fragmentos de ADNbiópticoC105101
Instrumentos quirúrgicos: bisturí, tijeras de disección, tijeras de microdisección, pinzas finas, pinzas anatómicas romas, soporte para agujasFisher Scientifichttps://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools Se puede comprar a otros proveedores calificados
Jeringa (1  mL)Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464Se puede comprar a otros proveedores calificados
TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 para IlluminavazymeTD501-01TruePrep DNA Library Prep Kit V2 para Illumina es un kit especialmente diseñado específicamente para la plataforma de secuenciación de alto rendimiento de Illumina. Con el kit, el ADN se puede preparar en bibliotecas de secuenciación dedicadas a la plataforma de secuenciación de alto rendimiento de Illumina.
TruePrepTM Index Kit V2 para IlluminavazymeTD202TruePrep Index Kit V2 para Illumina es un kit para el TruePrep DNA Library Prep Kit V2 para Illumina. Se puede utilizar para preparar 96 bibliotecas de índices de doble extremo diferentes.
Tampón de productos de soporte

Referencias

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