Evaluación de la deposición de hierro en el cerebro de ratones 5xFAD mediante tinción de Perls/DAB

Resumen

Este protocolo presenta métodos para evaluar la distribución y cantidad de deposición de hierro en los tejidos, especialmente en el cerebro. El protocolo detalla los procedimientos para la preparación de muestras, la tinción de Perls/DAB, la captura de imágenes y el análisis de datos.

Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA), una enfermedad neurodegenerativa común, es la principal causa de demencia en las personas mayores. La deposición de hierro está estrechamente relacionada con la patogénesis de la EA. En el cerebro de la EA, los niveles elevados de hierro están fuertemente correlacionados con las patologías características de la EA, incluidas las placas β-amiloides, los ovillos neurofibrilares tau y la apoptosis. Cada vez hay más pruebas que sugieren que el estrés oxidativo, debido a la desregulación del metabolismo del hierro, desempeña un papel importante en la fisiopatología de la EA. Por lo tanto, comprender el papel de la acumulación de hierro en la patología de la EA es fundamental para el tratamiento de la EA. Un protocolo completo de tinción de hierro es esencial para detectar la expresión y distribución del hierro en el cerebro. Este protocolo tiene como objetivo describir un método para evaluar la cantidad y distribución de la deposición de hierro en el cerebro. Describimos los procesos involucrados en la preparación de reactivos, el tratamiento con ratones y la preparación de secciones cerebrales. Además, presentamos un protocolo detallado paso a paso para la detección histoquímica de hierro en secciones de tejido cerebral, acompañado de un marco analítico sistemático que integra tanto la evaluación cuantitativa como la evaluación morfológica para garantizar una interpretación completa de los resultados de la tinción. Este protocolo experimental ayudará a los investigadores a comprender las deposiciones de hierro en el cerebro y respaldar la investigación de la EA.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la enfermedad neurodegenerativa más común y se ha convertido en un grave problema para la sociedad. La prevalencia de la EA aumenta drásticamente con la edad 1,2,3,4. Las principales características patológicas de la enfermedad de Alzheimer (EA) incluyen la deposición de placas de β-amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares (NFT) debido a la fosforilación aberrante de las proteínas tau. Aβ se genera a través de la escisión secuencial de la proteína precursora de amiloide (APP) por las enzimas β-secretasa y γ-secretasa. La desregulación en la producción o eliminación de Aβ conduce a su acumulación en el cerebro, formando placas amiloides, que se reconocen como uno de los marcadores patológicos más tempranos de la EA. Estas placas no solo causan daño neuronal directo, sino que también inician una cascada de efectos perjudiciales, como la neuroinflamación, el estrés oxidativo y la disfunción sináptica. En conjunto, estos procesos contribuyen a la muerte neuronal y al deterioro cognitivo progresivo observado en la EA⁵. A pesar de décadas de investigación dirigida principalmente a las características patológicas de la enfermedad de Alzheimer (EA), incluida la deposición de placa de β amiloide y la agregación de proteína tau hiperfosforilada, los avances terapéuticos clínicamente significativos siguen siendo difíciles de alcanzar, y las intervenciones existentes demuestran una eficacia limitada para modificar la progresión de la enfermedad⁶.

El hierro es un metal importante para mantener la función cerebral y está involucrado en el transporte de oxígeno, la síntesis de ADN, la respiración mitocondrial, la síntesis de mielina, la síntesis de neurotransmisores y el metabolismo. Sin embargo, el hierro se vuelve dañino cuando las concentraciones exceden la capacidad de secuestro celular ^6,7,8. Se ha observado un aumento de la deposición de hierro, generalmente colocalizada con placas Aβ, tanto en las regiones cortical como en el hipocampo del cerebro en pacientes con EA ^9,10. A través de la reacción de Fenton¹¹, el hierro libre intracelular puede generar radicales hidroxilo (-OH), así como especies reactivas de oxígeno. Estas sustancias nocivas no solo inducen neuroinflamación al activar las células gliales, sino que también atacan las biomoléculas de la célula a través del estrés oxidativo, interrumpiendo la función celular normal y provocando disfunción sináptica ^8,12. Además, el aumento del hierro está directamente implicado en el desarrollo de signos patológicos de la EA: el hierro contribuye a la producción de Aβ¹² y también aumenta la disfunción de la proteína tau, lo que conduce a ovillos neurofibrilares¹³.

Se han desarrollado varias técnicas para evaluar el contenido de hierro en el cerebro, incluyendo la resonancia magnética (RM), así como métodos químicos e histoquímicos¹⁴. La cuantificación in vivo de los niveles de hierro intracerebral mediante resonancia magnética es clínicamente importante para los pacientes con envejecimiento y neurodegeneración¹⁵. La resonancia magnética tiene la ventaja de ser no invasiva y muy sensible: puede detectar la deposición de hierro en las primeras etapas de la enfermedad. En particular, la técnica de aumento de R2 dependiente del campo (FDRI) puede distinguir entre diferentes formas de hierro, como el hierro ferritina y el hierro hemo¹⁶. Sin embargo, la resonancia magnética no puede detectar la acumulación de hierro a nivel celular y es costosa, por lo que se utiliza principalmente en investigaciones clínicas¹⁷.

La medición colorimétrica es un método químico que determina la concentración de una sustancia (como el hierro) midiendo la intensidad del color producido por la reacción de la sustancia en solución con un agente cromogénico¹⁸. Este método es fácil de realizar y utiliza reactivos e instrumentación de bajo costo, lo que lo hace adecuado para laboratorios con presupuestos limitados¹⁸. Sin embargo, la precisión y la sensibilidad de este método son muy limitadas, ya que los resultados están sujetos a la influencia de factores ambientales, el tiempo de desarrollo del color y el juicio subjetivo del operador. La espectrometría de absorción atómica de llama (FAAS) es otro método que se puede utilizar para evaluar los niveles de hierro¹⁹. En este método, se obtiene una solución de muestra clarificada quemando el tejido de interés en un horno de alta temperatura. A continuación, la muestra se disuelve utilizando ácido clorhídrico y la concentración de hierro en la solución se determina mediante espectrometría de absorción atómica. Este método es altamente sensible y adecuado para todo tipo de muestras biológicas¹⁹. Sin embargo, el proceso lleva mucho tiempo y requiere equipos costosos, por lo que su uso es limitado.

La tinción de Perls/DAB para detectar hierro férrico no hemo es el método de detección de hierro más utilizado debido a su alta especificidad y facilidad de implementación en comparación con otros métodos histoquímicos¹⁴. A diferencia del análisis colorimétrico, la tinción de Perls es un método de tinción histoquímica cualitativa que se basa en la reacción entre los iones de hierro y el ferrocianuro de potasio para generar un precipitado azul. Se utiliza para visualizar microscópicamente la presencia y distribución de hierro en los tejidos. Además, este método nos permite distinguir la deposición de hierro en diferentes tipos de células y observar la distribución subcelular de la deposición de hierro, proporcionando un método para el estudio de la AD²⁰. La tinción de Perls detecta principalmente el hierro férrico no hemo y depende de la formación del complejo azul de Prusia:

(Azul de Prusia)

Sin embargo, la tinción tradicional de Perls es ineficaz para detectar la localización del hierro a niveles bajos de hierro. Cuando se añade diaminobenzidina (DAB), reacciona con el hexacianoferrato férrico para formar un compuesto marrón, aumentando la especificidad del ensayo²¹.

El objetivo de este protocolo es describir cómo evaluar la cantidad y distribución de la deposición de hierro en el cerebro de un modelo de ratón con EA. En este protocolo, se utilizaron ratones transgénicos 5×FAD (C57BL/6J) de 8 meses de edad como modelo de ratón AD y se compararon con ratones de tipo salvaje de la misma edad. Aquí se presentan los detalles de los procedimientos para preparar el reactivo químico, seccionar el cerebro, realizar la tinción de Perls/DAB y analizar las imágenes tomadas después de la tinción.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Xuzhou y las regulaciones gubernamentales chinas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Perfusión de animales

1. Prepare el fijador: Disuelva el paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 1× (consulte la Tabla 1).
2. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (15 mg/kg). Una vez que el ratón esté anestesiado, fíjelo a la bandeja de cirugía de perfusión con cuatro clavos para asegurar las extremidades.
   PRECAUCIÓN: Para garantizar una anestesia adecuada, verifique la pérdida de respuestas al pellizco de los dedos de los pies, la relajación de los músculos de las extremidades y la respiración profunda, lenta y constante.
3. Corta el pecho con unas tijeras para exponer el corazón y corta la aurícula derecha. Inyecte 20 ml de PBS 1× en el ventrículo izquierdo con una jeringa para enjuagar la sangre. A continuación, inyecte 20 ml de PFA al 4% para la fijación.
   NOTA: Controle la profundidad y la dirección de la aguja para evitar perforar el tabique interventricular. Recuerde que una perfusión óptima presenta un hígado pálido y extremidades rígidas después del temblor inicial.
4. Decapita al ratón perfundido, corta el hueso alrededor del cráneo con unas tijeras finas, levanta el cráneo con cuidado con pinzas romas y extrae el cerebro. A continuación, remoje el cerebro en PFA al 4% a 4 °C durante la noche.
   PRECAUCIÓN: Tenga cuidado con el 4% de PFA, que es un fuerte irritante respiratorio. Use una mascarilla adecuada y realice este paso con una campana extractora.
   NOTA: El método de eutanasia fue aprobado por IACUC de la Universidad Médica de Xuzhou Programa de Cuidado y Uso de Animales Pautas de Eutanasia: Ratones / Ratas.

2. Criosección cerebral

1. Deshidratar el cerebro con soluciones graduadas de sacarosa (15% y 30%) a 4 °C durante 24 h para cada paso. El cerebro finalmente debe hundirse hasta el fondo de la solución de sacarosa.
2. Hemisectar el cerebro a lo largo de la fisura interhemisférica con un bisturí. Coloque la mitad izquierda en un tubo de microcentrífuga de 5 mL lleno con 1 mL de solución de sacarosa al 30% y un volumen igual de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) para mejorar el contacto entre la OCT y el cerebro.
3. Recorte el tejido extraño del hemisferio izquierdo con una cuchilla de afeitar y muévalo a la plataforma OCT.
4. Incruste el tejido en OCT con el soporte de una pared circular hecha de papel de aluminio.
5. Congele el tejido en un micrótomo de criostato a -22 °C durante al menos 1 h y ajuste la temperatura del cabezal de corte a -19 °C.
   NOTA: Recuerde preenfriar el vidrio estabilizador y los cepillos en el criostato junto con la muestra.
6. Monta el bloque de tejido congelado. Recorte el bloque de tejido nuevamente a una posición apropiada según el área de interés y luego comience a seccionar el cerebro en secciones sagitales de 20 μm de grosor.
   NOTA: Si las secciones se pliegan, use pinceles suaves para desplegar las secciones.
7. Recoja cada sección en los portaobjetos recubiertos de gelatina y unte una gota de 1× PBS sobre ella. Dale la vuelta a la sección del cerebro con un pincel fino y luego monta rápidamente la sección en la guía.
8. Seque las secciones recogidas a temperatura ambiente durante la noche y guárdelas a -20 °C.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí hasta por 2 semanas. Un tiempo de almacenamiento más largo puede interferir con la calidad del tejido y, por lo tanto, influir en el resultado del experimento.

3. Tinción de Perls/DAB

1. Prepare las siguientes soluciones: ferrocianuro de potasio al 2% (K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O), ácido clorhídrico (HCI) al 2% y solución de DAB al 20× (ver Tabla 1).
2. Coloque un portaobjetos que contenga secciones en un frasco de tinción lleno de 1× PBS y coloque el frasco en un agitador orbital durante 5 minutos para lavar la OCT del tejido.
   NOTA: Ajuste cuidadosamente la velocidad del agitador orbital (velocidad recomendada: 20 rpm) para evitar que el tejido se caiga del portaobjetos a altas velocidades.
3. Mezcle 20 mL de solución de ferrocianuro de potasio al 2% y un volumen igual de ácido clorhídrico al 2% en un tubo de centrífuga de 50 mL.
4. Utilice pinzas de plástico para transferir el portaobjetos al tubo de 50 ml y luego caliente el tubo en un baño de agua a 60 °C durante 30 minutos.
5. Enjuague el portaobjetos con 1× PBS y seque el exceso de solución con papel de seda.
6. Utilice una pipeta para añadir 50 μL de solución de DAB a cada sección del cerebro e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Aspire el exceso de solución DAB con una pipeta y luego lave el portaobjetos 3 veces en PBS.
8. Deshidratar las secciones con soluciones de alcohol graduadas (50%, 70%, 95%, 100%) y xileno (100%, 100%). Incuba los portaobjetos durante 3 minutos cada uno.
9. Selle las secciones con goma neutra²² y luego coloque el cubreobjetos.
10. Seque los portaobjetos en una campana extractora durante 24 horas antes de guardarlos en una caja de portaobjetos de microscopio.

4. Imágenes

1. Encienda el microscopio, ajuste el brillo de la fuente de luz y concéntrese en la sección del cerebro con un objetivo de aumento de 4×.
2. Capture la imagen con el software de control de la cámara y ajuste la configuración de los parámetros para evitar la sobreexposición. Los ajustes específicos (10×, 40× objetivo) se muestran en la Figura 1.
   NOTA: Evite utilizar el balance de blancos automático para garantizar el mismo tiempo de exposición para cada imagen.
3. Cambie a un objetivo de aumento de 10×, mueva la platina del microscopio para centrarse en las áreas con altas señales de tinción de Perls/DAB, especialmente el hipocampo y la corteza cerebral, y capture imágenes (Figura 1A).
4. Cambie a un objetivo de aumento de 40x para capturar imágenes con señales de tinción claras.
5. Guarde cada imagen como un TIFF de 8 bits y exporte las imágenes para su posterior análisis.

5. Análisis de imágenes

1. En ImageJ/Fiji, seleccione Complementos > costura > Costura de cuadrícula/colección en el menú y, a continuación, seleccione Posición desconocida para elegir las imágenes que se van a unir (Figura 2A).
2. Elija Archivo > Guardar como > Tiff para guardar la imagen terminada como TIFF (Figura 2B).
3. Utilice ImageJ/Fiji para abrir una imagen y asegurarse de que el formato de la imagen sea en color RGB (Figura 2C).
4. Seleccione Plugins > IHC Profiler Image en el menú y, a continuación, elija Mode > Cytoplasmic Stained Image y el valor predeterminado de Deconvolución de color H DAB (Figura 2D). A continuación, convierta el formato de imagen a escala de grises de 8 bits.
5. Convierta los valores de gris de la imagen en valores OD seleccionando Analizar > Calibrar > OD sin calibrar (Figura 2E).
6. Utilice la función Umbral para seleccionar el área de tinción positiva de Perls/DAB, luego ajuste las barras de desplazamiento horizontales hasta que todos los puntos de señal marrones estén cubiertos de rojo (Figura 2F).
7. Haga clic en Analizar > Establecer mediciones, luego seleccione las opciones Área, Valor medio de gris, Densidad integrada y, lo que es más importante, Limitar al umbral para excluir el ruido de fondo (Figura 2G).
8. Seleccione Analizar > medir para obtener la tabla de resultados (Figura 2H).
9. Agrupe los resultados y utilice software estadístico para realizar análisis estadísticos. En nuestro caso, comparamos la acumulación de hierro en el hipocampo y la corteza de ratones transgénicos 5xFAD con la del control negativo (ratones de tipo salvaje). Para las comparaciones de tres grupos, se utilizó el análisis de varianza de un factor (ANOVA) para los datos de la distribución gaussiana con la misma desviación estándar.

Resultados

Para investigar la distribución y acumulación de hierro en un modelo de ratón de EA, realizamos la tinción de Perls/DAB en cortes sagitales de ratones 5xFAD de 8 meses de edad. Como se muestra en la Figura 3, se observaron señales de tinción de Perls/DAB en ratones 5xFAD y de tipo salvaje de 8 meses de edad y en ratones de tipo salvaje de 2 meses de edad. En ratones 5xFAD, se observaron señales de tinción de Perls/DAB altas en el hipocampo y la corteza, especialmente en el subículo del hipoc...

Discusión

La deposición de hierro está estrechamente asociada con la enfermedad de Alzheimer. Por un lado, puede conducir a la producción de Aβ a través de múltiples mecanismos, incluido el aumento de la expresión de la proteína precursora amiloide{NOTA:20}²³, y también una mayor actividad de la γ-secretasa, que puede conducir a una producción acelerada de Aβ²⁴; Por otro lado, la peroxidación lipídica inducida por el aumento del hierro puede promover...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.1 M PBS	biosharp	BL601A	Agregue agua desionizada para hacer la solución
4% PFA	Beyotime	P0099	Restaurar a 4 & grados; C para el uso
de la solución 20X DAB	Bioss	C-0003	Mix 10 μ l solución A, 10 μ l solución B y 180 μ l PBS
Alcohol	Supelco	107017
HCL	Sigma	7647-01-0	Agregue agua destilada a 50 ml
ketamina	China National Medicines	H20193336	100 mg/kg para anestesia
Microscopio	Olympus	CX43
Temperatura óptima de corte compuesto (OCT)	Sakura Finetek	4583
solución de ferrociniuro potásico	Sigma	14038-43-8	Añadir agua destilada a 50 ml
sacarosa	Sigma	57-50-1
xilacina& nbsp;	Y-S Biotechnology	YS-(BC)-2842	15 mg/kg para anestesiar
Xilenos	Sigma	1330-20-7

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