Dispositivo de estiramiento equibiaxial para microscopía de fluorescencia confocal de células vivas de gran aumento

Resumen

Aquí, presentamos un dispositivo de estiramiento equibiaxial versátil que se acciona neumáticamente y es compatible con la microscopía de alta resolución.

Resumen

Las celdas están continuamente expuestas a fuerzas mecánicas en situaciones fisiológicas y patológicas, incluyendo una variedad de tensiones de tracción y compresión. Hay investigaciones muy activas que exploran cómo las células y los tejidos responden y se adaptan a tales tensiones y cómo estas respuestas se integran con la señalización mecanoquímica. Esto ha generado la necesidad de herramientas sofisticadas compatibles con los protocolos estándar de cultivo celular y los métodos de microscopía, que reproducen las tensiones fisiológicas en los estudios in vitro. En este trabajo se presenta el diseño, función y caracterización de un dispositivo de estiramiento compatible con microscopía óptica y de fluorescencia de alta resolución. Se han desarrollado y utilizado en el campo numerosos dispositivos de estiramiento, ya sea neumáticos o motorizados. Presentamos uno de estos sistemas en detalle, incluidas las pautas de diseño, una variedad de aplicaciones y todas las herramientas para fabricar una configuración similar. El sistema se basa en una membrana deformable de polidimetilsiloxano (PDMS), estirada equibiaxialmente tras la aplicación al vacío, lo que proporciona una deformación de muestra homogénea, reproducible y controlada. Proporciona una variedad de tensiones de tracción, desde estiramientos puntuales e inmediatos hasta ciclos repetidos de estiramiento-liberación de amplitud y frecuencia controladas. El recubrimiento del sustrato con proteínas de adhesión permite sembrar células con reporteros fluorescentes en el dispositivo de estiramiento y realizar imágenes en vivo de estas células al estirarse utilizando microscopios de fluorescencia de alto aumento. Las tensiones de compresión también se pueden aplicar dejando que la muestra se adapte al estiramiento y posteriormente liberándola o sembrando la muestra en un sustrato preestirado antes de la liberación del estiramiento. El patrón topográfico adicional del sustrato PDMS permite obtener imágenes de la misma muestra en diferentes modos de microscopía (como fluorescencia y microscopía electrónica). Los geles de poliacrilamida también se pueden unir a la membrana de PDMS, lo que resulta en el estiramiento de las células sembradas en sustratos de diferentes rigideces. En general, al aplicar tensiones de tracción controladas en muestras vivas, este dispositivo de estiramiento, junto con la microscopía de fluorescencia de alta calidad, puede abordar una gran variedad de preguntas en mecanobiología.

Introducción

Las membranas delgadas y deformables de polidimetilsiloxano (PDMS) se usan ampliamente en una variedad de dispositivos de estiramiento hechos a medida ^1,2,3, ya que el PDMS es un material inerte biocompatible bien establecido con las imágenes de microscopía. Aquí, como muchos otros 4,5,6,7,8,9, se utiliza el simple concepto de aplicar un vacío para deformar la membrana y ensamblar un dispositivo de estiramiento equibiaxial robusto y controlable. Al sujetar la membrana dentro de un anillo circular y sellar el anillo en la parte superior de un "poste de estiramiento" (Figura 1A-C), se logra una deformación uniforme e isotrópica. La muestra biológica se encuentra en el centro del anillo en la membrana PDMS independiente, que permite obtener imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Aquí, se presentan dos configuraciones hechas a medida, compatibles con dos modelos de platinas de microscopio (Figura 1D-F) y altamente versátiles en términos de aplicaciones biológicas. Si bien el diseño general es simple y transponible a otras etapas, las dimensiones de la configuración deben elegirse cuidadosamente para adaptarse a los requisitos de imagen. Una vez conseguido, se debe caracterizar y validar el perfil de deformación del dispositivo.

Además de la configuración en sí, se presenta un método simple acompañado de un código Matlab para caracterizar la magnitud de la deformación, la homogeneidad y la isotropía. El dispositivo de estiramiento se puede utilizar posteriormente para aplicar tensiones de tracción equibiaxiales a los sistemas sintéticos¹⁰, células individuales^11,12 o monocapas¹³, mientras se registra con alta resolución espacio-temporal la respuesta biológica de la muestra mediante microscopía de fluorescencia. La membrana puede ser recubierta con diferentes proteínas de adhesión de la matriz extracelular^14,15. Se pueden agregar características adicionales de acuerdo con las necesidades del estudio biológico. Por ejemplo, los geles de poliacrilamida se pueden unir a la membrana de PDMS para ajustar la rigidez del sustrato mientras se estiran^13,16, y las membranas de PDMS se pueden fabricar con una cuadrícula numerada de referencia para obtener imágenes posteriores de la misma región de interés dentro de una muestra¹². Las muestras estiradas fijas también pueden procesarse mediante inmunotinción y posteriormente volver a estirarse para obtener imágenes de fluorescencia¹⁷. El patrón de estiramiento aplicado puede ser controlado, desde un solo pulso de estiramiento inmediato hasta una deformación cíclica de diferentes magnitudes, frecuencias o formas^14,16.

Protocolo

1. Diseño del escenario y del poste de estiramiento (Figura 1)

1. Diseñar un poste de estiramiento compatible en dimensiones con el tamaño del escenario/soportes y la configuración del objetivo. Los dos postes de estiramiento específicos se muestran en la Figura 1A, D.
   NOTA: Los archivos FreeCAD proporcionados en este protocolo (Carpeta Suplementaria 1) son compatibles con los siguientes microscopios y platinas Nikon: Eclipse Ni-E vertical equipado con una platina NI-SH-E, y Eclipse Ti-E/B invertido equipado con una platina TI-S-ER, Figura 1D. El poste se puede imprimir tridimensionalmente (3D), pero puede deformarse después de un uso repetido; Los postes a base de aluminio no sufrirán este inconveniente. Asegúrese de anodizar los postes a base de aluminio para evitar la oxidación. La configuración vertical permite una mayor amplitud de movimiento. Además, una configuración vertical proporciona una imagen directa de la muestra sin interfaz, lo que es ópticamente favorable en el caso del sustrato de membrana PDMS deformable. En cambio, en una configuración invertida, el haz de iluminación atraviesa la membrana PDMS (Figura 1F); dado que al estirar la membrana, la membrana de PDMS se moverá, los medios de inmersión para el objetivo deben elegirse cuidadosamente (tipos recomendados de inmersión en agua, aire o glicerol; no se recomienda la inmersión en aceite debido a la incompatibilidad con los sustratos de PDMS). Los soportes comerciales se pueden modificar utilizando orificios para tornillos adicionales; Tenga cuidado con el uso de tornillos de plástico o teflón para evitar el polvo al atornillar. Puede ser conveniente diseñar un soporte que permita colocar el poste de estiramiento en la parte superior de la plataforma, como se muestra en la Figura 1E. El archivo FreeCAD proporcionado en este protocolo es compatible con la platina de un microscopio vertical Eclipse Ni-E.
2. Anillos de estiramiento de diseño (Figura 1C) compatibles en tamaño con el poste de estiramiento (Figura 1A,B). Los archivos FreeCAD proporcionados en este protocolo son compatibles con los postes correspondientes (para cubrir los anillos mientras se manipulan muestras, se puede elegir su diámetro para que sea compatible con el tamaño de una placa de Petri).
   NOTA: El anillo también puede ser a base de aluminio (anodizado) o impreso en 3D. Incluya juntas de diámetros adecuados para sellar al vacío el poste de estiramiento y los anillos.
3. Opcional: Fabrica un controlador de vacío. En la información complementaria se proporciona un mapa eléctrico de la caja de control de vacío utilizada en este protocolo (consulte la Carpeta complementaria 2). Permite el control manual del nivel de vacío aplicado al dispositivo de estiramiento.
   NOTA: Los controladores de vacío comerciales también pueden proporcionar funciones similares y, por lo general, pueden ir acompañados de un software de control que permita la aplicación de una variedad de tipos de señales (sinusoidales, triangulares, etc.) (Fluigent, Cobalto).

2. Fabricación de la membrana elástica

1. Diseño de placas circulares (material recomendado: polimetacrilato, PMMA). Asegúrese de que estas placas sean más anchas que los anillos y compatibles en tamaño con el recubridor giratorio (Figura 2A). Consulte la Tabla 1 para conocer las dimensiones sugeridas y la Carpeta Suplementaria 3.
   NOTA: Para el poste 1 se utilizó un diámetro de 12 cm; para el poste 2, un diámetro de 18-21 cm. Antes y entre cada uso, las placas deben limpiarse cuidadosamente con toallitas no tejidas y etanol al 96%. Es importante evitar la acumulación de PDMS en las placas, así como en los bordes y por debajo.
2. Preparar PDMS 1:10 y mezclar bien para obtener una emulsión muy homogénea (utilizar las cucharas recomendadas para remover).
   NOTA: Para 12 cm, prepare 4,5 g por plato; Para platos de 18 cm, 8 g por plato. Para la preparación de varias placas, prepare PDMS adicionales, por ejemplo, 10 ml más de lo necesario para 10 placas. Para 10 platos de 12 cm, prepare 50 g del componente A y 5 g del componente B. Es útil utilizar receptáculos grandes para pipetear fácilmente. El receptáculo no debe contener polvo ni ninguna otra suciedad que pueda impedir el centrifugado y curado adecuados del PDMS. Utilice guantes de material compatible (evite el látex; los guantes de vinilo son apropiados) para garantizar el curado del PDMS.
3. Desgasificar durante un mínimo de 1 h utilizando una cámara de vacío.
   NOTA: Alternativamente, el PDMS se puede centrifugar a 0,2 × g durante 5 min utilizando un tubo de 50 mL, pero tenga en cuenta que es complicado aspirar la mezcla de PDMS desde un tubo con la jeringa dispensadora (necesario para el paso 2.4). No desgasifique durante demasiado tiempo (no más de 2 h) con luz directa para evitar el precurado de PDMS.
4. Recubrimiento de centrifugado de PDMS en la parte superior de las placas de PMMA
   1. Dispensar 4,2 mL o 7,5 mL de PDMS desgasificado encima de las placas de PMMA.
   2. Centrifugar las placas con los siguientes ajustes recomendados:
      1. Spin coat durante 5 s a 500 rpm con una aceleración de 100 rpm/s.
      2. Centrifugado durante 1 min a 500 rpm con una aceleración de 300 rpm/s.
         NOTA: Puede ser conveniente marcar el centro de la placa de PMMA en su parte inferior para asegurar el centrado de las placas durante el centrifugado y el centrifugado homogéneo. El paso 2.4.2.1 no es obligatorio, especialmente si el parámetro de aceleración no se puede ajustar; ayuda a esparcir el PDMS antes de girar. Este protocolo produce membranas de PDMS con un espesor de alrededor de 140 μm (medido con interferometría; ver Figura 1 y Tabla 2 suplementarias). Las calibraciones deben realizarse antes de los experimentos en caso de que el modelo o los parámetros del recubridor por rotación conduzcan a diferentes características de la membrana.
5. Guarde cada placa en una placa de Petri para evitar la acumulación de polvo y polimerice durante la noche a 65 °C dentro del horno.
   NOTA: Tenga cuidado con el uso de platos resistentes a la temperatura. La condición de curado afectará la deformabilidad del PDMS para un nivel de vacío determinado aplicado.

3. Intercalado de membranas en anillos

1. Diseño del material de montaje.
   1. Diseñe anillos de PMMA de diámetro interno/externo para colocar la membrana circular de PDMS recubierta de espín (Figura 2A). Véanse las dimensiones propuestas en la Tabla 1 y en la Carpeta Suplementaria 3.
   2. Diseñe un soporte de montaje (Figura 2B) sobre el cual encajará el anillo, y la altura también determinará el preestiramiento al montar la membrana en el anillo.
      NOTA: El soporte de montaje puede ser una solución simple basada en el material de laboratorio existente (por ejemplo, una placa de Petri). Una solución más elegante es imprimir en 3D el soporte (ver el archivo FreeCAD de esta parte proporcionado en este protocolo, ver Carpeta Suplementaria 3), ya que la altura puede ser definida por el usuario y fácilmente variable (en este protocolo se utilizó una altura de 10 mm para los anillos pequeños). La altura de la parte central del soporte debe elegirse más pequeña que la altura de la mitad del anillo para que el sustrato PDMS no toque el soporte durante el montaje (consulte el uso adicional en el paso 3.4.2). Una impresora 3D que utilice filamentos de ácido poliláctico (PLA) (ver Tabla de Materiales) es adecuada para esto. También se puede diseñar un anillo de corte, impreso en 3D, para que sirva de guía para el bisturí (Figura 2A).
   3. Diseñe y fabrique pesos de latón que sean compatibles en tamaño para ejercer peso sobre el anillo mientras se monta la membrana (Figura 2C) y que conduzcan a una pretensión reproducible.
      NOTA: Los archivos de FreeCAD proporcionados aquí (ver Carpeta Suplementaria 3) coinciden con las dimensiones del anillo presentadas en este protocolo.
2. Retire la membrana de PDMS de la placa de PMMA.
   1. Prepare los anillos de PMMA encima de una hoja de papel blanco.
      NOTA: Es importante que el banco y el papel permanezcan planos para evitar que el papel toque la membrana del PDMS durante el montaje.
   2. Recorra con cuidado el borde de la placa con una cuchilla (una o dos veces) y luego trace el mismo borde con pinzas afiladas para asegurarse de que el PDMS tenga un corte limpio a lo largo de toda su circunferencia (Figura 2A).
   3. Use pinzas para levantar con cuidado la membrana en un borde. A continuación, pegue suavemente el borde de la lámina de PDMS con los pulgares para levantar la membrana de manera uniforme en el borde. Separe el borde de la membrana de la placa a lo largo de la mitad de la circunferencia de la placa (Figura 2A).
      NOTA: Verter unas gotas de etanol al 96% por debajo de la membrana del PDMS ayudará a levantar la membrana sin romperla.
3. Seque la membrana PDMS.
   1. Limpie con etanol al 96% toda la superficie superior del anillo de PMMA previamente preparado (paso 3.2.1), utilizando los dedos para extenderlo uniformemente.
   2. Retire con cuidado la membrana de PDMS, levantándola desde el borde levantado previamente (explicado en el paso 3.2.3), y colóquela simétricamente sobre el anillo de PMMA cubierto de etanol. Elimine las arrugas del PDMS, pero asegúrese de no estirar la membrana; solo enderezarlo.
      NOTA: La aplicación de preestiramiento en esta etapa afectará la deformabilidad del PDMS para un nivel de vacío determinado aplicado.
   3. Una vez que el etanol esté completamente seco, asegúrese de que la membrana de PDMS esté firmemente adherida al anillo de PMMA.
4. Ensamble el anillo elástico.
   1. Tome otro anillo de PMMA vacío. Colóquelo en la parte superior del anillo de montaje y use clips de metal para sellarlos, intercalando la membrana de PDMS entre los dos anillos (sándwich de membrana de PDMS, Figura 2B).
   2. Coloque la mitad inferior del anillo elástico en el soporte de montaje diseñado en el paso 3.1.2 (Figura 2B).
   3. Coloque el sándwich de anillo PDMS en el anillo elástico y empújelo firmemente hacia abajo hasta que llegue completamente hacia abajo. El sustrato PDMS no toca el soporte de montaje. Asegure la junta en la posición correcta (Figura 2B).
   4. Coloque las pesas circulares de latón encima de la muestra (Figura 2C). Esto aplica una pretensión fija similar a la de todos los anillos montados, lo que garantiza una mayor reproducibilidad al calibrar el sistema.
   5. Coloque la mitad superior del anillo elástico de metal en la parte superior, con los orificios de los tornillos alineados, coloque todos los tornillos y apriételos (Figura 2C).
      NOTA: En esta etapa, la membrana PDMS tiene agujeros, por lo tanto, no intente desmontar o retroceder en el protocolo.
   6. Corte el PDMS alrededor del anillo suavemente con una cuchilla (Figura 2C).
   7. Cubra (por ejemplo, con una placa de Petri) para proteger la membrana del polvo (Figura 2C).
      NOTA: Si el PDMS necesita ser funcionalizado con un gel de poliacrilamida, proceda a la sección 5. Para las mediciones de calibración iniciales, continúe con la sección 6. Si el anillo PDMS se va a utilizar para la siembra de células, continúe con la sección 7.

4. Variación de la fabricación de membranas PDMS: patrón de una cuadrícula de referencia

1. Prepare una placa de PMMA (antes del recubrimiento por centrifugación de PDMS) "modelada" con una rejilla basada en SU8 creada mediante fotolitografía (Figura 2D). Para ello, diseñe un patrón de interés para crear una película de fotomáscara (máscara de acetato).
   NOTA: El archivo pdf proporcionado en este protocolo (ver Carpeta Suplementaria 4) crea una cuadrícula con números alternativos; véase la figura 2D. La cuadrícula se puede crear utilizando un software simple como Inkscape dado el tamaño del patrón (o alternativas como Clewin o FreeCAD). El diseño puede ser impreso por empresas externas en películas fotográficas (ver Tabla de Materiales).
2. Protocolo de fotolitografía en la placa de PMMA (consulte la carpeta complementaria 3 para conocer las propiedades ópticas del PMMA).
   1. Realice un tratamiento con plasma de oxígeno de las placas de PMMA durante 20 min a 7 W con un flujo de oxígeno constante de 0,8 bar.
      NOTA: Asegúrese de que se haya eliminado la posible protección de plástico de las placas y que las placas de PMMA sean completamente transparentes.
   2. Hornea durante 5 min a 95 °C.
   3. Enfríe la placa de PMMA con una pistola de nitrógeno y, a continuación, coloque 4 mL de resina SU-8 2100 sobre la placa de PMMA de 12 cm (ajuste el volumen si utiliza diferentes tamaños de placa).
   4. Centrifugado con los siguientes parámetros (o ajuste los parámetros de espín para crear una capa de aproximadamente 10 μm de altura): 5 s a 500 rpm con una aceleración de 100 rpm/s seguidos de 30 s a 4000 rpm con una aceleración de 300 rpm/s.
   5. Hornea durante 2,5 min a 95 °C.
   6. Coloque la placa de PMMA en un alineador de mascarillas en presencia de la mascarilla de acetato y utilice los siguientes parámetros: sin i-line. Exposición de banda ancha (entre 260 y 460 nm), 25 mW/^cm2, exposición de 7,5 s.
   7. Hornea durante 3,5 min a 95 °C.
   8. Desarrolle el patrón durante 1 minuto con acetato de éter monometílico de propilenglicol.
   9. Lavar abundantemente con isopropanol.
   10. Realice una verificación visual de la calidad del patrón utilizando un objetivo de bajo aumento (2-10x) en un microscopio de campo claro.
       NOTA: La silanización de la placa con patrón de PMMA aumenta la longevidad del patrón para uso repetido. Para ello, active la placa de PMMA estampada durante 30 s con tratamiento con plasma de oxígeno y luego realice un tratamiento de 1 h con tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silano al vacío en una campana química.
3. Utilice la placa de PMMA estampada como en los pasos 2.2 a 2.5 para recubrir la membrana elástica de PDMS.
   NOTA: El PDMS con patrón se puede visualizar en un microscopio de campo claro, como se mencionó anteriormente, así como en un microscopio electrónico de barrido (Figura 2D). Tenga cuidado con qué lado del patrón está hacia arriba mientras monta la membrana PDMS en el anillo de estiramiento para obtener el patrón en la orientación deseada.

5. Colocación de un gel de poliacrilamida (PAA) en la parte superior de la membrana de PDMS

NOTA: Este paso se puede realizar en la membrana de PDMS unida a la placa de PMMA (ver sección 2) o en los anillos de estiramiento previamente montados (ver sección 3). Trabajar bajo una cubierta química; para los pasos que involucran calentamiento, es conveniente usar un pequeño accesorio de horno debajo de la campana química, ver Tabla de Materiales; de lo contrario, guarde las muestras en una caja hermética en el horno).

1. Pre-recubrimiento de membrana PDMS (Figura 2E)
   1. Prepare la solución de recubrimiento mezclando etanol al 96% con trietoxisilano al 10% (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) en un tubo de microcentrífuga (por ejemplo, 20 μL de APTES en 180 μL de etanol).
   2. Active las membranas PDMS con un descargador de plasma corona durante 1 minuto (o actívelas durante 30 s con un limpiador de plasma de oxígeno).
   3. Coloque 200 μL de la solución APTES/etanol en el centro de la membrana.
   4. Dejar la membrana a 65 °C dentro del horno durante 1 h.
   5. Lavar dos veces con PBS. Para el segundo lavado, deje el PBS durante 10 minutos mientras agita.
   6. Prepare la solución de glutaraldehído (GA) al 3% en PBS. Colocar 200 μL de GA por membrana en la misma región de la membrana tratada con APTES.
   7. Espere 25 minutos (no más de 30 minutos).
   8. Lavar dos veces con PBS, la segunda vez mientras se agita.
   9. Aspire el líquido y coloque el anillo en una posición declinada, hasta que el PBS esté totalmente seco.
2. Silanización de cubreobjetos
   1. Prepare 6 mL de Repel Silane y viértalo en una placa de Petri.
   2. Coloque con cuidado los cubreobjetos cuadrados de vidrio de 18 mm, uno por uno, en el líquido.
   3. Incuba los cubreobjetos durante 5 min.
   4. Prepara dos vasos de precipitados; uno que contiene un 96% de etanol y el otro agua ultrapura.
   5. Retire el cubreobjetos del Repele el silano con pinzas y lávelo primero con etanol al 96%, seguido de un lavado con agua ultrapura (el cubreobjetos debe salir "seco" del lavado con agua).
   6. Deje secar durante 30 minutos más en el borde de una placa de Petri.
3. Fijación en gel de poliacrilamida (PAA) a la membrana de PDMS
   1. Coloque la mitad de los cubreobjetos tratados con silano Repeler en el fondo de una placa de Petri.
   2. Prepare una mezcla de gel de PAA de la rigidez deseada ^16,18.
   3. Coloque una gota de 10 μL de mezcla de gel encima de cada cubreobjetos.
   4. Coloque otro cubreobjetos tratado con Silane Reel encima para esparcir el gel. No alinee los dos cubreobjetos. Asegúrese de que estén dispuestos en forma de estrella para facilitar la separación. Presione suavemente para que el gel quede aplanado pero no exceda el área del cubreobjetos.
   5. Espere de 45 min a 1 h.
   6. Separe los cubreobjetos suavemente con unas pinzas. Asegúrese de que el gel permanezca adherido a uno de los cubreobjetos.
   7. Tome el cubreobjetos al que está adherido el gel y coloque el gel en contacto con el área de PDMS previamente tratada con GA (Figura 2E).
   8. Presione con dos dedos desde la parte inferior y superior durante 5 s.
   9. Incubar a 37 °C durante la noche.
   10. Al día siguiente, llena el anillo con PBS durante 30 minutos.
   11. Separe suavemente el cubreobjetos superior con unas pinzas.
   12. Dibuje el perímetro del gel de PAA con un marcador permanente desde el otro lado de la membrana del PDMS. Esto ayuda a localizar la muestra en los siguientes pasos.
   13. Aspire el PBS.
   14. Realice un paso de funcionalización para facilitar la unión de la proteína de la matriz extracelular deseada al gel¹⁵.

6. Operación del dispositivo de estiramiento, calibración de deformación y evaluación de la resolución

1. Prepare un anillo elástico PDMS con perlas fluorescentes para la calibración de la deformación.
   1. Prepare una dilución 1:50000 de perlas fluorescentes de 0,1 μm o 0,2 μm (ver Tabla de materiales) en solución salina tampón fosfato (PBS) por dilución en serie (solución intermedia 1:500 de 1 mL en PBS con 2 μL de la solución madre de perlas seguida de una dilución final de 10 μL de la solución intermedia en 1 mL de PBS).
      NOTA: Una alta densidad de cordón en la membrana es óptima para el paso de calibración; No sonique la solución, ya que los grumos de perlas ayudan a la operación durante la calibración.
   2. Coloque una gota de 10-30 μL en el centro del PDMS.
      NOTA: El soporte de montaje se puede diseñar convenientemente con una deposición de muestra cruzada al centro
   3. Dejar secar a no más de 40 °C para evitar confusiones posteriores al curado.
2. Prepare un anillo elástico PDMS con perlas fluorescentes para la evaluación de la resolución.
   1. Siga el protocolo de Cole y ^cols.19 para preparar la solución de perlas utilizando perlas con diámetros más pequeños que el límite de difracción, normalmente perlas de 0,1 μm de diámetro.
      (ver Tabla de Materiales). Sonicar cuidadosamente las soluciones de perlas en cada paso intermedio.
   2. Utilice el tratamiento corona en el centro del anillo para activar el sustrato PDMS.
   3. Extienda inmediatamente 20 μL de la solución de perlas sobre la zona central del PDMS tratada y déjela secar.
      NOTA: En este caso, la solución de perlas se diluye y se incuba en el PDMS hidrófilo para garantizar una amplia dispersión y obtener perlas individuales separadas de 0,1 μm adsorbidas en el sustrato.
3. Montaje del dispositivo de estiramiento en el soporte de la platina del microscopio (Figura 1F).
   1. Monte el poste de estiramiento en el microscopio.
   2. Aplique generosamente lubricante (vaselina) en la parte superior del área circular del poste (parte central, Figura 1D, F).
      NOTA: El uso del lubricante es obligatorio para que el sustrato PDMS supere las fricciones y se deslice sobre el poste, y es necesario refrescar el lubricante entre cada muestra. La vaselina se utiliza como un lubricante muy conveniente en la configuración presentada en este protocolo.
   3. Monte el anillo de estiramiento preparado en el paso 6.1 en el poste de estiramiento y atornille la tapa superior para sellar el conjunto.
   4. Conecte el controlador de vacío a la fuente de vacío y al poste de estiramiento (Figura 3A).
      1. Conecte la parte trasera de la caja de control de vacío a la fuente de vacío (Figura 3A).
      2. Conecte la parte delantera de la caja al poste de estiramiento (Figura 1B, D, F).
         NOTA: La fuente de vacío puede ser la línea de vacío disponible en la infraestructura del edificio. Se requiere un vacío moderado para un estiramiento suficiente, pero depende del diámetro del anillo de estiramiento (se obtendrá una deformación menor al mismo nivel de vacío para un diámetro más pequeño). Alternativamente, las bombas de vacío están disponibles comercialmente (Fluigent o Elveflow proporcionan bombas de vacío autónomas); En este caso, siga las instrucciones del fabricante para la conexión a la fuente de vacío. No utilice un suministro de vacío sin una fuente controlada por vacío (como la caja de control de vacío hecha a medida que se presenta en este protocolo o los sistemas disponibles comercialmente)
4. Calibración de deformaciones
   1. Elija un campo de interés que incluya una alta densidad de cuentas en todo el campo de visión y grupos de cuentas reconocibles para el usuario (consulte la Figura 3B).
   2. Adquiera una imagen "en reposo" del campo de visión elegido (guarde la posición).
   3. Aplique el estiramiento a un nivel de vacío bajo (en esta configuración, -20 mbar). La muestra se moverá en todas las direcciones (X-Y-Z).
   4. Vuelva a enfocar primero en el plano z.
   5. Mueva el escenario en direcciones x-y para encontrar la misma región de interés de la que se obtiene la imagen en reposo, enfoque con precisión la imagen de las cuentas en el estado estirado y adquiera una imagen.
      NOTA: Si la muestra está muy descentrada, la región de interés se moverá significativamente, dependiendo de la magnitud de la deformación. El desplazamiento será mayor lejos del centro, pero la magnitud de la deformación es independiente de la ubicación de la muestra en el sustrato. Graba imágenes sin agrupar, con una resolución de 2048x2048.
   6. Suelta la tensión. Repita los pasos 6.4.3-6.4.5 con un nivel de vacío más alto (-30 mbar, -40 mbar, etc.).
      NOTA: Para fines de calibración, siempre regrese al estado de reposo antes de volver a estirar (consulte la Figura complementaria 3A), ya que PDMS tiene un comportamiento de histéresis tras la deformación.
   7. Monte un segundo anillo de estiramiento y repita los pasos 6.4.1-6.4.6. Realice esta calibración para al menos 3 anillos de estiramiento diferentes.
   8. Almacene las imágenes adquiridas en una carpeta organizada por muestra.
   9. En cada carpeta, asigne un nombre a la imagen de la cuenta de referencia adquirida en reposo reference_str1 y las imágenes estiradas al stretched_str1 de vacío, stretched_str2, stretched_str3, etc. crecientes.
      NOTA: Este paso constituye la calibración central del sistema. Dependiendo de las necesidades del usuario, se debe realizar una calibración adicional utilizando muestras de cordones similares pero utilizando otros protocolos de aplicación de vacío. Aplique un protocolo de deformación similar a la cepa aplicada a la muestra biológica (consulte la sección de resultados representativos).
5. Utilice el código de Matlab para cuantificar la cepa²⁰.
   1. Descarga la carpeta completa de Matlab en el siguiente enlace https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      NOTA: El código principal que se va a ejecutar se denomina gel_strain y llama a otros archivos de código de Matlab que deben mantenerse tal y como se proporcionan, almacenados en la misma carpeta que el código principal.
   2. Abre Matlab y abre el código gel_strain.
   3. Establezca los parámetros (consulte la Tabla 3, Code_Parameter para conocer los ajustes recomendados).
   4. Defina las rutas de acceso de la carpeta principal y del experimento como se indica en el código.
      NOTA: Si la carpeta no existe, el código mostrará una ventana emergente de advertencia; Seleccione Agregar a la ruta y busque hasta la carpeta experimental donde se almacenan las imágenes.
   5. Ejecute el código gel_strain .
   6. Abra stretched_str1 según lo solicite el código.
   7. Abra reference_str1 según lo solicite el código.
      NOTA: Es conveniente procesar todas las imágenes estiradas a diferentes niveles de vacío a la vez como se indica en este protocolo; Todos los archivos deben almacenarse en la misma carpeta experimental, pero el código solo solicita abrir la primera imagen estirada. Los nombres de las imágenes deben terminar con nombres strX, siendo X los números incrementales 1, 2, 3, etc., como se indica en el punto 6.4.9 de este capítulo.
   8. Verifique que aparezca la carpeta de resultados con las 4 subcarpetas: Croppeddata que contiene los datos recortados y alineados; Desplazamientos que contienen el archivo de desplazamiento del cordón; Imágenes que contienen el gráfico de los desplazamientos radiales y la deformación; Deformaciones que contienen la hoja de cálculo de la matriz de deformaciones obtenida para cada nivel de vacío.
      1. Calcule la mediana de la matriz de deformación para cada nivel de vacío.
      2. Repita para cada muestra (3 como mínimo).
      3. Traza la matriz de deformación mediana frente al nivel de vacío de las 3 muestras para obtener la curva de calibración (Figura 3C).
         NOTA: Se pueden modificar algunos parámetros en caso de que la imagen del cordón no se procese correctamente a partir del código. Para ello, abra el archivo set_settings_stretch en Matlab y modifique Settings.Resolution y Settings.Overlap de acuerdo con las recomendaciones de los comentarios de código (consulte también la Tabla 3). Dependiendo de las necesidades experimentales, la deformación aplicada a la muestra biológica puede variar (deformación cíclica, deformación mayor, etc.): se recomienda una calibración de estas condiciones (Ver ejemplos en la Figura complementaria 2 y la Figura suplementaria 3).
6. Evaluación de la resolución (seguir el protocolo de Cole et ^al.19)
   1. Monte el anillo de estiramiento preparado en el paso 6.2.
   2. Imagine un campo de visión que contiene puntos de una sola cuenta (imagine una pila con una distancia de paso Z relevante para el objetivo utilizado).
   3. Utilice MetroloJ (complemento de Fiji), como se indica en Cole et al., para caracterizar la resolución X-Y-Z de la configuración de estiramiento (Figura 3D y Figura 4 complementaria).

7. Siembra y estiramiento de células

1. Recubrimiento del PDMS con proteína de adhesión celular
   1. Esterilice el anillo PDMS exponiéndolo a la luz ultravioleta durante 15 minutos (Figura 4A). Realice todos los pasos posteriores del protocolo bajo el biohood para garantizar la esterilidad.
   2. Enjuague la placa debajo de la cubierta con PBS estéril.
   3. Incubar una proteína de adhesión celular 11,14,15 depositando una gota de 100-200 μL de la solución en el centro del anillo (Figura 4A).
      NOTA: Comúnmente, una solución de 10 μg/mL de fibronectina es apropiada¹¹. Se pueden utilizar otras proteínas de adhesión de interés para recubrir el PDMS (p. ej., laminina, queratina¹⁵; es posible que se requieran tratamientos/protocolos específicos). Se recomienda la incubación del recubrimiento de fibronectina durante la noche a 4 °C; el método alternativo es 1 h a 37 °C.
   4. Dibuje el perímetro de la gota con un marcador permanente desde la parte inferior de la membrana PDMS. Esto ayuda a localizar la muestra en los pasos siguientes.
2. Siembra de células en el anillo PDMS (Figura 4A).
   1. Si es necesario, transfecte las células de interés con una proteína fluorescente antes del experimento de estiramiento (para transfecciones transitorias, de 1 a 3 días antes del experimento, según el método de transfección y las características) o utilice protocolos específicos para visualizar los marcadores fluorescentes de interés.
      NOTA: Para los experimentos iniciales, es conveniente utilizar un marcador de membrana plasmática como GFP-mem ^11,12 para visualizar la respuesta de la membrana celular y las posibles rupturas. El marcador es fácil de transfectar, y se aconseja estirar las células transfectadas a niveles de tensión crecientes para evaluar el umbral de tensión que conducirá a la ruptura de la membrana plasmática. Consulte el mapa de plásmidos en la carpeta complementaria 5. Esto depende del tipo de célula y será menor en los experimentos de una sola célula en comparación con las monocapas de células. Este marcador de membrana es compatible con el estiramiento celular, a diferencia de algunos colorantes de inserción de membrana que se observó que conducían a la ruptura de la membrana plasmática a niveles bajos de estiramiento.
   2. El día del experimento, caliente los medios celulares y prepare los medios independientes del CO₂.
      NOTA: Si el microscopio tiene un control de CO₂ compatible con el sistema de estiramiento, los experimentos se pueden realizar en medios de cultivo celular regulares (esta sería una configuración necesaria para muestras delicadas que no pueden sobrevivir en medios independientes de CO₂). Se recomienda la suplementación independiente de CO₂ con un agente antiblanqueador (por ejemplo, para proteínas GFP, suplemento de rutina²¹ a 10 mg/mL).
   3. Tripsinar las células y contarlas.
   4. Siembre un número apropiado de células en un volumen pequeño (20-50 μL) con medios celulares estándar para promover la adhesión celular y manténgalas en una incubadora con control de humedad y CO₂.
      NOTA: Para fibroblastos planos y grandes y experimentos unicelulares, 5000 células; Los números dependen del tipo de célula y del experimento en sí.
   5. Después de 20-30 minutos de incubación (verifique la unión inicial de las células), agregue suavemente 500 μL de medio encima de las células. Vuelva a colocarla en la incubadora para permitir una mayor propagación de las células.
      NOTA: El tiempo de siembra depende del tipo de célula y de los requisitos experimentales; También es posible la formación de una monocapa con incubación nocturna. El volumen de los medios de cultivo debe ajustarse en consecuencia. Tinción celular secundaria: una vez adheridas, las células se pueden teñir con un colorante como SpyDNA (ver Tabla de Materiales) para visualizar los núcleos (Figura suplementaria 5) u otra tinción para visualizar cualquier estructura de interés. Siempre hay que tener en cuenta que la tinción de células vivas o la sobreexpresión de proteínas por transfección pueden afectar a la respuesta celular al estiramiento, especialmente en la corteza celular, la membrana plasmática o las proteínas/estructuras mecanosensibles.
   6. Cámbielo a medios independientes de_CO2 y utilícelo inmediatamente en el dispositivo de estiramiento.
      NOTA: Ahora, la muestra está lista para un experimento de estiramiento.
3. Experimento de estiramiento celular: ejemplo de un solo ciclo de estiramiento-liberación e imágenes de la membrana plasmática (PM) para capturar la remodelación dinámica de PM de los fibroblastos.
   1. Monte el anillo de estiramiento en la platina del microscopio como en la sección 6, paso 6.2.
   2. Encuentre una celda de interés, registre su posición y tome una imagen de la celda preestirada (Figura 4B).
   3. Aplique el vacío deseado que, de acuerdo con la curva de calibración, coincida con la deformación de sustrato deseada.
   4. Para encontrar la celda estirada, primero, vuelva a enfocar en Z y luego muévase en la dirección X-Y para encontrar y centrar la celda de nuevo en el campo de visión.
   5. Grabe las imágenes durante la duración deseada (Figura 4B).
      NOTA: Por lo general, se necesitan experimentos iniciales para determinar la respuesta de la celda a la deformación por tracción dependiendo de su tipo (en promedio). Estire las celdas a diferentes deformaciones del sustrato para determinar la carga de extensibilidad máxima que pueden soportar. Se producirá la ruptura de la membrana plasmática, como se visualiza a través del marcador de membrana fluorescente de la membrana plasmática, si la tensión es excesiva para la célula.
   6. Para la liberación de células, vuelva a la posición de célula en reposo y active el modo de adquisición del microscopio para asegurarse de que la adquisición pueda comenzar tan pronto como se haya reenfocado la muestra.
   7. Suelte el estiramiento y vuelva a enfocar rápidamente manualmente en Z.
   8. Registre imágenes de la celda liberada durante el tiempo deseado (Figura 4B). Debido a la naturaleza flexible de la membrana PDMS, la muestra se desenfoca fácilmente con el tiempo. Por lo tanto, ajuste manualmente el enfoque a lo largo de la adquisición de la imagen.
      NOTA: Para reenfocar con éxito durante la adquisición de imágenes después de la liberación, las imágenes deben visualizarse con la frecuencia suficiente; Una imagen de video de 3 a 5 minutos cada 3 s es razonable. El sustrato PDMS no es compatible con el sistema de enfoque perfecto del microscopio, por lo que generalmente se requiere un ajuste manual por parte del usuario para una adquisición rápida. El enfoque del software puede estar establecido, pero tenga cuidado con los posibles errores y el gran movimiento del escenario que pueden dañar el objetivo al golpear una parte del poste elástico. El usuario puede decidir realizar varios estiramientos de la muestra en función del experimento.
4. Posprocesamiento: Alinee las imágenes con Fiji
   1. Abra las imágenes en reposo y cuele.
   2. Utilice la coincidencia de plantillas del complemento Fiji y seleccione una región de la celda para alinearla (Figura 4C).
      NOTA: Los desplazamientos relativos de la imagen de deformación alineada son renderizados por Fiji, y las imágenes se recortan y alinean. Descargue el complemento de template_matching desde este enlace : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. Siembra de células en un sustrato preestirado

1. Monte el anillo estirado recubierto con la proteína de adhesión en el dispositivo de estiramiento.
2. Estire el sustrato PDMS hasta el nivel de deformación deseado.
3. Siembra las celdas como en la sección 7.
   NOTA: En este experimento, la siembra no se realiza en condiciones estériles, por lo que el protocolo puede no ser apropiado para todos los tipos de células.
4. Una vez que las células se hayan adherido, intercambie el medio por un medio independiente del CO₂.
   NOTA: Elija celdas de adherencia rápida para minimizar el tiempo de adherencia.
5. Después de un tiempo de incubación deseado, suelte el estiramiento y obtenga una imagen de una celda de interés.
   NOTA: En este paso, es difícil encontrar una misma célula después de la liberación por estiramiento, ya que se desconoce la posición de la célula en reposo y el movimiento del sustrato PDMS no es fácilmente predecible.

9. Arreglar las células estiradas o relajadas

1. Fijar las celdas en estados estirados (trabajo bajo cubierta química)
   NOTA: El paraformaldehído (PFA) es un agente de fijación estándar; úselo tibio a 37 °C para asegurar una fijación rápida. Alternativamente, la solución de glioxal²² permite una fijación rápida de la muestra con una buena conservación de la muestra.
   1. Prepare el agente de fijación.
   2. Semillas de células en los anillos siguiendo el paso 7.2.
   3. Monte el poste de estiramiento y el controlador dentro de una campana química y conéctelo al suministro de vacío.
   4. Coloque el anillo con las células sembradas en el poste de estiramiento.
   5. Para fijar el estado estirado, estírelo hasta la tensión deseada. Retire los medios de cultivo celular y fije añadiendo la solución de PFA al 4% a las células durante 10 minutos a 37 °C. A continuación, lavar con PBS, siempre sujetando el estiramiento. Suelte lentamente la aspiradora y lave con más PBS.
      NOTA: No olvide preparar un estado de control sin estiramiento (para esto, se puede cortar y secar una pequeña pieza de PDMS con una pequeña cantidad de solución de etanol al 96% debajo, encima de un cubreobjetos de vidrio). Para obtener una imagen de la muestra fija, se recomienda estirar la muestra hasta la misma magnitud. Como el PFA es tóxico, se deben tomar las precauciones adecuadas en este paso. Es conveniente utilizar un horno pequeño que se pueda mantener bajo el capó, ver Tabla de Materiales).
   6. Tome una imagen de la muestra, preferiblemente aplicando el vacío nuevamente, al mismo nivel que se usó durante la fijación, lo que asegura el "replanlado" de la muestra (Figura 4D).
2. Fije la celda después de la liberación por estiramiento (trabajo debajo de la campana química).
   1. Estire las celdas hasta la tensión y el tiempo deseados. Justo antes de soltar el estiramiento, retire la mayor parte del medio sin secar completamente la muestra y libere la tensión. Alternativamente, aplique un estiramiento cíclico de una duración específica.
   2. Retire rápidamente el medio y fíjelo inmediatamente con la solución fijadora durante 10 minutos. Lavar con PBS e imagen.
      NOTA: La muestra también se puede sembrar en un sustrato preestirado y, después de un tiempo de siembra definido por el usuario, una liberación fija posterior al estiramiento como en el paso 9.2.2.
3. Inmunofluorescencia de la muestra fija: siga los protocolos estándar para la inmunofluorescencia en muestras estiradas o liberadas; El bloqueo con gelatina de pescado es preferible a BSA¹⁷.
4. Imagine la muestra (Figura 4E).
5. Conservación de muestras
   1. Prepare los medios de montaje para la conservación de muestras (Mowiol o Prolong).
   2. Retire el PBS y agregue una gota (aproximadamente 75 μL) de medio de montaje.
   3. Agarre un cubreobjetos con pinzas y colóquelo delicadamente encima (evite las burbujas, que dificultarían la visualización).
   4. Secar durante al menos 48 h a temperatura ambiente (RT).
   5. Corte alrededor de la muestra fija PDMS y móntela en otro cubreobjetos de vidrio para obtener imágenes posteriores.
      NOTA: Este paso no es compatible con la toma de imágenes posteriores de la muestra en la membrana estirada, ya que el montaje de la membrana PDMS en un cubreobjetos con el medio de conservación implica la conservación de la membrana solo en su estado relajado.

10. Fijación con la rejilla para obtener imágenes de la misma área de muestra en diferentes modos: imágenes SEM como ejemplo

NOTA: Este protocolo se puede utilizar para obtener imágenes de la misma célula individual en dos microscopios diferentes, microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica de barrido, como se presenta aquí. La adquisición de imágenes correlativas requiere un procesamiento avanzado de imágenes que no está en el ámbito de este protocolo. Otras aplicaciones útiles pueden ser, por ejemplo, la visualización de la muestra en modo vivo, la fijación adicional bajo el capó y la visualización de la misma célula después de la inmunotinción (el protocolo utilizado para la Figura 5 suplementaria).

1. Prepare un anillo elástico utilizando las placas de PMMA estampadas de la sección 4.
2. Siembra las celdas como en el paso 7.2.
   NOTA: Tenga en cuenta que la solución de recubrimiento debe aplicarse con cuidado para garantizar una cobertura completa del PDMS, incluso en los pequeños orificios de la rejilla.
3. Fijar como se describe en la sección 8 pero utilizando un fijador adecuado y un protocolo compatible con la muestra y las imágenes de microscopía electrónica.
   NOTA: Si utiliza una mezcla de PFA + glutaraldehído (por ejemplo, 2%-2,5%), tenga cuidado con la autofluorescencia proveniente de la presencia de reactivo de glutaraldehído y, finalmente, realice un paso de enfriamiento²³.
4. Visualice la muestra en modo de fluorescencia y registre la posición de la celda (imprima la cuadrícula y anote la posición con una cruz, por ejemplo).
5. Una vez que se hayan tomado todas las imágenes, prepare la muestra para EM cortando primero el PDMS alrededor de la muestra (eliminando previamente el lubricante).
6. Procese la membrana PDMS + muestra para microscopía electrónica de barrido (que implica un protocolo estándar de deshidratación de muestras y pulverización catódica de metales)¹².
7. Al obtener imágenes en el microscopio SEM, encuentre las posiciones de la cuadrícula y busque las células previamente obstruidas en modo fluorescente (Figura 4F, G).

Resultados

Calibración y radialidad
La correcta caracterización de la cepa obtenida es una garantía de reproducibilidad y control de los experimentos. Si bien se pueden agregar perlas fluorescentes a cada muestra para registrar con precisión la deformación, un paso de calibración previo garantiza una planificación adecuada del experimento, sabiendo la magnitud de la deformación que el experimentador desea aplicar a la muestra antes del estiramiento real. La deformación no solo dependerá del vacío aplicado, sino ...

Discusión

Se ha utilizado un gran número de dispositivos de estiramiento para aplicar estiramiento mecánico a muestras biológicas, imitando las condiciones fisiológicas del cuerpo^24,25. Existen numerosas configuraciones disponibles en la literatura, y la observación de la respuesta de la muestra generalmente se realiza mediante el acoplamiento de dispositivos de estiramiento a la fuerza atómica²⁶ o a la microscopía ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mascarilla de acetato	JD Photodata
Acrilamida	Biorad	161-0140	Solución de acrilamida al 40%
APS	Sigma Aldrich	Referencia A3678	Persulfato de amonio para electroforesis, ≥ 98%
Aptes	Sigma Aldrich	281778	(3-aminopropil)trietoxisilano
Bomba microfluídica autónoma	Elveflow Cobalto	Cobalto Dual	Cobalto Dual
Bisacrilamida	Biorad	161-0142	Solución Bis al 2%
Hoja	Fisher Scientific	11733919	Grupo Didáctico Hoja did ctica X100 LAME BISTOURI ESTÉRIL N° 23  LAMD23
Clips	Sprintis	AKXX000001	Clips Bull Dog, 32 mm, de metal, capacidad 10 mm, niquelado
Tratador de corona	Productos electrotécnicos	BD-20AC, SKU:12051A	BD-20AC TRATAMIENTO DE CORONA DE LABORATORIO
Tazas	VWR	611-1368	VWR, vasos de precipitados, desechables, 250 ml
DAPI	Roche	10236276001	Tinción DAPI
Etanol 96%	Panreac Quí mica, SLU	131085-1212	Etanol 96% v/v para aná lisis, ACS- 2,5 L
Fibronectina	Sigma	F0895	Fibronectina, de plasma humano, líquido  0.1%
Microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres, 0.1 µ m	Tecnología de la vida	F8801, F8803	Perlas fluorescentes amarillas, verdes y rojas para la evaluación de la resolución
Microesferas modificadas con carboxilato FluoSpheres, 0.2 µ m	Fisher Scientific	F8809, F8810	Perlas fluorescentes amarillas, verdes y rojas para la calibración de la deformación
Glutaraldehído	Sigma Aldrich	G6403	Solución de glutaraldehído al 50% en H2O
Interferómetro	Veeco	Wyko NT1100	Interferómetro para medir espesores de membranas PDMS
Isopropanol	Panreac Quí mica, SLU	131090-1212	2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para aná lisis, ACS, ISO
Laiton pesa			Hecho a medida
Pañuelos sin pelusa	Berkshire	DURX670, DR670090920	Toallitas no tejidas
Lubricante (vaselina)	Sigma	16415	Vaselina
Alineador de máscara	Sü ss MicroTec	MJB4	Alineador de máscara para fotolitografía en placas de PMMA
Mowiol	Calbiochem - Merck	475904	MOWIOL 4-88 Reactivo
Microscopio NIKON disco giratorio confocal	Nikon	Eclipse Ti-E/B	equipado con Nikon Ti-S-ER  etapa
Microscopio vertical NIKON	Nikon	Eclipse Ni-E	equipado con platina Nikon NI-SH-E
Objetivo 60x	Nikon	CFI Apo NIR 60X W	NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
Solución PBS	Gibco	14200067	DPBS, 10x
PDMS	Dow Corning	2401673921	Sylgard - 184 Kit de Elastómero de Silicona DN 109
Cubierta del anillo de placa de Petri (grande)	Proquinorte	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 diametro 100
Cubierta del anillo de la placa de Petri (pequeña)	Proquinorte	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924
Limpiador de plasma	Harrick	PDC-002	Generador de plasma de oxígeno
Placas y anillos de PMMA			Ver tabla de especificaciones de Excel en documentos complementarios
Prolongar	Invitrogen	P36930 /P36934	Reactivo antidecoloración ProLong Gold
Repel-Silane	GE Healthcare	17-1332-01	PlusOne Repel-Silane ES
Anillos / anillo de goma	Tecnifil		Hecho a medida
Recubrimiento por centrifugación	Laurel	WS-650Sz	Recubrimiento por centrifugación
SPY650-ADN	Espirocromo	SC 501	SPY650-ADN
Cuchara de dirección	VWR	231-0416	Espátula desechable corta Eco, cuchara y cuchara de doble punta, PP y aditivo EcoPure
Resina SU8 2100	Microquímica	Y111075	SU8-2100
Desarrollador SU8	Sigma-Aldrich	484431	Acetato de éter monometílico de propilenglicol
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-50ML	N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina, biorreactivo suitab. Reactivo de electroforesis
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano	Sigma Aldrich	448931	Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano
Pinzas	IESMAT	T5039	Pinzas Dumont HP 7 Acero inoxidable. Punta de 0,17 x 0,10 mm. (Agar Scientific Ltd)
Controlador de vacío	GARCAP / Parker	990-005203-005	Controlador de vacío
Controlador de vacío fluigent	Fluigent	LU-FEZ-N800	LineUp Flow EZ (n800mbar)
Papel de banco blanco	Raima	931.1001	Papel Raima 42 x 52