Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar los conflictos de transcripción-replicación derivados de oncogenes

Resumen

En este trabajo se presenta un método sensible y específico para detectar conflictos de transcripción-replicación (TRCs) inducidos por oncogenes mediante el ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Este enfoque aprovecha los anticuerpos específicos dirigidos a PCNA y fosfo-CTD RNAPII, lo que permite evaluar la prevalencia de TRC entre la transcripción de la ARN polimerasa II y la maquinaria de replicación del ADN.

Resumen

Tanto la replicación del ADN como la transcripción del ARN utilizan el ADN genómico como plantilla, lo que requiere la separación espacial y temporal de estos procesos. Los conflictos entre la replicación y la maquinaria de transcripción, denominados conflictos de transcripción-replicación (TRC), representan un riesgo considerable para la estabilidad del genoma, un factor crítico en el desarrollo del cáncer. Si bien se han identificado varios factores que regulan estas colisiones, sigue siendo difícil identificar las causas primarias debido a las limitadas herramientas para la visualización directa y la interpretación clara. En este estudio, visualizamos directamente las TRC utilizando un ensayo de ligadura de proximidad (PLA), aprovechando los anticuerpos específicos contra el PCNA y la CTD fosforilada de la ARN polimerasa II. Este enfoque permite la medición precisa de las TRC entre los procesos de replicación y transcripción mediados por la ARN polimerasa II. El método se mejora aún más a través de cebadores de ADN conjugados covalentemente con estos anticuerpos, junto con la amplificación por PCR mediante sondas fluorescentes, proporcionando un medio altamente sensible y específico para detectar TRC endógenos. La microscopía de fluorescencia permite la visualización de estos conflictos, ofreciendo una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos de inestabilidad del genoma asociados con el cáncer. Esta técnica aborda la brecha en la visualización directa de TRC, lo que permite un análisis y una comprensión más completos de los procesos subyacentes que impulsan la inestabilidad del genoma en las células.

Introducción

El genoma sirve como plantilla para los procesos biológicos esenciales, incluida la replicación y la transcripción. En las células sanas, la transcripción del ARN y la maquinaria de replicación del ADN suelen cooperar y están segregadas espacial y temporalmente 1,2,3,4. Sin embargo, en condiciones patológicas, como la sobreexpresión de oncogenes, esta cooperación armoniosa puede verse interrumpida.

Los oncogenes a menudo conducen niveles elevados de transcripción, lo que aumenta l....

Protocolo

1. Producción y transducción de lentivirus a la línea celular diana

1. Producción de lentivirus²⁴
   1. Semillas 293T células de empaquetamiento a 3 × 10⁶ células por placa de 10 cm en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM; medio completo). Cultive las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante 18-20 h adicionales.
   2. En dos tubos de 1,5 mL, prepare una mezcla de ADN de un total de 24 μg de ADN plásmido en 500 μL de Opti-MEM (medio sérico reducido) que contenga 9,2 μg de psPAX2, 2,8 μg de pMD2.....

Resultados

γH2AX sirve como biomarcador para el daño del ADN. La sobreexpresión de KRAS (G12D) perjudica la estabilidad genómica en estas células, como lo demuestra el aumento de la señal γH2AX en el análisis de Western blot (Figura 2A). Además, la intensificación de la señal de transferencia de puntos S9.6 en las células que expresan KRAS (G12D) en comparación con los controles vectoriales (Figura 2B) indica que la expresión oncogénica de KRAS conduce a la acumulación de .......

Discusión

La maquinaria de transcripción RNAPII puede crear un obstáculo para la progresión de la horquilla de replicación del ADN^26,27, promoviendo TRCs y daño al ADN, especialmente en células cancerosas^28,29. Descifrar las proteínas que regulan las TRC y comprender los mecanismos detallados puede ayudarnos a comprender cómo ocurren estos eventos dañinos y guiar el desarrollo de n.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clarity Western ECL Sustrato	Bio-Rad	1705061
Duolink Reactivos de detección in situ Green	Sigma	DUO92014
anticuerpo FLAG	Millipore	F7425
gamma H2AX anticuerpo	Cell Signaling	25955
Glucógeno, grado de biología molecular	ThermoFisher	R0561
Imagen J	NIH	https://imagej.net/ij/
membranas de nitrocelulosa	Amersham	10600004
PCNA	anticuerpo Señalización celular	13110
pLVX-Kras G12D	N/A	N/A
pMD2.G	Addgene	12259
Proteinasa K, recombinante, grado PCR	ThermoFisher	EO0491
psPAX2	Addgene	12260
Anticuerpo RNAPII	SCBT	SC-56767
Anticuerpo S9.6	Motivo activo	65683
Reticulantes UV	Fisher Scientific	FB-UVXL-1000