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Artículo de método

Mapeo mecánico de esferoides mediante espectroscopía de Brillouin

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DOI:

10.3791/67538

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12 de diciembre de 2025

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1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un protocolo para la caracterización mecánica de esferoides vivos dentro de una matriz 3D utilizando la microespectroscopía de Brillouin. Este método totalmente óptico permite la visualización de esferoides con resolución a microescala y propiedades mecánicas cuantitativas. Este enfoque tiene implicaciones para la fenotipización mecánica; por ejemplo, determinar estados patológicos de esferoides tumorales dentro de un microambiente 3D.

Resumen

La espectroscopía de Brillouin, una técnica emergente que está ganando un gran interés en la ciencia biomédica, permite a los investigadores recopilar información relacionada con la mecánica y la estructura mediante el análisis de las propiedades viscoelásticas y arquitectónicas de los especímenes de manera no destructiva y sin contacto. Este enfoque evalúa las propiedades mecánicas de las muestras 3D midiendo la interacción de la luz visible con las ondas/fonones acústicos inducidos térmicamente. La información que proporciona la espectroscopía de Brillouin tiene potencial para la evaluación in vivo de la biofísica y el posible diagnóstico de patologías de enfermedades. Una ventaja significativa de la espectroscopía de Brillouin es la capacidad de evaluar la mecánica a microescala dentro de una muestra biológica; otras técnicas convencionales que pueden lograr esta resolución, como la microscopía de fuerza atómica, solo pueden sondear muestras en 2D ya que requieren contacto directo. Este trabajo describe la aplicación de la microespectroscopía de Brillouin para investigar la biomecánica de esferoides vivos incrustados en una matriz hidrogel 3D. La encapsulación de esferoides celulares dentro de un microentorno 3D establece un sistema esferoide que recapitula de cerca la interfaz entre las células y la matriz extracelular in vivo. En nuestro protocolo, describimos la preparación y mediciones de muestras esferoides de espectros de Brillouin mediante imágenes secuenciales de fluorescencia. Además, discutimos procedimientos para el análisis de datos espectrales y detalles técnicos sobre el sistema óptico.

Introducción

El cultivo de células en modelos 3D es ventajoso en comparación con los métodos típicos de cultivo celular 2D, ya que recapitula mejor las estructuras tisulares y las interacciones célula-célula encontradas in vivo. Los esferoides son agregados celulares 3D que facilitan complejas interacciones célula-célula; Estas interacciones están comprometidas en células cultivadas como una monocapa sobre plástico de cultivo tisular. Los esferoides pueden crecer dentro de un andamiaje que imita el microambiente del que se originó la célula. Por ejemplo, los hidrogeles son un biomaterial popular utilizado para cultivar células/esferoides, ya que permiten un control preciso de parámetros como rigidez, degradabilidad, tamaño de los poros y la incorporación de factores de crecimiento1 (Figura 1A). Las señales mecánicas suelen preceder a los cambios bioquímicos en patologías de la enfermedad como el cáncer yla fibrosis 2,3, por lo tanto, adquirir la firma biomecánica en modelos 3D clínicamente relevantes de la enfermedad es fundamental para desarrollar intervenciones diagnósticas que informen la práctica terapéutica y comprender la fisiopatologíasubyacente 4.

La Microscopía de Brillouin (BM) es una técnica de imagen que permite medir las propiedades mecánicas de materiales biológicos en planos2D 5,6,7. La BM tiene algunas ventajas clave sobre otros métodos más comúnmente utilizados, como la microscopía de fuerza atómica (AFM) y la elastografía. Está bien documentado que AFM puede alcanzar una alta resolución mecánica espaciotemporal y que la elastografía puede sondear la mecánica dentro de lasmuestras 8,9. La BM no requiere contacto directo con el material investigado, lo que la convierte en una técnica ideal frente a la AFM para muestras/células de difícil acceso, como esferoides dentro de hidrogeles. Otra ventaja clave de BM es que no requiere etiquetado de muestras y puede proporcionar una resolución a microescala dentro de muestras biológicas, algo que los métodos de elastografía comúnmente usados no puedenlograr 7; Técnicas de elastografía óptica más avanzadas pueden funcionar a una resolucióna microescala 10. Cabe señalar que la resolución efectiva precisa en la imagen de Brillouin de muestras biológicas heterogéneas no es trivial de definir. En primer lugar, para una longitud de onda de iluminación dada, depende de las propiedades ópticas que describen el tamaño del punto focal (apertura numérica, NA, de la lente objetivo y opacidad de la muestra). Además, la precisión con la que se pueden sondear las propiedades mecánicas de la muestra, así como la forma del espectro de Brillouin, está influenciada por las características acústicas del material (longitud de onda fonónica y longitud de propagación)11,12. El fenómeno subyacente detrás de la espectroscopía de Brillouin es la dispersión de Brillouin, donde la luz láser monocromática incidente interactúa con fonones acústicos espontáneos inducidos térmicamente dentro del medio biológico. Esto provoca dispersión inelástica de la luz y (desplazamiento de frecuencia de Brillouin, BFS) en la Figura 1B y suele estar del orden de varios GHz y, dependiendo de si el fotón pierde o gana energía, se detectan picos de Brillouin Stokes y anti-Stokes en el espectro de la luz dispersada, respectivamente. Debido a su dependencia de la velocidad local del sonido en el medio, el BFS está relacionado con el módulo longitudinal elástico, que a su vez está empíricamente correlacionado con el módulo de Young 7,13; sin embargo, hay que tener cuidado al comparar estos módulos ya que (i) no están directamente relacionados entre sí, (ii) el módulo de Young suele estar en el rango Pa-kPa para muestras biológicas y materia blanda, mientras que el módulo longitudinal obtenido de Brillouin está en el rango GPa, y (iii) parámetros como los cambios en el índice de refracción y la densidad del material deben tenerse encuenta 7. El ancho de línea de Brillouin (en la Figura 1B) es otra medida obtenida de BM. Está relacionado con el módulo de pérdida longitudinal, lo que ofrece información sobre la viscosidad de la muestra; Estas propiedades pueden correlacionarse con la viscoelasticidad14. Así, BM permite evaluar las propiedades viscoelásticas, donde un BFS mayor implica un material más rígido, y un mayor ancho de línea implica un material más viscoso (Figura 1B). Cabe señalar que la dispersión elástica (de Rayleigh), donde los fotones no sufren un desplazamiento de frecuencia, tiene una probabilidad significativamente mayor de ocurrir en comparación con la dispersión de Brillouin. Por lo tanto, los espectrómetros de Brillouin deben estar equipados para suprimir la señal de Rayleigh.

La BM se ha utilizado para caracterizar las propiedades mecánicas de diversos tejidos, biomateriales y modelos de cultivo celular 3D. Por ejemplo, se utilizó la evacuación para diferenciar entre melanoma y tejido sano circundante, mostrando que el tejido no canceroso era significativamente más blando que elmelanoma 15. Rad et al. demostraron que aumentar la concentración polimérica de hidrogeles resultaba en un aumento del BFS y del ancho de línea. En las concentraciones más bajas de polímeros, los hidrogeles con células mostraron disminuciones mayores en los desplazamientos de frecuencia de Brillouin durante siete días en comparación con los hidrogeles vacíos, lo que se propuso que se debía a la remodelación celular del hidrogel. Esto no se observó a una concentración del 10% de polímero, lo que subrayó una posible falta de viabilidad celular encontrada en estoshidrogeles16.

De mayor relevancia para el presente estudio, la BM se ha utilizado para investigar las propiedades mecánicas de los esferoides 17,18,19,20. En particular, el efecto del microambiente local sobre la mecánica esferoide puede detectarse usando BM20. En comparación con los esferoides tumorales cultivados en hidrogeles flexibles, los esferoides cultivados en hidrogeles rígidos mostraron un BFS más alto, lo que indica un aumento del móduloelástico 20. La variación espacial de las propiedades mecánicas dentro de un esferoide también puede caracterizarse con BM. Por ejemplo, se ha encontrado que el BFS de los esferoides tumorales aumenta hacia el núcleo esferoide20,21. Además, una disminución del BFS se correlaciona con un aumento de la invasividad de los esferoidestumorales 20. La BM se ha utilizado para investigar los cambios mecánicos de los esferoides tumorales en respuesta al shockosmótico 22. En el estudio, se monitorizó el crecimiento esferoideo durante 5 días, encontrando que las diferencias mecánicas iniciales entre el cáncer y los esferoides sanos observados con la evacuación se perdieron con el tiempo. Otro estudio encontró un aumento de la BFS del esferoide tras 7 días, lo que se atribuyó al aumento del tamaño y número de célulasdel esferoide 16.

Además, se han realizado investigaciones multimodales, empleando microscopía de Brillouin junto con AFM y reología, para estudiar las propiedades mecánicas de células e hidrogeles 16,23,24. Rad et al. utilizaron la reología para contextualizar las tendencias medidas con BM, estableciendo una fuerte correlación positiva entre el módulo longitudinal y el módulo de cizalladura de almacenamiento respecto a la concentración polimérica de hidrogeles16. Se utilizaron microscopía de Brillouin y microreología óptica de pinzas para medir la mecánica de las células cancerosas cultivadas en hidrogeles3D 23. En este estudio, se observó una disminución de la heterogeneidad mecánica entre las células en esferoides en comparación con las células individuales cultivadas suspendidas en hidrogeles.

En este trabajo se detalla un protocolo para investigar las propiedades mecánicas de esferoides vivos incrustados en hidrogeles con un microscopio Brillouin comercial (Figura 1). Berghaus et al. describieron un protocolo detallando los pasos para construir un espectrómetro Brillouin de alta resolución y un método para calibrarlo con materialesde referencia 25. Además, un protocolo de Shi et al. describe el uso de la microscopía de Brillouin para monitorizar los cambios en las propiedades mecánicas del tejidoembrionario 26. Utilizamos esferoides de células madre mesenquimales (MSC) en hidrogeles poli(etileno) glicol (PEG)-maleimida para imitar el nicho de médula ósea e investigar las propiedades mecánicas de este entorno. Este modelo 3D tiene el potencial de descubrir la firma mecánica de enfermedades de la médula ósea, incluyendo leucemia, mieloma múltiple y cáncer óseo secundario. Por tanto, el protocolo es directamente transferible a modelos 3D de otras enfermedades donde la mecanobiología alterada puede tener un papel importante en la patología. Se detallan las técnicas de preparación de esferoides e hidrogel, imagen de fluorescencia y microscopía de Brillouin. Se discuten los procedimientos recomendados, posibles inconvenientes y posibles mejoras de la técnica. La descripción detallada del montaje experimental se presenta en la Figura S1 y en la sección de Materiales y métodos suplementarios relacionados con el montaje experimental.

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Protocolo

1. Cultivo celular 2D

NOTA: Siempre que sea posible, asegúrese de que todo el trabajo de cultivo celular se realice en un entorno estéril utilizando una campana de flujo laminar estándar para cultivo de tejidos para evitar contaminaciones. Las MSC se utilizaron en el protocolo actual, pero otros tipos celulares pueden emplearse para crear esferoides, dependiendo de los objetivos específicos del estudio.

  1. Cultivar MSCs en un medio de cultivo celular Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, con suficiente volumen para cubrir las células, que contienen 4,5 g/L de D-glucosa, + L-Glutamina suplementada con suero fetal bovino (FBS) al 10%, piruvato de sodio a 100 μM, aminoácidos no esenciales al 1% (NEAA), 1% de penicilina y estreptomicina. Incubar células a 37 °C y 5% deCO2.
  2. Las células del pasadizo con confluencia del 70-80%, incubando con ácido etilendediaminéstetraacético al 0,05% (tripsina añadida debe ser 1/3 del volumen DMEM) durante 3 minutos a 37 °C y 5% deCO2 para desprender las células de la placa. Para evitar la reacción, añade medios de cultivo que contengan FBS (al menos igualando el volumen de tripsina añadida). Cuenta las células usando un hemocitómetro.

2. Preparación de esferoides

NOTA: Siempre que sea posible, asegúrese de que todo el trabajo de cultivo celular se realice en un entorno estéril utilizando una campana de flujo laminar estándar para cultivo de tejidos para evitar contaminaciones. En este estudio, se utilizaron placas de micropozos para crear esferoides MSC. Estas placas están compuestas por 24 pozos, y cada pozo contiene 1200 micropozos, de 400 μm de diámetro. Esto permite la preparación de un gran número de esferoides (Figura 2).

  1. Para preparar la placa del micropozo, pretrata los pozos añadiendo 500 μL de solución de enjuague antiadherente a cada pozo. Placa de centrífuga a 1.300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Bajo un microscopio a 20x de aumento, comprueba si hay burbujas de aire presentes. Si los hay, repite el paso de centrifugación. Retira la solución antiadherencia.
  2. Para lavar la placa, añade 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y aspira. Haz esto dos veces para asegurarte de que la solución de enjuague ha sido eliminada por completo.
  3. Determina el número de células por esferoide y el número de esferoides por gel. Esto dependerá de las preguntas de investigación individuales. Por ejemplo, usamos 100 celdas por esferoide y 100 esferoides por gel. Por lo tanto, para este protocolo, solo se requería un pozo de la placa del micropozo, ya que esto crea un total de 1200 esferoides. Para calcular el número de celdas necesarias para un pozo, hicimos el siguiente cálculo: 1200 x 100 = 1,2 x 105. Calcula el volumen de la suspensión de celdas que contiene 1,2 x 105 celdas. Centrifuga la suspensión de la celda a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y elimina el sobrenadante.
  4. Resuspender las células en 1 mL de DMEM (+4,5 g/L D-Glucosa, + L-Glutamina) suplementado con 100 μM de piruvato sódico, 1% NEAA, 1% penicilina y estreptomicina. Añade 1 mL de suspensión de celda a un pozo de la placa del micropozo y pipetea suavemente arriba y abajo para dispersar las células de forma uniforme por todo el pozo. Ten cuidado de no introducir burbujas de aire. Centrifuga la placa a 100 g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Por ahora, no añadimos FBS a los medios. Esto es para evitar que las células se adhieran al plástico del cultivo de tejido.
  5. Observa la placa bajo el microscopio para asegurarte de que las células están distribuidas uniformemente y se han hundido hasta el fondo de los micropozos. Incubar células a 37 °C y 5% deCO2. Observar la formación esferoide 24 horas después.
    NOTA: Los esferoides pueden permanecer en la placa hasta 48 horas, dependiendo del tipo celular y de la compacidad deseada del esferoide.
  6. Para extraer los esferoides de la placa, primero se retira lentamente y con suavidad el medio de cultivo, con la intención de no molestar a los esferoides. Para evitar que los esferoides se adhieran al plástico, recubre las puntas y tubos de la pipeta con PBS con un 1% de FBS. Para evitar que los esferoides se queden atascados en las puntas de la pipeta, corta la punta para ensanchar la abertura. Durante estos pasos se pueden usar puntas de máxima recuperación como medida adicional para evitar la pérdida de esferoides. Añade 500 μL de PBS a cada pozo de la placa del micropozo y haz una pipeta arriba y abajo para desalojar los esferoides. Recoge el PBS con esferoides suspendidos en un tubo (Figura 2).
  7. Observa la placa bajo el microscopio a 20x de aumento y repite este paso hasta que la mayoría de los esferoides hayan sido eliminados con éxito.
  8. Para contar el número de esferoides en la suspensión, transfiere 50 μL de la suspensión a un pozo de una placa de 96 pozos. Cuenta el número de esferoides en los 50 μL. Para facilitar el conteo, se puede dibujar una cruz en el fondo del pozo usando un rotulador permanente. Calcular el número de esferoides usando la ecuación (1):
    figure-protocol-1

3. Preparación de hidrogeles PEG

NOTA: Siempre que sea posible, asegúrese de que todo el trabajo de cultivo celular se realice en un entorno estéril utilizando una campana de flujo laminar estándar para cultivo de tejidos para evitar contaminaciones. En este estudio se utilizaron hidrogeles de PEG-maleimida, pero también pueden emplearse otros tipos. Los hidrogeles PEG-maleimida se formaron mediante la reacción de adición tiol-Michael27. Los reticuladores utilizados fueron una mezcla de PEG-ditiol y péptido degradable por proteasa, flanqueados por dos residuos de cisteína (péptido VPM, GCRDVPMSMRGGDRCG). Los geles del presente estudio usaron un 70% de PEG-ditiol y un 30% de péptido VPM degradable.

  1. Haz una solución de 200 mg/mL de péptido VPM y añade 2,4 μL de péptido por gel. Haz una solución de fondo de 200 mg/mL de PEG-ditiol y añade 5,6 μL por gel.
  2. Suspende los esferoides en PBS antes de mezclarlos con los reticuladores (Figura 2). Mezcla la suspensión esferoide con el PEG-ditiol (5,6 μL por gel) y el VPM (2,4 μL por gel). Esta solución se denomina Solución B.
    NOTA: En este protocolo, se añadieron 100 esferoides por gel.
  3. Prepara una solución de fondo de PEG-Maleimida de 250 mg/mL. Añade 50 μg de fibronectina por gel. Mezclar la solución de PEG-Maleimida y fibronectina; esto se denomina Solución A. Solución de Pipeta A (40,3 μL para geles de 100 μL) sobre el fondo de una placa de cultivo de tejido de 12 pozos. Añadir la Solución B (59,7 μL para geles de 100 μL) con una proporción molar de 1:1 maleimida:tiol para asegurar un retticulo completo; Asegúrate de que la gelificación ocurra de forma instantánea. El volumen final de los hidrogeles es de 100 μL.
  4. Incuba los geles durante 30 minutos a 37 °C y 5% deCO2 para permitir la gelificación. Añadir un medio de cultivo completo (DMEM suplementado con 10% FBS, 100 μM piruvato sódico, 1% de NEAA y 1% de penicilina y estreptomicina) al pozo, asegurando que el gel quede completamente sumergido (Figura 2). Incubar el gel a 37 °C y 5% deCO2 hasta estar listo para tomar mediciones con el microscopio Brillouin.
    NOTA: La duración del cultivo de esferoides dentro de los hidrogeles antes de las mediciones de Brillouin dependerá del tipo celular y de la pregunta de investigación. Por ejemplo, en este estudio, los esferoides suelen cultivarse en hidrogeles durante hasta 7 días, durante los cuales se monitorizan mediante microscopía de Brillouin. Se caracterizaron las propiedades viscoelásticas de los hidrogeles con o sin encapsulación esferoide y no muestran un impacto significativo de los esferoides en la mecánica del gel (Figura S2).

4. Tinción e imagen por fluorescencia de esferoides en hidrogeles

NOTA: En este estudio, los núcleos celulares y los filamentos de actina que componen el citoesqueleto fueron teñidos con fluorescencia e imágenes antes de las mediciones de Brillouin.

  1. Para teñir la actina, añade tinción viva de actina al medio de cultivo con una dilución de 1 en 500, 3 horas antes de la imagen. Mantén la muestra fuera de la luz envolviéndola en papel de aluminio. Incuba el gel a 37 °C y 5% deCO2.
  2. Para teñir los núcleos, añade 2 gotas/mL de tinte nuclear vivo al medio de cultivo que rodea el gel 40 minutos antes de la imagen. Devuelve las muestras a la incubadora.
  3. Adquiere imágenes de fluorescencia lo antes posible después de completar el tiempo de incubación de la tinción. Verifica que el camino óptico adecuado (exponiendo la cámara del microscopio) y la posición correcta de la rueda del filtro estén seleccionados. Atenua las luces de la habitación y captura el fondo. Enciende la fuente de luz de diodo emisor de luz (LED) y elige la longitud de onda según el protocolo de tinción (aquí, 385 nm se usó para núcleos y 621 nm para imágenes de actina). Obtener imágenes fluorescentes de esferoides con una ampliación de 20x con el software preferido. Apaga la fuente LED cuando termines.

5. Microscopía de Brillouin de esferoides

  1. Encendido de los dispositivos y emisión láser
    1. Enciende los dispositivos: el ordenador, el espectrómetro, las cámaras del microscopio, el microscopio, el ventilador de refrigeración láser y la emisión láser activando la llave del controlador. Asegúrate de que esto se haga 15 minutos antes de la optimización del espectrómetro para garantizar que el láser se haya termalizado. Verifica que la potencia láser emitida sea la esperada con un medidor de potencia (100 mW en nuestro experimento).
  2. Enciende la aplicación de control de temperatura (véase Tabla de Materiales) y verifica que la temperatura del etalón esté optimizada midiendo la potencia del haz después del etalón. Si es significativamente menor de lo esperado (teniendo en cuenta el filtro de densidad óptica (OD) utilizado), cambia la temperatura objetivo en 1 °C y observa si hay un aumento de potencia con el tiempo. Si hay una disminución, invierte la dirección del cambio. Una vez que la potencia esté cerca de lo esperado, ajusta en pequeños incrementos (0,1 °C) hasta alcanzar el máximo.
  3. Colocar el punto focal del objetivo dentro del cubo de acrílico
    NOTA: La supresión de la dispersión elástica y el acoplamiento del "asesino de bombas" al espectrómetro se optimiza con una muestra de material de referencia rígido y homogéneo antes de cada experimento. En este estudio se utiliza un cubo de acrílico.
  4. Abre el software SpectraLok y espera hasta que detecten todos los dispositivos. En el lado izquierdo de la ventana principal (Figura 3), seleccione la cámara espectrómetro.
    1. Instala el cubo de acrílico en el soporte de muestras del microscopio con el lado transparente mirando hacia la lente objetivo. Baja la lente objetivo tanto como puedas y centra el cubo debajo de ella. Asegúrese de que el camino óptico en el microscopio esté elegido para que la cámara del espectrómetro quede expuesta (ajuste el selector de puertos rotatorios a L).
      NOTA: En nuestra configuración, el puerto L está conectado al circulador confocal, mientras que el R está conectado al puerto de la cámara del microscopio.
    2. En la ventana de la cámara SpectraLok, ajusta el tiempo de exposición del sensor a 500 ms y la ganancia del software a 100. El ajuste de ganancia por software solo mejora el contraste para fines de visualización.
  5. Desbloquea el obturador láser.
    NOTA: Mientras la emisión láser está activada, ten cuidado de no poner nunca la cabeza ni los ojos en la trayectoria del haz láser.
    1. Pulsa captura y mueve la lente objetivo hacia arriba. Habrá un aumento significativo en la intensidad de la señal y aparecerá un patrón saturado (Figura 4A). Esto es causado por una fuerte reflexión de la luz láser en la interfaz aire-cubo acrílico. Al subir la lente, la intensidad de la señal disminuirá y los picos de Brillouin se harán evidentes. Continúa reposicionando la lente objetivo hasta que la intensidad de los picos de Brillouin sea constante (Figura 4B). Esto corresponde al punto focal ubicado completamente dentro del cubo de acrílico.
  6. Optimización de la presión del etalón para minimizar la luz residual dispersada elásticamente
    NOTA: El propósito de los siguientes pasos es suprimir la señal de Rayleigh elástica dispersada para que solo la luz de Brillouin desplazada en frecuencia llegue a la cámara del espectrómetro.
  7. En el software SpectraLok, abre la ventana de control Pump Killer (PK) (Figura 5).
  8. Haz zoom en uno de los órdenes Brillouin más brillantes y ajusta la posición del actuador de presión en incrementos de 100 μm haciendo clic en mover rel para minimizar la intensidad máxima de Rayleigh. Si la señal de Rayleigh está aumentando, invierte la dirección del cambio haciendo clic en marcha atrás. Posteriormente, se ajusta finamente la presión del etalón en incrementos de 10 μm.
    NOTA: En el cubo de acrílico, la luz de Rayleigh puede ser completamente suprimida; esto puede no ser así en una muestra biológica heterogénea.
  9. Optimización de la superposición de rayas para "desenrollar" los datos espectrales
    NOTA: El siguiente procedimiento garantiza que las coordenadas de píxeles (x, y) del sensor de la cámara estén adecuadamente mapeadas a la longitud de onda mediante la aplicación de la tabla de consulta LUT.
  10. En la ventana de la cámara , haz zoom en uno de los pedidos Brillouin.
  11. Pulsa s para visualizar las franjas a las que se aplica la LUT en la imagen de la cámara (Figura 6A). Abre la ventana de Ajustes y pulsa calibración rápida para recalcular el desplazamiento horizontal óptimo de las franjas. Si el sensor está saturado, reduce el tiempo de exposición antes de este paso.
    1. En la ventana de la cámara , verifica que las franjas moradas estén bien superpuestas con la región central de los picos de Brillouin (Figura 6B).
  12. Optimización del acoplamiento del espectrómetro PK
  13. El ajuste de los ejes de la lente colimadora permite maximizar la eficiencia del acoplamiento de la luz del PK al espectrómetro.
  14. Abre la ventana del espectro y haz clic en desenrollar para recuperar el espectro (Figura 7).
  15. Abre la ventana de control de PK . Con incrementos de 0,0005°, ajusta iterativamente los ejes 1 y 2 del colimador para maximizar la señal de Brillouin. Si es necesario, el control de presión del etalón puede optimizarse aún más. En un cubo acrílico homogéneo, la señal de Rayleigh puede ser completamente suprimida (Figura 7A). Aunque las mediciones precisas de Brillouin con cierta señal residual de Rayleigh son factibles (Figura 7B), en casos de mala supresión (Figura 7C), la luz dispersada elásticamente oculta la señal de Brillouin.
  16. Verifica que la señal de Brillouin obtenida sea comparable a la amplitud de referencia. Por ejemplo, en nuestro sistema, a una exposición de 500 ms y con OD 0,3, la amplitud máxima de intensidad de Brillouin es aproximadamente de 3000 tiempos. Para guardar los cambios de los parámetros PK en el archivo de configuración, en la ventana PK, haz clic en actualizar todo y guardar todo. Además, en la ventana principal, pulsa guardar en la sección de E/S de archivo .
  17. Cambiar a software de escaneo y verificar que los parámetros siguen optimizados
  18. Cierra SpectraLok y abre el software de escaneo. En el protocolo actual se utilizó software basado en LabVIEW y se describe con más detalle en la Figura S3. Para establecer la geometría de escaneo, esta interfaz de usuario propietaria (UI) se utiliza para controlar la etapa de traducción Prior XY-Z; sin embargo, se pueden emplear otros métodos.
    1. Instala la placa de Petri con fondo de cristal junto con la muestra de hidrogel-esferoide en lugar del cubo de acrílico (Figura 8). Para evitar la deshidratación del gel, la incubadora se ajusta a 37 °C y un 95% de humedad relativa. Quita la tapa de la placa de Petri y añade medio para sumergir el gel. Añade una capa de cobertura en la parte superior del gel para evitar que el gel se mueva.
    2. Localiza el esferoide. Con el haz láser bloqueado, cambia la trayectoria óptica del microscopio al ocular. Enciende la luz blanca. Usando el joystick, controla manualmente la etapa de muestra, localiza y enfoca el esferoide.
    3. Obtén una imagen de campo claro del esferoide. Ajusta el brillo de la iluminación girando la rueda de control. Configura la trayectoria óptica a R, exponiendo así la cámara del microscopio. El tiempo de exposición puede ajustarse según sea necesario para obtener una imagen de alto contraste (es decir, 50 ms).
    4. Verifica que el espectrómetro y los parámetros de despliegue sigan optimizados. Coloca el puerto del microscopio en L y captura el fondo con el láser bloqueado. Desbloquea el láser girando la rueda para que dispare. En función de la relación señal-ruido deseada, selecciona el tiempo de exposición. El tiempo de exposición típico de estas mediciones es de 200-500 ms.
    5. Si ha pasado algún tiempo (es decir, varias horas) desde la calibración inicial o ha habido una alteración mecánica del sistema, el ajuste de presión del etalón o el acoplamiento del espectrómetro PK pueden dejar de ser óptimos. Repite los pasos 5.3-5.5 para reoptimizar lo mencionado, si es necesario.
    6. Del espectro sin envolver, selecciona la gama de ajuste de la pica Brillouin. Ajusta el valor umbral a aproximadamente la mitad de la intensidad de los picos de Brillouin. Ignora los picos de Brillouin con amplitud por debajo de este umbral. Corrige la longitud de onda del láser según todos los pares de picos de Brillouin identificados.
  19. Configuración de la geometría de escaneo multidimensional
  20. Elige la geometría de barrido ráster ajustando el ancho de la región de escaneo y el tamaño del paso.
    NOTA: Para esferoides de tamaño aproximado de 70 μm, para un escaneo de baja resolución, normalmente usamos un área de escaneo de 150 μm × 150 μm y un tamaño de paso de 10 μm. Esto produce un mapa 2D de baja resolución en aproximadamente 3,4 minutos.
    1. Empieza el escaneo.
  21. Desactivando el sistema Brillouin
    1. Cierra el software y apaga el ordenador. Apaga la emisión láser usando la llave del mando. Deja la rueda del obturador en la posición bloqueada . Apaga la refrigeración del ventilador láser. Apaga las cámaras del microscopio y del espectrómetro. Por último, apaga el microscopio.

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Resultados

Los archivos obtenidos tras un escaneo incluyen espectros, parámetros de ajuste de escaneo (.csv), parámetros y análisis de escaneo, mapas BFS y de ancho de línea, imagen de campo claro con la región de interés identificada y una captura de pantalla de la ventana de la interfaz. Para cada punto del escaneo de Brillouin multidimensional se adquiere un valor BFS. En la Figura 9, se muestra un escaneo de alta resolución junto a la imagen del campo claro, y las ...

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Discusión

Hemos establecido un protocolo para utilizar la microscopía Brillouin para la imagen biomecánica de esferoides incrustados en hidrogeles con resolución a microescala. El hidrogel puede distinguirse del esferoide vivo por diferencias en los valores de BFS obtenidos. En los resultados representativos, utilizamos esferoides MSC e hidrogeles PEG-maleimida; sin embargo, este protocolo es aplicable en términos generales a otros tipos celulares (por ejemplo, líneas celulares cancerosas). Las cé...

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Divulgaciones

Los autores señalan que T. Allen y G. Wardle son empleados de LightMachinery, que fabrica y vende el espectrómetro Brillouin utilizado en este estudio. La compañía podría beneficiarse de la publicación de esta obra. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Agradecimientos

Los autores reconocen la financiación obtenida de la subvención MechanoMeds Fase 2, UKRI/EPSRC, número de subvención EP/X033554/1 para apoyar el desarrollo de este método.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PEG-Maleimida de 4 brazos (20 kDa)PEGWorks CreativosPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
Placas AggreWell 400Tecnologías STEMCELL34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
Etalón espaciado en el aireLightMachineryHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
Solución de enjuague antiadherenteTecnologías STEMCELL7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
Incubadora de Etapa Superior de la Línea AudazOkolabH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
Láser Cobolt Flamenco-100 660 nmHuebner0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
Circulador confocalLightMachineryHF-13311N/A
Sistema de iluminación de fluorescencia D-LEDi  NikonMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
Módulo EPI-FLNikonTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
Fibronectina (humana)YoProteínas663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
Gibco Dulbecco' s Eagle Medio Modificado (DMEM)ThermoFisher11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
Espectrómetro HyperFine BrillouinLightMachineryHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
Cubo de filtro cuádruple de banda LED-DA/FI/TR/Cy5-BNikonMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
Células madre mesenquimales (MSC)PromoCellC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
Etapa de traducción motorizada  Prior ScientificH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue y comercio; ReadyProbes y comercio en directo; reactivo (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
Objetivo, S Plan Fluor 20X NA 0,45, aireNikonMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
Cámara CMOS ORCA-FusionHamamatsuC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-dithiol, 2 kDaPEGWorks CreativosPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
cámara sCMOS  Soluciones de visión Teledyne01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-actin EspirocromoCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureAppSoftware de control de temperatura
Péptido VPM, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptN/AN/A
Microscopio Eclipse Ti-2ANikonEclipse Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

Referencias

  1. Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  2. Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer and fibrosis progression. Curr Opin Biomed Eng. 33, 100570(2025).
  3. Walker, M., Morton, J. P. Hydrogel models of pancreatic adenocarcinoma to study cell mechanosensing. Biophys Rev. 16 (6), 851-870 (2024).
  4. Ryu, S., Martino, N., Kwok, S. J. J., Bernstein, L., Yun, S. H. Label-free histological imaging of tissues using Brillouin light scattering contrast. Biomed Opt Express. 12 (3), 1437-1448 (2021).
  5. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on Brillouin module to confocal microscopes. Nat Protoc. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  6. Kabakova, I., et al. Brillouin microscopy. Nat Rev Methods Primers. 4, 8(2024).
  7. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nat Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  8. Czajkowsky, D. M., Iwamoto, H., Shao, Z. Atomic force microscopy in structural biology: from the subcellular to the submolecular. J Electron Microsc. 49 (3), 395-406 (2000).
  9. Glaser, K. J., Manduca, A., Ehman, R. L. Review of MR elastography applications and recent developments. J Magn Reson Imaging. 36 (4), 757-774 (2012).
  10. Jordan, J., et al. Rapid stiffness mapping in soft biologic tissues with micrometer resolution using optical multifrequency time-harmonic elastography. Adv Sci. 12 (8), e2410473(2025).
  11. Mattarelli, M., Vassalli, M., Caponi, S. Relevant length scales in Brillouin imaging of biomaterials: the interplay between phonons propagation and light focalization. ACS Photonics. 7 (9), 2319-2328 (2020).
  12. Caponi, S., Fioretto, D., Mattarelli, M. On the actual spatial resolution of Brillouin imaging. Opt Lett. 45 (5), 1063-1066 (2020).
  13. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nat Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  14. Rodríguez-López, R., et al. Network viscoelasticity from Brillouin spectroscopy. Biomacromolecules. 25 (2), 955-963 (2024).
  15. Troyanova-Wood, M., Meng, Z., Yakovlev, V. V. Differentiating melanoma and healthy tissues based on elasticity-specific Brillouin microspectroscopy. Biomed Opt Express. 10 (4), 1774-1781 (2019).
  16. Rad, M. A., et al. Micromechanical characterisation of 3D bioprinted neural cell models using Brillouin microspectroscopy. Bioprinting. 25, e00179(2022).
  17. Conrad, C., Gray, K. M., Stroka, K. M., Rizvi, I., Scarcelli, G. Mechanical characterization of 3D ovarian cancer nodules using Brillouin confocal microscopy. Cell Mol Bioeng. 12 (3), 215-226 (2019).
  18. Yan, G., Monnier, S., Mouelhi, M., Dehoux, T. Probing molecular crowding in compressed tissues with Brillouin light scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (4), e2113614119(2022).
  19. Hilai, K., et al. Mechanical evolution of metastatic cancer cells in 3D microenvironment. Small. 21, 2403242(2025).
  20. Mahajan, V., et al. Mapping tumor spheroid mechanics in dependence of 3D microenvironment stiffness and degradability by Brillouin microscopy. Cancers. 13 (21), 5549(2021).
  21. Margueritat, J., et al. High-frequency mechanical properties of tumors measured by Brillouin light scattering. Phys Rev Lett. 122 (1), 018101(2019).
  22. Zhang, J., Nikolic, M., Tanner, K., Scarcelli, G. Rapid biomechanical imaging at low irradiation level via dual line-scanning Brillouin microscopy. Nat Methods. 20 (5), 677-681 (2023).
  23. Nikolić, M., Scarcelli, G., Tanner, K. Multimodal microscale mechanical mapping of cancer cells in complex microenvironments. Biophys J. 121 (19), 3586-3599 (2022).
  24. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by Brillouin microscopy. Nat Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  25. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-GHz spectrometer for Brillouin scattering analysis. J Vis Exp. (106), e53468(2015).
  26. Shi, C., et al. Monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo. J Vis Exp. (201), e66117(2023).
  27. Trujillo, S., et al. Engineered 3D hydrogels with full-length fibronectin that sequester and present growth factors. Biomaterials. 252, 120104(2020).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Chiu, C. L., Clack, N. Napari: a Python multi-dimensional image viewer platform for the research community. Microsc Microanal. 28 (S1), 1576-1577 (2022).
  30. Passeri, A. A., et al. Brillouin spectroscopy for accurate assessment of morphological and mechanical characteristics in micro-structured samples. J Phys Photonics. 6 (3), 035016(2024).
  31. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt Express. 20 (8), 9197(2012).
  32. Pollard, T. D., Cooper, J. A. Actin, a central player in cell shape and movement. Science. 326, 1208-1212 (2009).
  33. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive Brillouin microscopy. Sci Rep. 6 (1), 37217(2016).
  34. Coker, Z. N., et al. Brillouin microscopy monitors rapid responses in subcellular compartments. PhotoniX. 5 (1), 9(2024).
  35. Yang, F., et al. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 20 (12), 1971-1979 (2023).
  36. Antonacci, G., et al. Recent progress and current opinions in Brillouin microscopy for life science applications. Biophys Rev. 12 (3), 615-624 (2020).
  37. Savitzky, A., Golay, M. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Anal Chem. 36, 1627-1639 (1964).
  38. Yan, G., et al. Evaluation of commercial virtually imaged phase array and Fabry-Pérot based Brillouin spectrometers for applications to biology. Biomed Opt Express. 11 (12), 6933-6944 (2020).
  39. Elsayad, K. Spectral phasor analysis for Brillouin microspectroscopy. Front Phys. 7 (62), 1-8 (2019).
  40. Mahmodi, H., et al. Principal component analysis in application to Brillouin microscopy data. J Phys Photonics. 6 (2), 025009(2024).
  41. Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl Phys Lett. 103 (22), 221105(2013).

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