Este artículo describe un protocolo para la caracterización mecánica de esferoides vivos dentro de una matriz 3D utilizando la microespectroscopía de Brillouin. Este método totalmente óptico permite la visualización de esferoides con resolución a microescala y propiedades mecánicas cuantitativas. Este enfoque tiene implicaciones para la fenotipización mecánica; por ejemplo, determinar estados patológicos de esferoides tumorales dentro de un microambiente 3D.
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Artículo de método
Mapeo mecánico de esferoides mediante espectroscopía de Brillouin
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Resumen
Resumen
La espectroscopía de Brillouin, una técnica emergente que está ganando un gran interés en la ciencia biomédica, permite a los investigadores recopilar información relacionada con la mecánica y la estructura mediante el análisis de las propiedades viscoelásticas y arquitectónicas de los especímenes de manera no destructiva y sin contacto. Este enfoque evalúa las propiedades mecánicas de las muestras 3D midiendo la interacción de la luz visible con las ondas/fonones acústicos inducidos térmicamente. La información que proporciona la espectroscopía de Brillouin tiene potencial para la evaluación in vivo de la biofísica y el posible diagnóstico de patologías de enfermedades. Una ventaja significativa de la espectroscopía de Brillouin es la capacidad de evaluar la mecánica a microescala dentro de una muestra biológica; otras técnicas convencionales que pueden lograr esta resolución, como la microscopía de fuerza atómica, solo pueden sondear muestras en 2D ya que requieren contacto directo. Este trabajo describe la aplicación de la microespectroscopía de Brillouin para investigar la biomecánica de esferoides vivos incrustados en una matriz hidrogel 3D. La encapsulación de esferoides celulares dentro de un microentorno 3D establece un sistema esferoide que recapitula de cerca la interfaz entre las células y la matriz extracelular in vivo. En nuestro protocolo, describimos la preparación y mediciones de muestras esferoides de espectros de Brillouin mediante imágenes secuenciales de fluorescencia. Además, discutimos procedimientos para el análisis de datos espectrales y detalles técnicos sobre el sistema óptico.
Introducción
El cultivo de células en modelos 3D es ventajoso en comparación con los métodos típicos de cultivo celular 2D, ya que recapitula mejor las estructuras tisulares y las interacciones célula-célula encontradas in vivo. Los esferoides son agregados celulares 3D que facilitan complejas interacciones célula-célula; Estas interacciones están comprometidas en células cultivadas como una monocapa sobre plástico de cultivo tisular. Los esferoides pueden crecer dentro de un andamiaje que imita el microambiente del que se originó la célula. Por ejemplo, los hidrogeles son un biomaterial popular utilizado para cultivar células/esferoides,....
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Protocolo
1. Cultivo celular 2D
NOTA: Siempre que sea posible, asegúrese de que todo el trabajo de cultivo celular se realice en un entorno estéril utilizando una campana de flujo laminar estándar para cultivo de tejidos para evitar contaminaciones. Las MSC se utilizaron en el protocolo actual, pero otros tipos celulares pueden emplearse para crear esferoides, dependiendo de los objetivos específicos del estudio.
- Cultivar MSCs en un medio de cultivo celular Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, con suficiente volumen para cubrir las células, que contienen 4,5 g/L de D-glucosa, + L-G....
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Resultados
Los archivos obtenidos tras un escaneo incluyen espectros, parámetros de ajuste de escaneo (.csv), parámetros y análisis de escaneo, mapas BFS y de ancho de línea, imagen de campo claro con la región de interés identificada y una captura de pantalla de la ventana de la interfaz. Para cada punto del escaneo de Brillouin multidimensional se adquiere un valor BFS. En la Figura 9, se muestra un escaneo de alta resolución junto a la imagen del campo claro, y las .......
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Discusión
Hemos establecido un protocolo para utilizar la microscopía Brillouin para la imagen biomecánica de esferoides incrustados en hidrogeles con resolución a microescala. El hidrogel puede distinguirse del esferoide vivo por diferencias en los valores de BFS obtenidos. En los resultados representativos, utilizamos esferoides MSC e hidrogeles PEG-maleimida; sin embargo, este protocolo es aplicable en términos generales a otros tipos celulares (por ejemplo, líneas celulares cancerosas). Las cé.......
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Divulgaciones
Los autores señalan que T. Allen y G. Wardle son empleados de LightMachinery, que fabrica y vende el espectrómetro Brillouin utilizado en este estudio. La compañía podría beneficiarse de la publicación de esta obra. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.
Agradecimientos
Los autores reconocen la financiación obtenida de la subvención MechanoMeds Fase 2, UKRI/EPSRC, número de subvención EP/X033554/1 para apoyar el desarrollo de este método.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| PEG-Maleimida de 4 brazos (20 kDa) | PEGWorks Creativos | PSB-455 | https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k |
| Placas AggreWell 400 | Tecnologías STEMCELL | 34411 | http://stemcell.com/products/aggrewell400.html |
| Etalón espaciado en el aire | LightMachinery | HF-16074-660 | https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/ |
| Solución de enjuague antiadherente | Tecnologías STEMCELL | 7010 | https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html |
| Incubadora de Etapa Superior de la Línea Audaz | Okolab | H301-NIKON-NZ100/200/500-N | https://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n |
| Láser Cobolt Flamenco-100 660 nm | Huebner | 0660-05-01-0100-700 | https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/ |
| Circulador confocal | LightMachinery | HF-13311 | N/A |
| Sistema de iluminación de fluorescencia D-LEDi | Nikon | MBF83000 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi |
| Módulo EPI-FL | Nikon | Ti2-LA-FL-3 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules |
| Fibronectina (humana) | YoProteínas | 663 | https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html |
| Gibco Dulbecco' s Eagle Medio Modificado (DMEM) | ThermoFisher | 11965092 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092 |
| Espectrómetro HyperFine Brillouin | LightMachinery | HF-8999-PK-660 | https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/ |
| Cubo de filtro cuádruple de banda LED-DA/FI/TR/Cy5-B | Nikon | MXR00753 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes |
| Células madre mesenquimales (MSC) | PromoCell | C-12974 | https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html |
| Etapa de traducción motorizada | Prior Scientific | H117E2NN | https://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33 |
| NucBlue y comercio; ReadyProbes y comercio en directo; reactivo (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605 |
| Objetivo, S Plan Fluor 20X NA 0,45, aire | Nikon | MRH08230 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708 |
| Cámara CMOS ORCA-Fusion | Hamamatsu | C14440-20UP | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html |
| PEG-dithiol, 2 kDa | PEGWorks Creativos | PLS-613 | https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g |
| cámara sCMOS | Soluciones de visión Teledyne | 01-IRIS-15-USB-M-16-C | https://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs |
| SPY555-actin | Espirocromo | CY-SC202 | https://spirochrome.com/product/spy555-actin/ |
| TemperatureApp | Software de control de temperatura | ||
| Péptido VPM, GCRDVPMSMRGGDRCG | GenScript | N/A | N/A |
| Microscopio Eclipse Ti-2A | Nikon | Eclipse Ti-2A | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series |
Referencias
- Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
- Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer a....
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Reimpresiones y permisos
