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Artículo de método

Preparación de filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis para comprender la patogénesis de la tuberculosis

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DOI:

10.3791/67540

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28 de marzo de 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

En este artículo

Resumen

Aquí, demostramos la preparación del filtrado de cultivo de Mtb (CF), que es el medio de crecimiento bacteriano que consiste en proteínas secretadas por las bacterias. Mtb segrega proteínas para modular la señalización del huésped y la respuesta inmunitaria, que son cruciales para la patogénesis. Los CFs preparados se analizan por espectrometría de masas para identificar todos los factores secretores.

Resumen

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) secreta muchas proteínas en el huésped para modular diversos procesos celulares, como la señalización del huésped, la respuesta inmunitaria, la apoptosis, etc., para mejorar la supervivencia. Si bien se ha dilucidado la función de algunos factores secretores, muchos aún no se han caracterizado. Por lo tanto, la investigación de la proteína secretora Mtb es un área esencial de investigación. Mtb secreta proteínas en el espacio extracitoplasmático con la ayuda de tres sistemas de secreción diferentes: general, arginina gemela y sistema de secreción especializado de tipo VII. Hay que preparar el secretoma para identificar nuevas moléculas secretoras y caracterizar funcionalmente los factores conocidos. Aquí, describimos el método para preparar el secretoma y la preparación de la muestra para la espectrometría de masas. La preparación del secretoma requiere el máximo cuidado para evitar la contaminación de las proteínas citosólicas, que se pueden monitorear mediante sondaje con anticuerpos contra proteínas de membrana, secretoras y citosólicas bien caracterizadas. El filtrado de cultivo así preparado se puede utilizar para diferentes propósitos, que incluyen la investigación de las propiedades de inmunomodulación del huésped.

Introducción

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), uno de los patógenos más mortíferos del mundo, infecta a individuos sanos a través de aerosoles transmitidos por una personainfectada al estornudar o toser. Una vez que ingresa a los pulmones, es engullido por los macrófagos alveolares, secuestrando el sistema inmunológico del huésped para sobrevivir. Entre los diversos mecanismos moduladores del huésped que tiene la Mtb para la supervivencia, los factores de virulencia secretora son uno de ellos. Las proteínas secretadas en el medio de cultivo por los bacilos durante su crecimiento se denominan proteínas de filtrado de cultivo (CF)2. Estas proteínas filtradas en cultivo ayudan a las bacterias a sobrevivir en condiciones adversas dentro de las células huésped. Mtb está equipado con tres tipos diferentes de sistemas de secreción: un sistema de secreción especializado de tipo VII (T7SS), un sistema de secreción de Sec general (sistema Sec) y un sistema de secreción de arginina doble (sistema Tat). T7SS es el sistema de secreción más exclusivo en actinobacterias, a diferencia del tipo I-VI en bacterias Gram-negativas3. La secreción de proteína desplegada a través de la membrana está involucrada principalmente en el sistema Sec, y las proteínas son reconocidas por una secuencia de señal N-terminal 4,5. Las proteínas plegadas o parcialmente plegadas son transportadas a través del sistema Tat, identificadas por una secuencia de señal N-terminal con un motivo de arginina gemela 6,7. Todavía no se ha determinado cómo el sistema Sec y Tat regula la secreción de proteínas.

Algunas proteínas filtradas de cultivo conocidas en Mtb que ayudan a resistir y sobrevivir al ataque oxidativo del huésped tras la infección son enzimas como KatG y SodA 8,9, necesarias para degradar las especies reactivas de oxígeno. Además, CFP10-ESAT6, un complejo proteico heterodimérico, desempeña un papel vital en la regulación de las respuestas a las citocinas, el escape bacteriano, la producción de ROS, etc.10. El locus RD1 está implicado en la modulación del sistema de secreción de tipo VII, que incluye la secreción de CFP10-ESAT6, y la deleción genética de cpf10-esat6 compromete la supervivencia de las bacterias en modelos de infección ex vivo e in vivo. Mycobacterium bovis La cepa de la vacuna BCG carece del locus RD1 responsable de la secreción de factores de virulencia y, por lo tanto, puede usarse como vacuna viva atenuada11. Diferentes procesos celulares inexplorados regulan estrictamente el proceso de secreción. Las proteínas filtradas del cultivo contienen factores promotores de la reanimación (RpF) que ayudan a las bacterias a recrecer desde el estado latente. Los factores promotores de la reanimación (Rpfs) son enzimas hidrolizantes de peptidoglicano que se sabe que desempeñan un papel en la latencia. Mtb codifica cinco genes similares a rpf (rpf A-E) que ayudan a las bacterias a recrecer desde la latencia, ya sea solas o interactuando con otrasproteínas. Las Rpfs se encuentran en el filtrado de cultivos bacterianos y se sabe que están involucradas en la virulencia de Mtb y la inmunidad del huésped13,14. Los genes rpf rpfE y rpfB, ampliamente estudiados, muestran inmunidad protectora in vitro13 y mejoran las respuestas inmunitarias in vivo. Por lo tanto, rpfE y rpfB se pueden utilizar como candidatos a vacunas Mtb.

La fosforilación reversible15 es una modificación postraduccional que altera diversos procesos celulares, homeostasis celular, división celular, etc. Por ejemplo, la fosforilación de CFP10 desempeña un importante papel regulador, donde tanto los mutantes fosfoablativos como los miméticos de CFP10 no logran restaurar el fenotipo observado en la cepa16 de deleción de CFP10-ESAT6. SecA2, por otro lado, es una proteína secretora involucrada en el daño del ADN de la célula huésped17. El secretoma del mutante SecA2 es suficiente para cambiar la respuesta inmunitaria del huésped y la cascada de señalización18,19. Por lo tanto, es esencial y emocionante investigar el secretoma de H37Rv y los mutantes Mtb, donde se eliminan los genes de las proteínas secretoras (datos no publicados), para obtener información sobre cómo afectan la inmunomodulación y la supervivencia del huésped.

Este informe se centra en tres aspectos: los pasos necesarios para la preparación del filtrado de cultivo de Mtb , el procesamiento de las muestras para la espectrometría de masas y la realización de experimentos ex vivo con filtrados de cultivo para examinar las funciones inmunomoduladoras. Estudios anteriores mostraron la identificación de proteínas filtradas de cultivo mediante electroforesis en gel 2D seguida de análisis por espectrometría de masas8. Las proteínas filtradas de cultivo de cepas sensibles y resistentes a los fármacos se identificaron mediante espectrometría de masas para obtener información sobre los cambios en el secretoma e identificar los factores de virulencia que pueden desempeñar un papel en la resistencia a los fármacos20. Hemos investigado previamente el secretoma y el fosfosecretoma de Mtb con la ayuda de espectrometría de masas16. Técnicas como la electroforesis en gel 2D son de bajo rendimiento y no se utilizan para investigar cambios globales en el proteoma o secretoma. Las proteínas filtradas de cultivo variarían según las cepas bacterianas, las etapas de las células en crecimiento e incluso en diversas condiciones de estrés. Dependiendo de diferentes situaciones, el cambio en las reservas de proteínas secretoras dentro de las células ofrecería explorar todo el secretoma de manera holística y proporcionar más información sobre el sistema de secreción bacteriana para intervenciones terapéuticas. Sería aún más atractivo observar el secretoma en las cepas knockouts o de agotamiento de los sistemas de secreción para obtener más información sobre las vías y los objetivos de cada vía de secreción. El tratamiento de las células con proteínas filtradas de cultivo en lugar de bacterias cambia los niveles de citocinas y otros factores inmunomoduladores17. Con la ayuda del estudio del secretoma, se pueden identificar nuevos factores de virulencia y su papel en la virulencia.

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Protocolo

NOTA: Aquí, utilizamos la cepa patógena de laboratorio H37Rv de Mtb. Se deben realizar los pasos necesarios para cultivar el cultivo bacteriano y aislar el sobrenadante del cultivo en el Laboratorio de Bioseguridad nivel 3 (BSL-3). Desde la reactivación del cultivo hasta la preparación del filtrado, se utiliza la instalación BSL-3.

1. Inoculación de cultivo de Mtb

  1. Preparación del área de trabajo en BSL-3
    1. Encienda la luz ultravioleta de la cabina de bioseguridad durante 10 minutos antes de usarla. Limpie la cabina de bioseguridad con etanol al 75% antes y después de su uso. Deseche los materiales utilizados en los contenedores de basura apropiados siguiendo las pautas de bioseguridad.
  2. Preparación de cultivos primarios y secundarios de Mtb H37Rv
    1. Tome el caldo de glicerol de -80 °C y descongele el caldo a temperatura ambiente. Utilice cuatro cepas independientes para los cuatrillizos biológicos.
    2. Tome 10 mL de medio 7H9 (Tabla 1) que contenga 10% de ADC (9 mL de medio 7H9 y 1 mL de ADC) en un matraz cónico de 100 mL esterilizado en autoclave con tapón de rosca.
      NOTA: 7H9 + ADC: 7H9 es un medio rico en nutrientes obtenido comercialmente, al que añadimos ADC (ADC: Albúmina, Dextrosa y Catalasa; Tabla 2). Tanto ADC como OADC se pueden utilizar para hacer crecer la cultura. Los matraces cónicos proporcionan más aireación al cultivo; Sin embargo, también se puede utilizar un matraz de cultivo de tejidos para cultivar las células bacterianas.
    3. Inocular todo el stock de glicerol a los medios de comunicación para revivir el cultivo, que se convierte en el cultivo primario. Tome un cultivo de Mtb en crecimiento de600 ~ 0.8 para hacer existencias de glicerol. Mezcle el 15% de glicerol y el cultivo de Mtb en crecimiento en un criovial y almacene a -80 °C.
    4. Incubar los matraces de cultivo a 37 °C en un agitador de incubadora durante 3-4 días a 100 rpm.
    5. Al5º día, mida la absorbancia a 600 nm (A600). Cuando los cultivos alcancen A600 ~ 0.8-1, use el cultivo para inocular cultivo secundario a A600 ~ 0.2 en 100 mL de 7H9 + 10% de medios ADC en un matraz de 500 mL. Realice los mismos pasos para las réplicas.
      1. Mida el A600 de la referencia cultural principal. Si el A600 es ~ 0,8, granule el cultivo por centrifugación a 2100 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 5 mL de 7H9 + 10% de medio ADC y mida el A600. Calcule la cantidad de inóculo que se agregará a 100 mL de cultivo secundario de A600 ~ 0.2. Por ejemplo, si se utiliza el A600 ~ 4, entonces se deben agregar 5 mL de ese cultivo a 100 mL de cultivo secundario fresco de 7H9 + 10% ADC de A600 ~ 0.2.
    6. Cultivarlos a 37 °C en un agitador de incubadora a 100 rpm durante 2-3 días hasta que OD A600 ~ 0,8.
    7. Extraiga 10 μL con una pipeta equipada con una punta de filtro y localice el cultivo en una placa de agar LB que no contenga antibióticos en la cubierta bacteriana. Incubar la placa a 37 °C durante 12-16 h para visualizar la contaminación bacteriana (si la hubiera). Deseche los cultivos y reviva los nuevos cultivos del experimento si se detecta alguna contaminación bacteriana.
  3. Crecimiento bacteriano en los medios de Sauton
    1. En el A600 ~ 0.8, inocule las bacterias a A600 ~ 0.2 en 100 mL de medios de Sauton en un matraz de 500 mL (Tabla 3) y crezca durante 3-4 días después de que el OD alcance ~ 0.8.
    2. Utilice cultivos cultivados hasta A600 ~ 0.8 en los medios de Sauton (el cultivo primario de Sauton) para la inoculación de cultivos que se utilizarán para la preparación del filtrado de cultivo.
      NOTA: 7H9 + ADC es un medio rico en nutrientes que contiene albúmina. La albúmina no se puede utilizar en el análisis del secretoma, ya que la albúmina puede enmascarar las proteínas filtradas del cultivo. Por lo tanto, los medios de Sauton se utilizan para preparar el filtrado de cultivo. Los medios de Sauton se preparan reconstituyendo los componentes mencionados en la Tabla 3.

2. Preparación de proteínas filtradas para cultivos de Mtb

  1. Centrifugación para sobrenadante de cultivo
    1. Utilice el cultivo primario de Sauton para inocular 300 mL del cultivo secundario de Sauton a A600 ~ 0,2. Cultive cultivos hasta que OD A600 sea ~0.4-0.5. Utilice cultivos de fase logarítmica temprana en crecimiento activo para evitar la contaminación por células muertas.
      1. Mida el OD del cultivo secundario. Si el diámetro exterior alcanza A600 ~ 0,8, granule el cultivo por centrifugación a 2.100 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio Sauton y vuelva a tomar el OD. Calcule la cantidad de inóculo que se añadirá a un cultivo de 300 ml de 0,2 DO a partir de la DE medida. Por ejemplo, si la OD es 8, se deben agregar 7,5 mL de ese cultivo a 300 mL de medios frescos de Sauton de 0,2 OD.
        NOTA: Cíñete a la OD mencionada para reducir la lisis celular y la contaminación por GroEL. GroEL es un chaperón y se expresa constitutivamente en las células bacterianas. Parte de la literatura mostró la presencia de GroEL en los filtrados de cultivo debido al estrés durante el crecimiento. Aquí, estamos utilizando los medios de Sauton para la preparación del filtrado de cultivo, que proporciona un estrés leve a las células; por lo tanto, GroEL puede presentarse en el filtrado de cultivo. Además, si la OD del cultivo es superior a 1, se produciría lisis celular, lo que llevaría a la contaminación de GroEL en el filtrado del cultivo.
    2. Granular 300 mL de cultivos en crecimiento en 6 tubos de 50 mL a 2.100 x g durante 10 min a 4 °C (Figura 1A).
    3. Extraer 45 mL de sobrenadante, dejando el pellet intacto, con una pipeta serológica de 25 mL a un tubo nuevo en cada caso. Mantenga el pellet a un lado para la preparación del lisado de células enteras (WCL).
    4. Repetir la centrifugación a 2.100 x g durante 10 min a 4 °C. Extraiga 40 mL de sobrenadante (dejando 5 mL de cultivo intactos) con una pipeta serológica de 25 mL a un tubo nuevo y repita el paso de centrifugación.
    5. Extraiga 35 ml del sobrenadante en un tubo nuevo y filtre el sobrenadante del cultivo con un filtro de jeringa de 0,2 μm. Filtre en un tubo nuevo para eliminar la contaminación bacteriana patógena. A partir de 300 mL de cultivo, se recuperan 210 mL de filtrado de cultivo por réplica.
      NOTA: El filtro que se ha utilizado aquí para filtrar el filtrado de cultivo es un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm (tipo SY25PL-S).
    6. Después de la filtración del filtrado de cultivo, inocular 1 mL de alícuota del filtrado de cultivo filtrado en una placa de agar e incubar en la incubadora a 37 °C durante 4 semanas para garantizar la presencia de otra contaminación bacteriana patógena en el filtrado de cultivo. Tome 1 mL de alícuota del lisado de células enteras (WCL) y siga las mismas medidas de seguridad.
    7. Limpie los tubos de muestra con etanol al 75% y sáquelos de BSL-3 a través de una caja de paso.
  2. Preparación de lisado de células enteras (WCL)
    1. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de 1x PBSG que contenga fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1x cóctel de inhibidores de la proteasa, y transfiera el lisado a tubos de batido de perlas con tapón de rosca de 2 mL que contengan 1/3 devolumen de perlas de circonio de 0,1 mm.
      NOTA: El 1x PBSG se compone de 1x PBS + 5% de glicerol. Tome una relación de peso de pellet a tampón de 1:3.
    2. Lisis de las muestras batiéndolas en un mini batidor de cuentas: 1 min de batido de perlas seguido de 2 min de incubación en hielo. Repita esto 8 veces.
    3. Centrifugar los tubos a 18.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml y manténgalo en hielo.
    4. Repita el paso de centrifugación. Pase el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm para eliminar la contaminación bacteriana patógena.
      NOTA: El filtro utilizado aquí para filtrar el filtrado de cultivo es un filtro de jeringa estéril de 0,22 mm (tipo SY25PL-S).
    5. Limpie las muestras con etanol al 75% y sáquelas de BSL-3 a través de una caja de paso. Compruebe las concentraciones de lisados utilizando el kit de ensayo BCA, como se menciona a continuación. Almacene los lisados a -80 °C.
  3. Concentre las proteínas filtradas del cultivo utilizando unidades de filtro centrífugo.
    1. Concentrar 210 mL de proteínas filtradas de cultivo Mtb con la ayuda de unidades de filtro centrífugo. Utilice tubos de unidad de filtro centrífugo de 3 kDa y 15 mL (centrícones) para concentrar el filtrado de cultivo en ~ 1 mL (Figura 1A). Los tubos de la unidad de filtro centrífugo de 3 kDa retienen proteínas del mismo tamaño o mayores que 3 kDa.
    2. Añadir aproximadamente 15 mL de cada réplica de filtrado de cultivo en un tubo de centrícola y centrifugar a 2.100 x g durante 1 h a 4 °C.
    3. Deseche el flujo según las normas y repita el paso 2.3.2 durante 15x-16x hasta 210 mL del concentrado de filtrado de cultivo a ~ 1 mL.
    4. Alícuota 100 μL del cultivo concentrado filtra las proteínas en diez tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas y estima la concentración de proteínas utilizando un kit de BCA.
  4. Estimación de proteínas concentradas
    1. Estimar la concentración de proteína con respecto a BSA como estándar. Utilice 1 μg, 2 μg, 3 μg y 4 μg de BSA en un volumen de 25 μL por duplicados. Si la muestra no estaba diluida, utilice una muestra diluida 5 veces (en PBS) en un volumen de 25 μL por duplicado para la estimación. Las estimaciones se realizan en placas de 96 pozos. Utilice un control sin muestra (en blanco) que contenga 25 μL de PBS.
    2. Añadir 175 μL de reactivo mezclado según las instrucciones del fabricante. Mezclar las muestras con la ayuda de una pipeta multicanal e incubar a 37 °C durante 1 h. Mida las lecturas a 562 nm con un lector ELISA. Deduzca los valores de los valores en blanco para obtener los valores de BSA y las muestras.
    3. Ajuste la curva estándar a la curva de regresión lineal y estime las muestras con respecto al estándar. Siga el kit de BCA para obtener el manual de estimación de proteínas.

3. Confirmación del cultivo de proteínas filtradas utilizando diferentes marcadores

  1. Detección de proteínas por tinción de Coomassie
    1. Para confirmar la presencia de las proteínas en el filtrado de cultivo, tome 30 μg de proteína y resuelva con electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE; Tabla 4).
      NOTA: Siga la descripción de la tabla para hacer que las soluciones de tinción y decoloración SDS-PAGE, Coomassie y decolorante sean tampones.
    2. Añadir 20 mL de solución de tinción de Coomassie (Tabla 5) al gel e incubar durante 30 min en balancines a temperatura ambiente. Deseche la solución para manchar.
    3. Agregue 30 mL de solución decolorante (Tabla 6) al gel e incube durante 30 min en un balancín a temperatura ambiente. Deseche la solución decolorante y agregue una nueva solución decolorante. Repita hasta que el gel se manche correctamente.
    4. Verifique la raya de proteína en el iluminador trans (Figura 1B). Dado que la proteína filtrada de cultivo contiene varias proteínas, se puede ver una raya de bandas de proteínas en el gel después de la decoloración (Figura 1B).
  2. Confirmación de Western blot para el marcador de proteína secretado
    1. Utilice el anticuerpo de la proteína secretada para comprobar la presencia de la proteína secretada en el filtrado de cultivo. Ag85B (ab43019) es una conocida proteína secretada de Mtb en el filtrado de cultivo y está presente en el citosol; el anticuerpo Ag85B (concentración 5 mg/mL) (dilución 1:5000 en BSA al 5%) se utiliza como control positivo para la proteína secretada.
    2. Cargue un WCL con las proteínas filtradas del cultivo para diferenciar entre las fracciones citosólicas/de membrana y las proteínas secretadas. Ag85B es citosólico y secretado, por lo que debería estar presente en ambas fracciones; por otro lado, se sabe que el PknB está localizado en la membrana y no está presente en el filtrado del cultivo.
    3. Determine la concentración de proteínas en el filtrado de WCL/cultivo con la ayuda de un kit de BCA. Mezclar 30 μg de filtrado de WCL/cultivo con tampón 2x-lamelli en un volumen de 30 mL (Tabla 7). Resuelva las muestras en 10% SDS-PAGE para PknB y 12% SDS-PAGE para Ag85B hasta que el frente de tinte llegue al fondo utilizando el tampón de drenaje de gel SDS (Tabla 8). No dejes que el tinte se escurra del gel.
      NOTA: El tamaño del Ag85B es de ~35 kDa, por lo que se utiliza el 12 % de SDS-PAGE.
    4. Corte una membrana de nitrocelulosa de 9 cm x 6 cm y 0,2 μm para la transferencia (Tabla 9) de la proteína del gel a la membrana. Configure la transferencia usando un casete de transferencia, remojando los casetes, las almohadillas de espuma, el papel secante, el gel y la membrana en 1 tampón de transferencia helado.
    5. Coloque la almohadilla de espuma en un lado del casete, luego coloque un papel secante, coloque el gel, coloque la membrana de nitrocelulosa encima del gel, vuelva a colocar un papel secante y, por último, coloque otra almohadilla de espuma y cierre el soporte del casete. Coloque el soporte de casete en el tanque de transferencia de modo que el lado de la membrana mire hacia el ánodo y el lado del gel mire hacia el cátodo.
    6. Conecte el cátodo y el cable del ánodo al tanque para cerrar la configuración y ajústelo a una corriente de 120 mA durante 120 minutos. Comience a ejecutar la transferencia en una cámara frigorífica.
    7. Coloque la membrana en una pequeña caja de plástico después de que termine la transferencia. Bloquee la membrana con 10 mL de solución de BSA al 5% hecha en 1x PBST20 para reducir la unión inespecífica durante 1 h a temperatura ambiente en el balancín.
    8. Retire la solución de bloqueo, agregue 5-10 mL de anticuerpo primario, que es el anticuerpo Ag85B anti-ratón (diluciones 1:5,000 en solución BSA al 5%), e incube a 4 °C durante la noche en un balancín. Almacene el anticuerpo a -20 °C y reutilícelo hasta 3 veces.
    9. Retire el anticuerpo primario, agregue 5-10 mL de 1x PBST20 y lave la membrana durante 8 min a temperatura ambiente agitando vigorosamente. Retire el primer lavado, agregue 5-10 mL de 1x PBST20 nuevamente y lave. Repita esto 2 veces.
    10. Añadir 5-10 mL de 1x PBST20 que contenga anticuerpo secundario, que es un anticuerpo conjugado anti-peroxidasa redox de caballo (HRP) de ratón (dilución 1:10.000), e incubar durante 2 h a temperatura ambiente en un balancín.
    11. Lave la membrana después del anticuerpo secundario siguiendo el paso 3.2.9. Agregue una cantidad igual de sustrato HRP y potenciador para desarrollar la membrana bajo un quimioluminómetro (Figura 1C).
      NOTA: Para confirmar la ausencia de contaminación por proteínas citosólicas, probamos el Western blot con un anticuerpo anti-PknB (Figura 1C). El anticuerpo se generó en el Instituto Nacional de Inmunología, un animalario, contra el dominio extracitoplasmático purificado de PknB. Se puede observar la banda de PknB en la WCL, no en los filtrados de cultivo, y PknB es únicamente citosólico y unido a la membrana y no debe estar presente en el filtrado de cultivo.

4. Preparación de muestras para espectrometría de masas

  1. Realizar la digestión de proteínas en solución mediante tripsina.
    1. Tome 100 μg de proteína filtrada de cultivo, agregue 6 veces el volumen de acetona helada y manténgala a -20 °C durante la noche.
      NOTA: Utilice artículos de vidrio para preparar todos los reactivos para la muestra de espectrometría de masas. Utilice tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas y puntas de unión baja en proteínas. No utilice material plástico para evitar la contaminación de polímeros en el análisis de espectrometría de masas.
    2. Precipitar las proteínas por centrifugación a 18.000 x g a 4 °C durante 30 min. Deseche el sobrenadante.
    3. Lavar el pellet con 500 μL de acetona, pellet a 18.000 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Retire la acetona residual con la ayuda de un concentrador de vacío.
    4. Añadir 20 μL de urea 8 M disuelta en bicarbonato amónico 25 mM (2 M de caldo preparado en agua MS). Agite las muestras e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    5. Ad 60 μL de bicarbonato amónico de 25 mM para diluir 8 M de urea en 2 M. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Añadir 4 μL de TCEP (concentración final de 10 mM hecha en bicarbonato amónico de 25 mM) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min, agitando a 1.800 x g.
    6. Añadir 4 μL de IAA (concentración final de 25 mM hecha en bicarbonato amónico de 25 mM) e incubar a temperatura ambiente durante 30 min, agitando a 1.800 x g en la oscuridad. Añadir 110 μL de bicarbonato amónico de 25 mM.
    7. Agregue tripsina (1:20; Tripsina: proteína en μg) a la solución y mantenerla a 37 °C, agitándola a 300 rpm, para la digestión durante la noche (Figura 2). Detenga la reacción de digestión agregando un 10% de TFA (ácido trifluoroacético). Acelera el vacío de las muestras por completo para que se sequen.
  2. Desalinización de la muestra
    1. Añadir 100 μL de 5% ACN + 0,1% TFA a los péptidos digeridos. Vórtice durante 30 min a 1.500 rpm a temperatura ambiente.
    2. Centrifugar a 18.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Tome el sobrenadante (péptido) sin tocar el pellet en tubos de microcentrífuga frescos y proceda con la desalinización. Prepare todas las soluciones de lavado y elución antes de la etapa de desalinización.
    3. Equilibre la punta de la columna C-18 con 100 μL de 100% ACN + 0,1% TFA pipeteando la solución y repitiendo el proceso 5 veces.
    4. Añadir 100 μL de 50% ACN + 0,1% TFA y repetir el proceso 5 veces. Añadir 100 μL de 5% ACN + 0,1% TFA y repetir el proceso 5 veces.
    5. Permita que se produzca la unión del péptido en la punta de la columna C-18 pipeteando 30 veces. Mantenga la solución a -20 °C hasta que la muestra se procese para la espectrometría de masas. Ahora, el péptido está unido a la columna C-18.
    6. Lave la columna C-18 con 100 μL de agua de grado MS + 0,1% de TFA mediante pipeteo y repita el proceso 5 veces.
    7. Lavar la columna C-18 con 100 μL de 5% ACN + 0,1% TFA mediante pipeteo y repetir el proceso 5 veces. Eluir los péptidos de la columna C-18 en 100 μL de 50% ACN + 0,1% TFA pipeteando 30x (Figura 2).
      NOTA: Después de la elución, la punta de columna C-18 se puede almacenar a 4 °C hasta que se realice la espectrometría de masas.
    8. Aspire a toda velocidad el péptido eluido por completo y guárdelo a -20 °C hasta que la muestra se administre para la espectrometría de masas.
  3. Inyección de las muestras peptídicas en una espectrometría de masas.
    1. Añada 20 μL de solución A (proporcionada por la instalación de espectrometría de masas) a las muestras de péptidos secos. Agitar las muestras durante 30 min y centrifugar durante 90 min a 4 °C.
    2. Inyecte 20 μL de la muestra en la máquina de espectrometría de masas para una ejecución de gradiente de 90 minutos.

5. Análisis de datos de proteínas secretadas presentes en el filtrado de cultivo

  1. Identificación de proteínas
    1. Analice muestras de proteómica utilizando el espectrómetro de masas Quadrupole. Consulte los espectros obtenidos en la base de datos Mtb H37Rv UniprotKB.
    2. Establezca las tolerancias de masa del precursor y del fragmento en 10 ppm y 0,5 Da. Ajuste la enzima a tripsina con un valor máximo de escisión perdida de dos.
    3. Utilice el software del proteoma con Sequest como algoritmo de búsqueda con la carbamidometilación de la cisteína como modificación fija.
    4. Identifique todas las coincidencias de espectro peptídico (PSM) con una tasa de falsos descubrimientos del 1 %. Aplique la configuración predeterminada para todos los demás parámetros.
    5. Mapee los archivos de espectrometría de masas sin procesar de la secuencia peptídica con el ID UniProt de las proteínas Mtb respectivas. Enumere todas las proteínas Mtb, sus ID Uniprot y la clasificación funcional utilizando la base de datos Mycobrowser.
    6. Para un análisis más detallado, asigne los ID de UniProt de las proteínas identificadas a su respectivo número Rv . Deposite los datos del secretoma de espectrometría de masas en el Consorcio ProteomeXchange a través del socio PRIDE.

6. Tratamiento de H37Rv con proteína filtrada de cultivo para comprobar el cambio en la señalización del huésped

  1. Aislamiento de macrófagos peritoneales de ratones.
    NOTA: Siga la referencia21 para el aislamiento de macrófagos peritoneales, la siembra de las células y la infección.
    1. Inyectar a ratones Balb/c (4-6 semanas de edad) 1 mL de tioglicolato al 4% y aislar macrófagos peritoneales del peritoneo del ratón al4º día de la infección21 (Figura 3).
    2. Recoja las células de macrófagos inyectando 1x PBS en el peritoneo del ratón. Centrifugar las células a 1.800 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y añadir 5 mL de medio 1640-RPMI suplementado con 10% de FBS (suero fetal bovino; medio completo) y 1x pen-strep (antibióticos).
    3. Siembre 3 x 105 celdas por pocillo en placas de 24 pocillos e incube las placas en una incubadora a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, cambie el medio por un medio nuevo y completo, y las células estarán listas para la infección o el tratamiento con proteínas filtradas de cultivo.
  2. Tratamiento de macrófagos peritoneales con proteínas filtradas de cultivo
    1. Lleve las células de macrófagos a BSL-3 y manténgalas en la incubadora. Tratar las células con 1 mg/mL de proteínas filtradas de cultivo (Figura 3). Recolectar las células en diferentes puntos de tiempo de 4 h, 24 h y 48 h de tratamiento con filtrado post-cultivo.
      1. Siembre las células de macrófagos aisladas en placas de 24 pocillos por triplicado en cada punto de tiempo. Tratar las células con 1 mg/mL de proteínas filtradas de cultivo e incubar a 37 °C en la incubadora en presencia de CO2. Coseche las células en tres puntos de tiempo, 4 h, 24 h y 48 h después del tratamiento.
      2. Tratar las células con i) tampón 2x-laminilla para hacer lisados de células macrófagos y comprobar la presencia de diferentes marcadores de células huésped mediante la realización de Western blot, y ii) diferentes tampones para los ensayos inmunológicos proporcionados por los fabricantes junto con los kits.
    2. Prepare los lisados celulares del huésped y verifique la presencia de diferentes marcadores, el perfil de citocinas de las células huésped y las expresiones de proteínas de varias vías de señalización en el cultivo de células de macrófagos tratadas con filtrado.
      NOTA: Si un laboratorio tiene un mutante de reemplazo génico de la proteína de la vía secretora, se pueden usar filtrados de cultivo preparados a partir de Mtb H37Rv y el mutante Mtb para evaluar su impacto en los parámetros inmunomoduladores del huésped.

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Resultados

En este protocolo, demostramos el aislamiento de proteínas filtradas de cultivo de micobacterias (Figura 1A). A continuación, se analizaron las proteínas del filtrado de cultivo en busca de los diferentes marcadores para confirmar el aislamiento del filtrado de cultivo. Como se mencionó en el protocolo, se realizó una tinción de Coomassie para verificar la carga de proteínas. Se puede observar una banda de proteína rayada en la fracción WCL (en el último carril ...

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Discusión

Una de las áreas críticas de investigación se refiere a la comprensión de la patogénesis de la Mtb y al desarrollo de diagnósticos y vacunas eficaces22,23. El aislamiento de las proteínas filtradas del cultivo a partir de medios de cultivo Mtb es un proceso que permite la identificación de los factores de virulencia secretados por el patógeno. La investigación del papel de las proteínas secretoras en la modulaci...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,2 y micro; m Filtros de jeringamdiSYPL0601MNXX204
0.2µ m Membrana de nitrocelulosaAmersham 10600001
37% HClMerckH1758
AcetonaEMPLURA MERCKSL9F690866
AcetonitriloSigma-Aldrich34851-2L
AcrilamidaBIORAD1610107
AlbúminaBio Basic CanadáNº de gato: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
Biocarbonato de amonioSigma-Aldrich09830-500G
Persulpahte de amonioSigma-AldrichA3678-100G
anti-Ag85BAbcamAB43019
anti-ratón anticuerpo secundario conjugado HRPThermo Fischer62-6520
AsparaginaSigma-AldrichA0884-500G
bis-acrilamidaSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 columnaThermo FischerSEM SS18V
Catalase Sigma-AldrichC1345
Ácido cítricoSigma-AldrichC0759-500G
DextrosaSigma-AldrichG7021-1KG
Difco Caldo Middle brook 7H9   Fisher Scientific271310
Citrato de amonio férrico (III)Sigma-AldrichF5879-100G
Ácido fórmico 98-100%MerckZ0823704246
Ácido acético glacial 100%MerckCD0C700160
GlicinaSigma-AldrichG8898-1KG
GlicinaSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Inmovilización Sustrato HRP quimioluminiscente occidentalMerckWBKLS0500
YodoacetamidaAmershamRPN6302V
Sulpatode magnesio Sigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
Ácido oleicoSigmaNº de cat: O1008
Kit de ensayo de proteínas BCA de PierceThermo Fischer23225
Pierce Tripsina ProtasaThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (experimentos de proteómica: secuenciación de péptidos, identificación y cuantificación de proteínas)Thermo Fischer Scientific
Cloruro de sodioSigmaCat No: S3014
Cloruro de sodioSigma-AldrichS7773-1KG
Dodecil sulfato de sodioSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt base
UreaMP Bio 194857
de datos de proteínas

Referencias

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  23. Prasad, T. S., et al. Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis. Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).
  24. Miller, B. K., et al. Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway. Elife. 8, e40063(2019).

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