Describimos un protocolo simple para extirpar el estatocisto y los tejidos asociados en el ctenóforo Mnemiopsis leidyi, que es susceptible de imágenes en vivo.
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Artículo de método
Extirpación quirúrgica de un órgano sensorial complejo en ctenóforos altamente regenerativos
En este artículo
Resumen
Resumen
El ctenóforo Mnemiopsis leidyi es un modelo animal clásico de regeneración de todo el cuerpo. El aumento de la manejabilidad de muchas técnicas de laboratorio y su ubicación filogenética como el probable grupo hermano de los metazoos restantes ha llevado a una reciente renovación del interés científico en trabajar con ctenóforos. Pueden regenerar cualquier órgano o tipo de célula faltante, incluida la regeneración completa de todo el cuerpo a partir de un fragmento tan pequeño como ~ 15% del cuerpo, en el transcurso de unos pocos días. Como la mayoría de los ctenóforos, M. leidyi tiene un órgano sensible a la gravedad ubicado aboralmente que vincula la entrada sensorial con la salida motora para controlar la posición y orientación de su cuerpo. Este protocolo demuestra la extirpación quirúrgica del complejo de órganos aborales (AO) y las estructuras asociadas en M. leidyi junto con métodos de cultivo, manipulación y montaje apropiados para obtener imágenes de los procesos de cicatrización y regeneración de heridas que tienen lugar en las siguientes horas o días. Estas técnicas sencillas son ampliamente adaptables a diferentes paradigmas experimentales y contextos de laboratorio.
Introducción
Los ctenóforos, también conocidos como medusas de peine, son cosmopolitas para los entornos marinos de la Tierra y pueden ser actores importantes en los ecosistemas, particularmente como parte de la red alimentaria. El ctenóforo Mnemiopsis leidyi es un modelo animal histórico y cada vez más popular de regeneración de cuerpo entero 1,2. Su capacidad para regenerar cualquier órgano o tipo de célula faltante surge hacia el final de la embriogénesis y persiste a lo largo de su vida postembrionaria 3,4 (~0,1 a >1.000 mm de tamaño corporal). También son transparentes durante toda su vida y son susceptibles de diversas técnicas de imagen en vivo y fijas. El ancestro común más reciente de todos los ctenóforos tenía muchos tipos de células y órganos complejos; la mayoría de los ctenóforos existentes poseen la mayoría de estos durante al menos una etapa de la vida: un órgano aboral sensible a la gravedad (históricamente llamado órgano apical y aquí llamado órgano aboral, AO), estructuras locomotoras especializadas compuestas de macrocilios altamente organizados que laten de manera coordinada (filas de peine), tentáculos de alimentación retráctiles y fotocitos que se bioluminiscen en respuesta a estímulos nocivos (Figura 1).
A pesar de sus numerosos tipos de células y comportamientos complejos y dependientes del contexto, un sólido cuerpo de datos genómicos respalda la ubicación de los ctenóforos como el probable grupo hermano de todos los demás animales vivos 5,6,7,8. Las principales diferencias en la base celular y funcional del sistema nervioso de los ctenóforos de otros animales que poseen un sistema nervioso (bilaterianos y cnidarios) han sugerido la hipótesis de que el sistema nervioso de los ctenóforos representa un origen independiente; sin embargo, esto sigue siendo incierto 9,10,11,12.
El complejo de órganos sensoriales aborales incluye el estatocisto, que incluye muchos tipos de células, incluidos múltiples tipos de células neurosensoriales putativas 13,14,15,16,17,18, y está bajo mantenimiento constante en ctenóforos no manipulados. Las células mecanosensoriales tienen grandes haces ciliares, que son desviados por un estatolito formado por células biomineralizadas (llamadas litocitos) para detectar la gravedad. Dos "campos polares", que contienen estructuras sensoriales putativas de función desconocida14 y probables células fotosensoriales16, son adyacentes al estatocisto.
La investigación experimental de la capacidad regenerativa de M. leidyi ha abarcado desde los animales más pequeños en la transición de embrión a cría (~100 μm) hasta los adultos macroscópicos de vida libre (>2 cm). M. leidyi de ~ 1 mm de diámetro corporal son lo suficientemente grandes como para permitir la manipulación quirúrgica manual sin instrumentos especiales como micromanipuladores, pero son lo suficientemente pequeños como para montarse en un portaobjetos de microscopio estándar para obtener imágenes con objetivos de alta potencia. Este protocolo demuestra la extirpación quirúrgica del órgano sensorial aboral y las estructuras asociadas, junto con métodos de cultivo e imágenes apropiados para documentar los procesos de cicatrización y regeneración de heridas que tienen lugar en las siguientes horas o días.
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Protocolo
1. Prepare herramientas y suministros
- Con un mechero Bunsen estándar, tire a mano de las agujas de disección de vidrio de las micropipetas capilares de vidrio. Para animales de más de 1 mm, utilice micropipetas de vidrio sodocálcico calibradas destinadas a la manipulación de líquidos.
NOTA: El tamaño de 100 μl funciona bien en el rango focal de 0,5-3 mm.- Establezca un cono de llama azul afilado en el mechero Bunsen.
- Sostenga el punto central de la pipeta de vidrio en la llama hasta que se ablande lo suficiente como para moverse bajo una presión suave.
- Retire la pipeta de la llama e inmediatamente separe los dos lados para crear una aguja corta y fuerte.
NOTA: La aguja de vidrio se puede volver a fundir si no se obtuvo un resultado satisfactorio en el primer intento, y las agujas rotas se pueden guardar y volver a tirar. Consulte la Figura 2 para ver ejemplos de agujas utilizables e inutilizables extraídas por este método.
ALTERNATIVA: Las agujas de 26 G 1/2 pulgada también funcionan bien, especialmente en el extremo más grande del rango de tamaño focal.
- Prepare agua de mar estéril pasando agua de mar natural o artificial a través de un filtro de 0,22 μm.
- Cree pipetas de medición.
- Con unas tijeras afiladas o una hoja de afeitar, corte una pipeta de transferencia de plástico para producir una abertura con el diámetro interno del tamaño preferido. Tenga preparada al menos una pipeta para la parte superior del rango deseado y otra para la parte inferior del rango deseado. Consulte la Figura 3 para ver un ejemplo de conjunto de pipetas de medición.
NOTA: Estas pipetas funcionan bien hasta ~8 mm. También es posible estimar el tamaño con un micrómetro o herramientas de medición a partir de fotografías.
- Con unas tijeras afiladas o una hoja de afeitar, corte una pipeta de transferencia de plástico para producir una abertura con el diámetro interno del tamaño preferido. Tenga preparada al menos una pipeta para la parte superior del rango deseado y otra para la parte inferior del rango deseado. Consulte la Figura 3 para ver un ejemplo de conjunto de pipetas de medición.
2. Prepara a los animales para el experimento
- Seleccione individuos morfológicamente normales del tamaño y la etapa deseados.
NOTA: Encontramos que los animales de ~0,5-3 mm de diámetro son óptimos para el montaje en toboganes. Compruebe que los animales no caben en la pipeta de tamaño inferior de la gama, pero sí en la pipeta de tamaño superior de la gama. - Matar de hambre a los animales de experimentación durante 8-16 h.
NOTA: Si bien M. leidyi es ópticamente transparente y no altamente autofluorescente, los alimentos que circulan a través de su sistema digestivo son generalmente opacos y, a menudo, autofluorescentes.
3. Realizar cortes
- Utilice una pipeta de transferencia más ancha que el tamaño corporal del animal de experimentación para transferirla a un plato de poliestireno de 35 mm que contenga agua de mar estéril.
- Visualice la muestra con el microscopio de disección. Haga rodar un animal sobre su lado adesofágico (Figura 1). Esta vista brinda el acceso más fácil para extirpar el órgano aboral. Concéntrese en el órgano aboral.
NOTA: El aumento más útil puede variar según el tamaño del animal y la preferencia del usuario. En general, el aumento de 12-20x funciona bien. - Sostenga suavemente al animal en su lugar con una aguja de vidrio usando la mano no dominante.
- Con la mano dominante, inserte la punta de una aguja ligeramente debajo del órgano aboral. Ingrese oblicuamente para hacer un corte desde un borde visible del órgano aboral hasta debajo de su base. Retire la aguja y haga un segundo corte para extraer un trozo de tejido en forma de cuña que contiene todas las estructuras del órgano aboral (véase la figura 4, panel superior). Examine cuidadosamente al animal y el tejido extirpado para asegurarse de que la operación haya sido exitosa.
- Utilice la misma pipeta de transferencia para mover el animal recién cortado a un plato fresco que contenga agua de mar estéril.
NOTA: La herida se cerrará rápidamente, por lo que dependiendo de los objetivos experimentales (como para múltiples muestras de regeneración sincrónica o para obtener imágenes de las primeras etapas de curación y regeneración), se debe actuar rápidamente para generar varias muestras. Use un temporizador para limitar el tiempo quirúrgico y mantener las cohortes de animales en regeneración más juntas.
4. Comprueba que los cortes son correctos
NOTA: Incluso si se revisa cuidadosamente bajo el microscopio de disección, ocasionalmente es posible pasar por alto errores quirúrgicos.
- Siga los pasos de montaje a continuación para montar temporalmente a cada individuo posquirúrgico en un portaobjetos de vidrio para verificar bajo un microscopio compuesto con DIC que todas las estructuras previstas se eliminaron correctamente. Realice esta comprobación incluso si no está realizando más imágenes en este momento.
NOTA: Las excelentes capacidades curativas de los ctenóforos los prestan bien a los experimentos de injerto; siempre retiramos los órganos aborales extirpados del recipiente de cultivo para evitar la posibilidad de que los lados cortados de un AO extraído y el resto del animal del que se extrajo se peguen y se fusionen.
Si no procede directamente a la obtención de imágenes a largo plazo, no selle el portaobjetos. Esto facilitará la rápida recuperación y el retorno al cultivo de este animal de experimentación. Se recomienda verificar la precisión quirúrgica con grandes aumentos. En particular, el estatolita se puede sacar de la cúpula sin completar la cirugía.
5. Imágenes en vivo
- Montura
- Trate un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar con un agente silanizante, como un repelente al agua para el tratamiento del vidrio, y deje que se seque por completo.
- Transfiera un animal posquirúrgico a un portaobjetos preparado con una pipeta de transferencia. Confirme que el agua gotea con el animal adentro.
- Coloque una pequeña cantidad de plastilina (~ 1.5 mg) en cada esquina de un cubreobjetos para formar "pies" que servirán como espaciadores para levantar el cubreobjetos del animal.
- Coloque suavemente el cubreobjetos, con arcilla hacia abajo, encima del animal. Sosteniendo cada esquina del cubreobjetos, enrolle al animal en posición para obtener imágenes. Presione hacia abajo para comprimir ligeramente al animal, manteniéndolo en su lugar. Vuelva a colocar la muestra tanto como sea necesario para llegar a una vista satisfactoria.
- Para obtener imágenes de más de ~ 30 min, aplique una capa delgada de vaselina en cada borde del cubreobjetos para evitar que la muestra se seque.
NOTA: M. leidyi montado de esta manera se puede recuperar fácilmente para un cultivo adicional u otros ensayos. Sin embargo, los animales generalmente se liberarán y se reposicionarán en 1-2 h, por lo que una captura continua de lapso de tiempo de más de 2 h requeriría un enfoque de imagen diferente.
6. Cultivo
- Condiciones de cultivo de cidípidos
- Cultive animales manipulados quirúrgicamente y controles en agua de mar natural o artificial filtrada cerca de la temperatura ambiente. Utilice una incubadora a 20-22 °C para garantizar resultados consistentes.
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Resultados
La M . leidyi en estadio cidípido generalmente completa el cierre de la herida dentro de ~ 20 minutos después de la lesión (Figura 4 y Figura 5), mientras que la regeneración completa del órgano puede demorar de 1 a 3 días. Este momento tiene cierta variabilidad biológica, pero casi invariablemente se completa a las 72 h después de la cirugía (Figura 6).
La extirpación quirúrgica de células y mes...
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Discusión
Se podrían realizar experimentos similares en cualquier tamaño de M. leidyi deseado; La morfogénesis del órgano se completa simultáneamente con el inicio de la capacidad regenerativa4. Los animales pueden ser recolectados en la naturaleza19 o criados en el laboratorio20,21. Si se desea un tamaño corporal particular, se puede permitir que los animales desoven y que la descen...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Jovita Joseph.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.2 μ m Filtro de jeringa SFCA | Thermo/Nalgene | 723-2520 | Crear agua de mar estéril |
| Placa de Petri de poliestireno de 35 mm | Halcón/Corning | 351008 | realizar cortes; Cultivo de animales pequeños |
| Jeringa Luer-Lock desechable de 60 ml | Suministros BH | BH60LL | Crear agua de mar estéril |
| Pipetas de vidrio calibradas, 100 μ L | Drummond | 2-000-100 | realizar cortes |
| Cubrevasos, #1.5, 18 mm cuadrado | VWR | 16004-326 | Montura para imágenes |
| Ctenóforos | Especímenes del Golfo | animales vivos | |
| Portaobjetos de depresión de vidrio de doble cavidad, 1,3 mm | VWR | 470200-930 | Montura para imágenes |
| portaobjetos de microscopio de vidrio | VWR | 16004-398 | Montura para imágenes |
| Sal marina oceánica instantánea | Océano instantáneo | medio de cultivo animal | |
| mini regla | Ted Pella | 13623 | medir pipetas de plástico |
| Plastilina (plastilina) | Pepy Plastilina | Montura para imágenes | |
| Jalea de petroelum | Vaselina | Montura para imágenes | |
| pipetas de transferencia de plástico (tamaños variados) | Cole-Parmer | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | Mover animales pequeños |
| Tratamiento de vidrio Rain-X | Lluvia-X | Portaobjetos de microscopio de silanización | |
| gobernante | Westcott | 10564 | medir pipetas de plástico |
| tijeras | OXO | cortar pipetas de plástico |
Referencias
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