Método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias

Summary

Presentamos un método para un modelo de patogénesis fúngica que preserva la posición natural de las esporas de hongos en las vías respiratorias pulmonares para su análisis mediante microscopía fluorescente.

Abstract

Los hongos infectan a los humanos cuando las esporas ambientales se inhalan en los pulmones. El pulmón es un órgano heterogéneo. Las vías respiratorias conductoras, incluidos los bronquios y los bronquiolos, se ramifican hasta terminar en el espacio aéreo alveolar donde se produce el intercambio gaseoso. Las infecciones que se originan en los bronquiolos o alvéolos provocan distintas respuestas del huésped y manifestaciones de la enfermedad. Por lo tanto, comprender con precisión dónde se localizan naturalmente las esporas en los pulmones, particularmente poco después de la infección, amplía las oportunidades para la investigación de las interacciones huésped-patógeno. En este trabajo se detalla un análisis in situ de pulmones de ratones infectados con artroconidios por Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Los métodos convencionales para la preservación histológica implican el inflado líquido de las vías respiratorias con una solución fijadora, que desplaza la ubicación natural de las partículas fúngicas aspiradas, empujando las esporas desde los bronquiolos proximales hasta los espacios aéreos terminales.

Por el contrario, este método de inflado de aire con fijación de perfusión de la vasculatura sanguínea preserva la posición fisiológica de las esporas de hongos dentro de los bronquiolos. Además, describimos un enfoque simple para criopreservar, incluir e obtener imágenes de muestras pulmonares. También compartimos técnicas computacionales de alto rendimiento a través del programa de código abierto QuPath para analizar la distribución espacial de las esporas de hongos dentro del pulmón. El método presentado aquí es simple y rápido, requiere un equipo mínimo para realizarlo y se puede adaptar fácilmente para su uso con muchos modelos de infecciones fúngicas respiratorias.

Introduction

Los seres humanos pueden inhalar hasta miles de millones de esporas por día de una variedad de hongos^ambientales. Para comprender nuestras defensas de barrera contra estas esporas inhaladas, debemos apreciar los entornos microanatómicos precisos donde estas esporas aterrizan dentro de las vías respiratorias y el parénquima pulmonar. La composición celular de las vías respiratorias (es decir, las células epiteliales) se transforma significativamente a lo largo de la tráquea, los bronquios, los bronquiolos y los alvéolos. Cada una de estas regiones distintas está compuesta por diferentes tipos de células con funciones discretas que disponen de un arsenal de defensas para prevenir la infección patológica.

La ubicación precisa de la deposición de esporas fúngicas pulmonares puede variar entre los lúmenes de las vías respiratorias de los bronquiolos con revestimiento epitelial cilíndrico, los conductos alveolares o los alvéolos². La mayoría de las especies fúngicas clínicamente relevantes producen esporas de entre 1 μm y 10 μm de diámetro³. La deposición de estas partículas de esporas en el pulmón depende de varios factores, como la aerodinámica, la densidad, la carga eléctrica y las fuerzas foréticas, que pueden influir en el mecanismo de sedimentación después de la inhalación⁴. Generalmente, las partículas grandes (> 6 μm) se depositan en la vía aérea superior, las partículas de tamaño mediano (2-6 μm) pueden depositarse en las vías respiratorias más pequeñas y las partículas pequeñas (<2 μm) alcanzan la región alveolar⁵. Se ha descrito que las esporas de Aspergillus (2-3 μm) alcanzan los espacios alveolares, pero los informes de patología clínica también indican una carga significativa de enfermedad bronquial y bronquiolar⁶. También hay un creciente reconocimiento de infecciones fúngicas endobronquiales por Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, especies de Candida, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum y Zygomycetes debido a la creciente popularidad de la broncoscopia flexible⁷. Los avances recientes en la obtención de imágenes microscópicas de las infecciones por Aspergillus en ratones también han revelado que los espacios aéreos más proximales, como los bronquios y los bronquiolos, pueden soportar la mayor carga de proliferación fúngica patológica⁸. La investigación sobre la respuesta del huésped a las infecciones fúngicas pulmonares ha demostrado que tanto las células epiteliales bronquiolares como las células epiteliales alveolares desempeñan un papel importante como centinelas inmunes, por lo que dilucidar los sitios exactos de deposición de esporas e interacción epitelial será vital para trabajos futuros ^2,9,10.

El estudio de esta dinámica de la patogénesis de las vías respiratorias proximales es difícil porque las técnicas estándar de fijación pulmonar y preparación de secciones pueden desplazar las esporas de estas posiciones proximales en las vías respiratorias revestidas epitelialmente y empujarlas hacia las regiones alveolares terminales distales. Por lo general, se usa formalina al 10% o paraformaldehído al 4% para inflar los pulmones y exponer rápidamente todo el pulmón al fijador. Al preparar los pulmones para la criosección, algunos grupos administran un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en los pulmones para mejorar el rendimiento de la criosección¹¹. Estas prácticas son útiles en el contexto adecuado, pero nuestro laboratorio y otros grupos han encontrado que desplazan las esporas y las partículas de las ubicaciones proximales, lo que interfiere con las interpretaciones sobre los tipos de células expuestas a las esporas y la posterior respuesta del huésped¹².

Para establecer con precisión la localización microanatómica de las esporas de hongos inhaladas, hemos desarrollado un método rápido y de bajos recursos para la preservación de la ubicación de las esporas de hongos en las vías respiratorias de los ratones. Adaptamos un método de fijación de perfusión vascular con inflado de aire murino de Thomas et al. (2021), donde redujimos la cantidad de equipo, tiempo y habilidad técnica necesarios para lograr un resultado satisfactorio¹³. A partir del método descrito aquí, hemos observado que los artroconidios de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (de 3-5 μm de tamaño) se acumulan más proximalmente de lo que se ha mostrado anteriormente, es decir, en los bronquiolos distales y en las uniones bronco-alveolares en lugar de en los alvéolos terminales. Esta información puede enfocar preguntas biológicas relacionadas con los tipos de células críticas asociadas con estas regiones del pulmón y su influencia en las respuestas tempranas a las esporas de hongos inhaladas.

Protocol

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Marcar las esporas con fluorescencia intracelular

1. Teñir 1 x 10⁶ esporas en éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE), Cell Tracker Orange o Cell Tracker Red (o tinte intracelular de su elección) a 5 μM durante 30 min a 30 °C, luego lavar con PBS y centrifugar las esporas a 12.000 x g. Repita este lavado una vez.
2. Prepare el inóculo de esporas a la concentración adecuada para que 25 μL contengan la dosis de esporas adecuada para un ratón.

2. Inocular esporas de ratón mediante inhalación por aspiración con anestesia con isoflurano

PRECAUCIÓN: El isoflurano es un agente anestésico volátil y debe usarse dentro de una cabina de bioseguridad con conductos o una campana de gases.

1. Para preparar el frasco de exposición al isoflurano, coloque una servilleta doblada en un frasco de Nalgene con tapa de rosca de 1 L y coloque un círculo de malla de plástico sobre la servilleta como plataforma para los ratones. Agregue 2 ml de isoflurano a la servilleta, cierre el frasco y espere 1-2 minutos para que el gas se equilibre en el recipiente.

Figura 1: Aparato para el método de inoculación de esporas en gota abierta de isoflurano. Se coloca una servilleta doblada en el fondo de un frasco con tapa de rosca de 1 L, y luego se inserta una malla de plástico circular para que actúe como plataforma para los ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Antes de exponer al ratón a la anestesia, prepare una pipeta con 25 μL del inóculo. Coloque el ratón en el recipiente de isoflurano e inclínelo para controlar la pérdida del reflejo de enderezamiento, donde el ratón ha perdido el conocimiento y está boca abajo. Esto suele tardar unos 10 s.
3. Controle la frecuencia respiratoria (RR) hasta que disminuya a 50-80 respiraciones por minuto (lpm) constantes, aproximadamente el 50% de la frecuencia respiratoria en reposo. Esto suele tardar otros 10 s. En este momento, retire el ratón del frasco de isoflurano.
   NOTA: Se trata de una alta concentración de isoflurano, que producirá una rápida inducción de la anestesia, y el ratón debe ser vigilado muy de cerca. La sobredosis letal de isoflurano es un riesgo, ya que la concentración de isoflurano puede ser variable y la curva dosis-respuesta al isoflurano es muy pronunciada. Si la frecuencia respiratoria desciende por debajo de 50 lpm y/o es irregular, retire el ratón del isoflurano, deje que se recupere durante 3-5 minutos y vuelva a intentarlo (un máximo de dos intentos repetidos).
4. Confirmar la profundidad anestésica por falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie. Luego, coloque el mouse en posición supina en una mano y permita que el mouse tome de 3 a 5 respiraciones jadeantes regulares con una frecuencia creciente (comenzando a 50-60 lpm) y vigor. Al comenzar, coloque la punta de la pipeta en la parte posterior de la orofaringe del ratón y libere el inóculo durante una inhalación.
   NOTA: Estos jadeos a través de la boca sacuden la cabeza inferiormente debido al reclutamiento de músculos accesorios para la respiración. Cuando se inserta la pipeta durante estos jadeos, la boca debe abrirse con cada jadeo. Si la boca no se abre, el ratón no está suficientemente anestesiado y es probable que no inhale el contenido de la orofaringe. La pipeta debe presionar la lengua, empujándola hacia el fondo y la parte delantera de la boca para evitar que se trague el inóculo. Cuando la pipeta está en la boca y el ratón está adecuadamente anestesiado, el ratón abrirá la boca con cada jadeo.
5. Con la mano y el pulgar sosteniendo el ratón, palpa si hay crujidos en los aspectos posterior y anterior del tórax del ratón para confirmar la inhalación del inóculo.

3. Eutanasia de ratones

1. Inyectar al ratón por vía intraperitoneal un cóctel de 200 mg/kg de ketamina y 24 mg/kg de xilacina 10 minutos antes del momento del sacrificio.
2. Espere 10 minutos después de la inyección hasta que el ratón entre en un plano quirúrgico de anestesia, confirmado por la falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie.

4. Perfusión de pulmones con PBS y formalina

1. Rocíe el ratón anestesiado con etanol al 70%. Use tijeras para cortar la piel del ratón y separar la piel para exponer el peritoneo por todos lados. Tira de la piel de la mitad superior del ratón sobre su cabeza, sacando los brazos de la piel.
2. Cortar la membrana peritoneal en el esternón y a lo largo de la cara inferior de la caja torácica, exponiendo el peritoneo. Desplaza el hígado hacia abajo, revelando el diafragma. Use tijeras para perforar cuidadosamente el diafragma lejos del parénquima pulmonar para evitar perforar un agujero en los pulmones.
   NOTA: La perforación inadvertida de los pulmones hará imposible el inflado posterior del aire.
3. Después de perforar el diafragma, el aire entra en el tórax, colapsando los pulmones. Corta la caja torácica del lado izquierdo para revelar el corazón. Inyectar 5-10 mL de PBS en el ventrículo derecho con una aguja de 30 G a razón de 1 mL por 5 s (para evitar dañar los vasos), blanqueando rápidamente los pulmones.
   PRECAUCIÓN: La formalina es una sustancia volátil peligrosa que debe manipularse dentro de un gabinete de bioseguridad con conductos o una campana de gases.
4. Cuando termine, retire la aguja y use una aguja nueva para inyectar 5 mL de formalina tamponada neutra (NBF) al 10% en el ventrículo derecho a la misma velocidad.

5. Inflar el pulmón perfundido en el aire

1. Retira la mitad anterior de la caja torácica. Para exponer la tráquea, corte las costillas superiores y las clavículas a la derecha y a la izquierda del cuello. Tenga cuidado de evitar cortar cerca de la línea media donde se encontrará la tráquea. Con pinzas, sujete las costillas superiores y las clavículas restantes en la línea media del cuello y tire hacia arriba hasta que la tráquea quede expuesta.
2. Prepare un hilo de sutura de 10 cm de longitud, páselo por debajo de la tráquea y haga previamente un nudo suelto en el extremo inferior de la tráquea expuesta. Prepare una jeringa de aire de 1 mL con un catéter de 18 G. Use una aguja de 18 G para hacer un agujero en la tráquea en el extremo superior de la región expuesta.
3. Coloque el catéter en ese orificio, asegurándose de un ajuste relativamente apretado para evitar que el aire se escape. Inyecte lentamente 1 ml de aire en los pulmones en el transcurso de 10 s, vigilando la inflación pulmonar de todos los lóbulos. El inflado completo hace que los pulmones se envuelvan ligeramente alrededor del corazón y llenen el volumen que ocupan en el diafragma no perforado.
4. Tire del nudo con fuerza alrededor de la tráquea y retire el catéter. Sostenga la tráquea y use tijeras romas para extraer los pulmones del ratón, teniendo cuidado de no perforar el pulmón.

6. Fijación por inmersión y deshidratación

1. Coloque los pulmones en el borde superior de un tubo cónico de 50 mL lleno de 20 mL de NBF al 10%. Mantenga las roscas de sutura fuera de la cónica, enrosque la tapa e invierta la cónica para que los pulmones queden suspendidos boca abajo en 20 mL de NBF. Colócalo a 4 °C durante 24-48 h.
2. Enjuague los pulmones con PBS, luego colóquelos en una solución de sacarosa-PBS al 30% (p/v) durante 72-96 h a 4 °C para deshidratar los pulmones en preparación para la criopreservación. Retire los pulmones de la sacarosa, colóquelos en un crimolde con un medio de temperatura de corte óptima (OCT) y congele la muestra a -80 °C.

7. Crioseccionamiento

1. Equilibrar las muestras en criobloques OCT a la temperatura de -20 °C del criostato durante 1 h antes del corte. Seccione los bloques con espesores de 20-100 μm.
   NOTA: El inflado del aire puede provocar una mayor fragilidad de la muestra, y el corte con un mayor grosor puede prevenir la rotura del tejido durante el corte.
2. Recoja las secciones en portaobjetos de vidrio y déjelos secar durante 30 minutos a 1 hora para garantizar la adherencia del tejido al portaobjetos.
   NOTA: Los portaobjetos pueden sostenerse a -80 °C en esta etapa.

8. Preparación y bloqueo de correderas

1. Coloque los portaobjetos en un baño de PBS (en un plato o frasco Coplin) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) para eliminar la OCT de los portaobjetos.
   NOTA: Es posible que las secciones más gruesas (40-100 μm) no se adhieran a los portaobjetos de vidrio tan bien como las secciones más delgadas, por lo que es mejor mantenerlas planas y en posición vertical en un plato en lugar de colocarlas de lado en un frasco Coplin.
2. Seque los portaobjetos después de que la OCT se haya disuelto lejos del tejido. Use una toallita para secar el exceso de gotas del perímetro del portaobjetos alrededor de la muestra de tejido.
3. Usa un bolígrafo de Papanicolaou hidrofóbico para dibujar un perímetro alrededor de la muestra y déjala secar durante 5 minutos.
4. Prepare un tampón de bloqueo de solución de bloqueo sin animales con 0.3% de Tween-20 y 1:100 Fc Block en 300 mL por portaobjetos.
   NOTA: Para los objetivos intracelulares, se puede utilizar Tween-20 al 1%. Un volumen de 300 μL suele ser suficiente, pero el volumen necesario para cubrir completamente el tejido depende del tamaño del perímetro del marcador hidrofóbico. El tejido no debe secarse a partir de este punto.
5. Deje la solución de bloqueo en los portaobjetos durante 1 h en RT.

9. Inmunotinción

1. Lave el portaobjetos pipeteando el líquido y añadiendo 300-500 μL de PBS. Repite el lavado una vez.
2. Prepare el anticuerpo primario conjugado AlexaFluor-647 anti-ratón EpCAM (clon G8.8) (marcador epitelial de las vías respiratorias) en una solución bloqueadora sin animales con Tween-20 al 0,33 % (o al 1 % para objetivos intracelulares). Añadir 300 μL por portaobjetos de esta solución y teñir toda la noche a 4 °C.
   NOTA: Los anticuerpos deben analizarse empíricamente para determinar la concentración, el tiempo y la temperatura de la tinción. Las secciones delgadas (8-20 μm) se tiñen durante 30 min a 37 °C y las secciones más gruesas (20-100 μm) a 4 °C durante la noche utilizando diluciones 1:100 para la mayoría de los anticuerpos. Si usa anticuerpos no conjugados, lávese 2 veces (como se indicó anteriormente) y aplique un anticuerpo fluorescente secundario durante un tiempo y una temperatura determinados empíricamente. Generalmente, la tinción secundaria de anticuerpos se realiza en RT durante 1 h con una dilución de 1:1000.
3. Retire la solución de anticuerpos de la muestra y lave el portaobjetos con 300 ml de PBS durante 5 min. Repita este lavado una vez. Seque los portaobjetos, eliminando todo el exceso de líquido de la muestra y del vidrio circundante.
4. Agregue una gota de soporte de montaje RT soft set (por ejemplo, SlowFade Glass) a cada pieza de pañuelo. Tenga cuidado de evitar burbujas dejando que la botella se asiente boca abajo y dejando caer lentamente cada gota sobre los pañuelos. Coloque un cubreobjetos del tamaño adecuado para que se extienda más allá de la muestra y el perímetro del marcador hidrofóbico.

10. Imágenes mediante microscopía fluorescente

1. Utilice un microscopio fluorescente multicanal para escanear secciones enteras de pulmón de forma imparcial utilizando un objetivo con suficiente resolución para resolver esporas individuales y células huésped (por ejemplo, Zeiss Axioscan 7 utilizando un objetivo de aceite 20x con NA = 0,8 o similar).
   NOTA: Asegúrese de que la potencia del láser y la ganancia de voltaje PMT estén configuradas para maximizar las relaciones señal-ruido del objetivo sobre el fondo determinadas con un control de fluorescencia menos uno (FMO).
2. Recoja suficientes mosaicos de imágenes para capturar todo el lóbulo pulmonar (por ejemplo, ~ 200 mosaicos de tamaño 400 μm x 400 μm). Utilice el programa de software del microscopio (por ejemplo, Zeiss ZEN 3.7 o similar) para exportar la imagen de mosaico fusionada para el procesamiento posterior.

11. Análisis espacial a través de QuPath

1. En QuPath, un software gratuito de código abierto¹⁴, cree un archivo de proyecto y agregue las imágenes fluorescentes al archivo.
2. Clasifique los píxeles de EpCAM+ como epitelio haciendo clic en la opción del menú superior Clasificar, luego en Clasificación de píxeles > Crear umbral. Seleccione la resolución, el canal, el sigma de suavizado y el valor de umbral que mejor identifique la región de destino. Guarde el clasificador con un nombre único y seleccione Crear objetos.
3. En la nueva ventana Crear objetos , seleccione Nuevo tipo de objeto como Anotación. Para el epitelio pulmonar, establezca el tamaño mínimo del objeto y el tamaño mínimo del orificio en 100 mm². No es necesario seleccionar Dividir objetos aquí. Después de seleccionar Aceptar, se crearán las anotaciones y se pueden modificar a ojo usando la herramienta Pincel en el área superior izquierda.
4. Para clasificar las esporas, repita los pasos de 11.3-11.4 utilizando el canal en el que se capturaron las esporas y haga que el nuevo objeto escriba Detección en lugar de Anotación. Establezca el tamaño mínimo del objeto y el tamaño mínimo del agujero en 0 mm² y seleccione Dividir objetos.
5. Para realizar un análisis espacial de las esporas, seleccione la opción del menú superior Analizar > Análisis espacial > Calcular la distancia firmada a las anotaciones 2D. Las distancias al epitelio de EpCAM+ se calcularán para cada espora detectada. Expórtelos a través de la opción del menú superior Medir > Exportar mediciones.

Results

En última instancia, este método produce imágenes inmunofluorescentes de los pulmones de los ratones utilizando el inflado fisiológico del aire para dejar las vías respiratorias intactas. Es importante destacar que varios puntos de control a lo largo del camino confirmarán que los componentes del protocolo se han realizado correctamente. Durante la inoculación, es importante confirmar que el inóculo fue aspirado palpando "crepitaciones" en la pared torácica posterior del ratón que indican que el líquido ha entrado en las vías respiratorias. Si no hay sensación de crujidos, es posible que el ratón se haya tragado el inóculo. La perfusión de los pulmones de ratón con PBS debe dar lugar a un moteado blanco de los pulmones seguido de un blanqueamiento completo de todo el pulmón (Figura 2A). Si hay un blanqueamiento incompleto, la perfusión posterior de formol no llegará a todas las áreas del parénquima pulmonar (Figura 2B). Al inflar el pulmón con aire, los pulmones deben distenderse lentamente hasta que alcancen el tamaño fisiológico. Después de atar la sutura traqueal para asegurar el aire dentro de los pulmones, los pulmones no deben contraerse de tamaño. Si lo hacen, es probable que el pulmón haya sido perforado durante el procedimiento.

Aquí, mostramos imágenes representativas de secciones con esporas marcadas de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (verde) y epitelio bronquiolar cilíndrico EpCAM+ (magenta) en pulmones inflados con aire y con líquido de formalina (Figura 3A, B respectivamente). Estas esporas se acumulan principalmente dentro de los bronquiolos distales y en los espacios alveolares inmediatamente adyacentes a esos bronquiolos distales, probablemente en los conductos alveolares. Los pulmones perfundidos con fijador inflado por aire contienen esporas que aparecen con mayor frecuencia dentro de los bronquiolos y se agrupan más cerca de los bronquiolos (Figura 3A), en lugar del fijador líquido, donde las esporas parecen ligeramente más dispersas desde el epitelio bronquiolar (Figura 3B). A través del análisis espacial QuPath, medimos la distancia de las esporas individuales al epitelio bronquiolar EpCAM+ más cercano para indicar el nivel de dispersión de las esporas lejos del bronquiolo y hacia espacios alveolares más distales. Mostramos que el inflado líquido dispersa las esporas más lejos de los bronquiolos en comparación con el inflado fisiológico del aire (Figura 4A, B). La perfusión vascular con inflado de aire preserva la posición natural de estas esporas en los bronquiolos distales y evita la dispersión artificial de estas esporas en espacios alveolares más distales mediante instilación fijadora intratraqueal.

Figura 2: Indicación de éxito de la perfusión pulmonar. (A) Los pulmones perfundidos con éxito serán completamente blancos. (B) Los pulmones incompletamente perfundidos aparecerán rosados o moteados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas de la distribución de esporas en pulmones perfundidos con formalina inflados con aire frente a pulmones inflados con formalina. Se observa que las esporas fluorescentes intracelulares (verde) se distribuyen más cerca del epitelio bronquiolar EpCAM+ (magenta) en los pulmones inflados con aire (A) que en los pulmones inflados con formalina (B). Las imágenes se obtuvieron de secciones con una profundidad de 1,2 mm desde la superficie posterior de los lóbulos izquierdos de los ratones en cada grupo de tratamiento en un microscopio fluorescente multicanal con un aumento de 20x, y las baldosas se unieron utilizando software de microscopía. Barra de escala = 800 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación de la distancia entre las esporas (mm) y el epitelio bronquiolar entre pulmones inflados con aire y pulmones tratados con esporas inflados con formalina. Se recolectaron, procesaron y tomaron imágenes de los pulmones de 3 ratones por grupo de tratamiento durante 1,5 h después de la inoculación con 1 x 10⁶ 6 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Se muestrearon cuatro secciones por ratón a 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm y 2,0 mm de la superficie posterior del lóbulo izquierdo, se tiñeron y se obtuvieron imágenes en un microscopio fluorescente multicanal. Todas las esporas de cada grupo se detectaron y analizaron espacialmente en QuPath para determinar la (A) distancia al epitelio bronquiolar cilíndrico EpCAM+ más cercano, y (B) la mediana y los intervalos de confianza del 95% se muestran en unidades de micrómetros. Esporas de inflado de aire, n = 11.673. Esporas de inflado líquido, n = 9.837. Se realizó la prueba t de Mann-Whitney por falta de normalidad y p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Discussion

Hemos establecido una tubería para la inhalación de esporas y el análisis de la deposición espacial de las esporas inhaladas. Esta tubería proporciona información valiosa para determinar las regiones estromales relevantes del pulmón afectadas por la inhalación de artroconidia por Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Hemos observado que las esporas de Coccidioides y las partículas inertes de tamaño similar (datos no mostrados) se acumulan en las regiones bronquiolares distales y en las uniones broncoalveolares en lugar de dispersarse completamente a través de los lúmenes de las vías respiratorias alveolares. Este modelo requiere un nivel relativamente bajo de equipo y habilidad técnica para producir criosecciones para inmunofluorescencia (u otras tuberías posteriores como la inmunohistoquímica [IHC]) que mantengan la integridad fisiológica del contenido de las vías respiratorias mientras se mantiene la morfología pulmonar natural. Sin inflado aéreo, el colapso de los alvéolos distorsiona la arquitectura natural del parénquima pulmonar que rodea a los bronquiolos^13,15. La pérdida del volumen de aire del pulmón durante el procesamiento histológico fue indicada como un "problema grave" por una declaración de política de investigación oficial conjunta de la Sociedad Torácica Americana y la Sociedad Respiratoria Europea en la definición de estándares para la evaluación cuantitativa de la estructura pulmonar¹⁶. Además, la instilación intratraqueal del fijador puede alterar la naturaleza y la ubicación de los componentes moleculares y celulares de la vía aérea proximal, como las mucinas, el surfactante y los cilios de la vía aérea 17,18,19. El método descrito aquí conserva suficientemente tanto el volumen de aire del pulmón como los componentes moleculares y celulares a lo largo de las vías respiratorias que interactúan con las esporas de hongos inhaladas.

La microscopía de inmunofluorescencia proporciona una poderosa herramienta para interrogar la dinámica espacial de los componentes pulmonares, y está bien revisada^20,21. No hay limitaciones para las dianas que se pueden teñir mediante inmunofluorescencia de estas secciones, excepto que los anticuerpos con epítopos sensibles a la fijación de formalina pueden no unirse satisfactoriamente a sus dianas. Cuando se utiliza un nuevo anticuerpo, es mejor preparar un control de fluorescencia menos uno (FMO) para determinar si el anticuerpo genera alguna señal por encima del fondo. Si usa un anticuerpo secundario, use un grupo de tratamiento sin el anticuerpo primario para controlar la unión fuera del objetivo del anticuerpo secundario. Los anticuerpos monoclonales conjugados primarios son muy específicos, por lo que la tinción a temperaturas más altas (37 °C) durante menos tiempo (30 min) es común y generalmente se une específicamente a su objetivo. Por otro lado, los anticuerpos policlonales no conjugados son más sensibles para detectar antígenos pero menos específicos, por lo que las incubaciones más largas (~16 h) a temperaturas más frías (4 °C) optimizan la relación señal-ruido. Todos los anticuerpos requerirán optimización empírica.

El modelo de análisis espacial utilizado en este estudio para la localización de esporas mide la distancia de las esporas individuales al epitelio bronquiolar más cercano. Esto requiere una identificación adecuada del epitelio bronquiolar utilizando su alta señal EpCAM y su apariencia morfológicamente distinta como un epitelio cilíndrico que recubre estructuras en forma de tubo. El epitelio alveolar también puede expresar la EpCAM a niveles más bajos, por lo que es importante umbralizar la señal de EpCAM en QuPath para limitar las anotaciones definidas a las regiones bronquiolares morfológicamente confirmadas. Dado que los bronquiolos tienen un tamaño anatómico mínimo, podemos limitar la definición de QuPath de estas regiones al área mínima de 100^mm2, como se indica en el paso 11.3. Esto excluirá las células aisladas de alta expresión de EpCAM o los artefactos en los espacios alveolares, como las células epiteliales alveolares de tipo II, de las anotaciones de QuPath. Estos pasos nos permiten definir exclusivamente el epitelio bronquiolar como anotaciones QuPath y determinar la proximidad de las esporas a este epitelio bronquiolar definido.

El modelo de infección descrito aquí utiliza anestesia con isoflurano para inducir una respuesta de jadeo oral en ratones para la aspiración de las esporas del hongo. El método de gota abierta de isoflurano ha sido desarrollado como una técnica rápida y de bajos recursos para inducir anestesia a corto plazo en ratones ^9,22,23. Este método requiere algo de práctica para realizarlo de manera consistente. El tiempo bajo anestesia debe ser lo suficientemente largo como para anestesiar suficientemente al ratón para aspirar el contenido faríngeo. Si el ratón no está suficientemente anestesiado, puede tragar el inóculo en lugar de aspirarlo. El signo de anestesia suficiente se alcanza cuando el ratón produce un jadeo oral regular de vigor creciente a una velocidad de aproximadamente 50-60 jadeos/min. La cabeza del ratón supino debe moverse hacia adelante con cada jadeo. La anestesia insuficiente puede determinarse por la falta de jadeo o cualquier movimiento de los bigotes, la lengua o las extremidades. Es una buena práctica presionar la lengua con la punta de la pipeta mientras se administra el inóculo para evitar la deglución. La sobredosis de isoflurano puede provocar la muerte del ratón y debe prevenirse. Una buena regla general para evitar esto es retirar el ratón del isoflurano después de la misma cantidad de tiempo que tardó el ratón en perder el reflejo de enderezamiento. Por ejemplo, si el ratón tarda 10 s en perder el reflejo de enderezamiento, quítelo después de 10 s adicionales. A medida que el gas isoflurano se escapa en el transcurso de múltiples tratamientos con ratones, este período de tiempo puede aumentar. En nuestras manos, podemos tratar a 6-8 ratones sin añadir más isoflurano.

Existen algunas limitaciones en los componentes de este protocolo. El procedimiento de inoculación utiliza esporas suspendidas en 25 μL de medio PBS fluido, que es menos fisiológico que una inoculación de esporas en aerosol. Queda abierta la cuestión de si el uso de líquido aspirado altera la localización de las esporas/partículas en comparación con otros métodos de inoculación, como la inhalación de esporas en el aire. Sin embargo, la inhalación por aerosol requiere una gran inversión de recursos y tiene otras limitaciones (tamaño limitado del inóculo, exposición variable, riesgo ocupacional) que pueden no ser óptimas dependiendo de la naturaleza del estudio y del entorno del laboratorio. Otra limitación de este protocolo es que puede producirse fragilidad tisular durante la criosección, lo que podría deberse a la presencia de aire en todo el tejido o a la menor eficacia de la fijación vascular en comparación con la fijación intratraqueal. Esta fragilidad de la criosección se puede superar cortando secciones más gruesas de 60-100 μm y utilizando microscopía confocal para obtener imágenes de planos bidimensionales (2D) dentro del tejido.

Creemos que la simplicidad y adaptabilidad de este método permitirá a otros grupos encontrar utilidad con los patógenos inhalados elegidos y las respuestas de interés del huésped.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G, 1 1/2 aguja (305185)	Fisher	305185
1 L  Tarro con tapa de rosca   (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Jeringas no estériles a granel 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Inyección (solución estéril de xilacina)	Akorn	59399-110-20
Bloqueador y diluyente sin animales, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Catéter IV blindado con alas con catéter BD Vialon Material 18 G x 1.88 en	BD	381547
BD Pharmingen Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Naranja CMRA Tinte	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning Filtros de 70 micras	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 anticuerpo monoclonal	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Jeringas estériles de un solo uso (1 ml, deslizamiento de Leur)	Fisher	14-955-462
Glucosa Monohidrato	Azer Scientific	ES17530-500G
Grasa de alto vacío	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Solución 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurano USP	Covetrus	29405
Clorhidrato de ketamina	Dechra 1000001250
KIMWIPES Limpiaparabrisas para tareas delicadas (4,4'' x 8,4")	VWR	21905-026
Lexer Tijeras para bebés	FST	14078-10
Pinzas Micro-Adson	FST	11018-12
Formol tamponado neutro (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYMraces de cultivo de tejidos en matraces de construcción, T75, tapones de filtro VWR		15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way moldes de incrustación	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Código abierto	https://qupath.github.io/
Silk Suture tamaño de rosca 3/0	FST	18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Montaje antidecoloración de fraguado suave (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sacarosa	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compuesto, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.
Vector Laboratories ImmEDGE Juego de 2 bolígrafos de barrera hidrofóbica	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Coverglass, rectangulares (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
Malla de alambre de plástico blanco	MAPORCH 789862904922
extracto de levadura	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	microscopio fluorescente multicanal
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	software de microscopía