Presentamos un método para un modelo de patogénesis fúngica que preserva la posición natural de las esporas de hongos en las vías respiratorias pulmonares para su análisis mediante microscopía fluorescente.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Método eficiente para obtener imágenes de pulmones murinos que preserva la dinámica espacial de las esporas de hongos en las vías respiratorias
En este artículo
Resumen
Resumen
Los hongos infectan a los humanos cuando las esporas ambientales se inhalan en los pulmones. El pulmón es un órgano heterogéneo. Las vías respiratorias conductoras, incluidos los bronquios y los bronquiolos, se ramifican hasta terminar en el espacio aéreo alveolar donde se produce el intercambio gaseoso. Las infecciones que se originan en los bronquiolos o alvéolos provocan distintas respuestas del huésped y manifestaciones de la enfermedad. Por lo tanto, comprender con precisión dónde se localizan naturalmente las esporas en los pulmones, particularmente poco después de la infección, amplía las oportunidades para la investigación de las interacciones huésped-patógeno. En este trabajo se detalla un análisis in situ de pulmones de ratones infectados con artroconidios por Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Los métodos convencionales para la preservación histológica implican el inflado líquido de las vías respiratorias con una solución fijadora, que desplaza la ubicación natural de las partículas fúngicas aspiradas, empujando las esporas desde los bronquiolos proximales hasta los espacios aéreos terminales.
Por el contrario, este método de inflado de aire con fijación de perfusión de la vasculatura sanguínea preserva la posición fisiológica de las esporas de hongos dentro de los bronquiolos. Además, describimos un enfoque simple para criopreservar, incluir e obtener imágenes de muestras pulmonares. También compartimos técnicas computacionales de alto rendimiento a través del programa de código abierto QuPath para analizar la distribución espacial de las esporas de hongos dentro del pulmón. El método presentado aquí es simple y rápido, requiere un equipo mínimo para realizarlo y se puede adaptar fácilmente para su uso con muchos modelos de infecciones fúngicas respiratorias.
Introducción
Los seres humanos pueden inhalar hasta miles de millones de esporas por día de una variedad de hongosambientales. Para comprender nuestras defensas de barrera contra estas esporas inhaladas, debemos apreciar los entornos microanatómicos precisos donde estas esporas aterrizan dentro de las vías respiratorias y el parénquima pulmonar. La composición celular de las vías respiratorias (es decir, las células epiteliales) se transforma significativamente a lo largo de la tráquea, los bronquios, los bronquiolos y los alvéolos. Cada una de estas regiones distintas está compuesta por diferentes tipos de células con funciones discretas que disponen de un arsenal de defensas para prevenir la infección patológica.
La ubicación precisa de la deposición de esporas fúngicas pulmonares puede variar entre los lúmenes de las vías respiratorias de los bronquiolos con revestimiento epitelial cilíndrico, los conductos alveolares o los alvéolos2. La mayoría de las especies fúngicas clínicamente relevantes producen esporas de entre 1 μm y 10 μm de diámetro3. La deposición de estas partículas de esporas en el pulmón depende de varios factores, como la aerodinámica, la densidad, la carga eléctrica y las fuerzas foréticas, que pueden influir en el mecanismo de sedimentación después de la inhalación4. Generalmente, las partículas grandes (> 6 μm) se depositan en la vía aérea superior, las partículas de tamaño mediano (2-6 μm) pueden depositarse en las vías respiratorias más pequeñas y las partículas pequeñas (<2 μm) alcanzan la región alveolar5. Se ha descrito que las esporas de Aspergillus (2-3 μm) alcanzan los espacios alveolares, pero los informes de patología clínica también indican una carga significativa de enfermedad bronquial y bronquiolar6. También hay un creciente reconocimiento de infecciones fúngicas endobronquiales por Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, especies de Candida, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum y Zygomycetes debido a la creciente popularidad de la broncoscopia flexible7. Los avances recientes en la obtención de imágenes microscópicas de las infecciones por Aspergillus en ratones también han revelado que los espacios aéreos más proximales, como los bronquios y los bronquiolos, pueden soportar la mayor carga de proliferación fúngica patológica8. La investigación sobre la respuesta del huésped a las infecciones fúngicas pulmonares ha demostrado que tanto las células epiteliales bronquiolares como las células epiteliales alveolares desempeñan un papel importante como centinelas inmunes, por lo que dilucidar los sitios exactos de deposición de esporas e interacción epitelial será vital para trabajos futuros 2,9,10.
El estudio de esta dinámica de la patogénesis de las vías respiratorias proximales es difícil porque las técnicas estándar de fijación pulmonar y preparación de secciones pueden desplazar las esporas de estas posiciones proximales en las vías respiratorias revestidas epitelialmente y empujarlas hacia las regiones alveolares terminales distales. Por lo general, se usa formalina al 10% o paraformaldehído al 4% para inflar los pulmones y exponer rápidamente todo el pulmón al fijador. Al preparar los pulmones para la criosección, algunos grupos administran un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en los pulmones para mejorar el rendimiento de la criosección11. Estas prácticas son útiles en el contexto adecuado, pero nuestro laboratorio y otros grupos han encontrado que desplazan las esporas y las partículas de las ubicaciones proximales, lo que interfiere con las interpretaciones sobre los tipos de células expuestas a las esporas y la posterior respuesta del huésped12.
Para establecer con precisión la localización microanatómica de las esporas de hongos inhaladas, hemos desarrollado un método rápido y de bajos recursos para la preservación de la ubicación de las esporas de hongos en las vías respiratorias de los ratones. Adaptamos un método de fijación de perfusión vascular con inflado de aire murino de Thomas et al. (2021), donde redujimos la cantidad de equipo, tiempo y habilidad técnica necesarios para lograr un resultado satisfactorio13. A partir del método descrito aquí, hemos observado que los artroconidios de Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (de 3-5 μm de tamaño) se acumulan más proximalmente de lo que se ha mostrado anteriormente, es decir, en los bronquiolos distales y en las uniones bronco-alveolares en lugar de en los alvéolos terminales. Esta información puede enfocar preguntas biológicas relacionadas con los tipos de células críticas asociadas con estas regiones del pulmón y su influencia en las respuestas tempranas a las esporas de hongos inhaladas.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Rutgers Biomedical Health Sciences.
1. Marcar las esporas con fluorescencia intracelular
- Teñir 1 x 106 esporas en éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE), Cell Tracker Orange o Cell Tracker Red (o tinte intracelular de su elección) a 5 μM durante 30 min a 30 °C, luego lavar con PBS y centrifugar las esporas a 12.000 x g. Repita este lavado una vez.
- Prepare el inóculo de esporas a la concentración adecuada para que 25 μL contengan la dosis de esporas adecuada para un ratón.
2. Inocular esporas de ratón mediante inhalación por aspiración con anestesia con isoflurano
PRECAUCIÓN: El isoflurano es un agente anestésico volátil y debe usarse dentro de una cabina de bioseguridad con conductos o una campana de gases.
- Para preparar el frasco de exposición al isoflurano, coloque una servilleta doblada en un frasco de Nalgene con tapa de rosca de 1 L y coloque un círculo de malla de plástico sobre la servilleta como plataforma para los ratones. Agregue 2 ml de isoflurano a la servilleta, cierre el frasco y espere 1-2 minutos para que el gas se equilibre en el recipiente.
Figura 1: Aparato para el método de inoculación de esporas en gota abierta de isoflurano. Se coloca una servilleta doblada en el fondo de un frasco con tapa de rosca de 1 L, y luego se inserta una malla de plástico circular para que actúe como plataforma para los ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Antes de exponer al ratón a la anestesia, prepare una pipeta con 25 μL del inóculo. Coloque el ratón en el recipiente de isoflurano e inclínelo para controlar la pérdida del reflejo de enderezamiento, donde el ratón ha perdido el conocimiento y está boca abajo. Esto suele tardar unos 10 s.
- Controle la frecuencia respiratoria (RR) hasta que disminuya a 50-80 respiraciones por minuto (lpm) constantes, aproximadamente el 50% de la frecuencia respiratoria en reposo. Esto suele tardar otros 10 s. En este momento, retire el ratón del frasco de isoflurano.
NOTA: Se trata de una alta concentración de isoflurano, que producirá una rápida inducción de la anestesia, y el ratón debe ser vigilado muy de cerca. La sobredosis letal de isoflurano es un riesgo, ya que la concentración de isoflurano puede ser variable y la curva dosis-respuesta al isoflurano es muy pronunciada. Si la frecuencia respiratoria desciende por debajo de 50 lpm y/o es irregular, retire el ratón del isoflurano, deje que se recupere durante 3-5 minutos y vuelva a intentarlo (un máximo de dos intentos repetidos). - Confirmar la profundidad anestésica por falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie. Luego, coloque el mouse en posición supina en una mano y permita que el mouse tome de 3 a 5 respiraciones jadeantes regulares con una frecuencia creciente (comenzando a 50-60 lpm) y vigor. Al comenzar, coloque la punta de la pipeta en la parte posterior de la orofaringe del ratón y libere el inóculo durante una inhalación.
NOTA: Estos jadeos a través de la boca sacuden la cabeza inferiormente debido al reclutamiento de músculos accesorios para la respiración. Cuando se inserta la pipeta durante estos jadeos, la boca debe abrirse con cada jadeo. Si la boca no se abre, el ratón no está suficientemente anestesiado y es probable que no inhale el contenido de la orofaringe. La pipeta debe presionar la lengua, empujándola hacia el fondo y la parte delantera de la boca para evitar que se trague el inóculo. Cuando la pipeta está en la boca y el ratón está adecuadamente anestesiado, el ratón abrirá la boca con cada jadeo. - Con la mano y el pulgar sosteniendo el ratón, palpa si hay crujidos en los aspectos posterior y anterior del tórax del ratón para confirmar la inhalación del inóculo.
3. Eutanasia de ratones
- Inyectar al ratón por vía intraperitoneal un cóctel de 200 mg/kg de ketamina y 24 mg/kg de xilacina 10 minutos antes del momento del sacrificio.
- Espere 10 minutos después de la inyección hasta que el ratón entre en un plano quirúrgico de anestesia, confirmado por la falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie.
4. Perfusión de pulmones con PBS y formalina
- Rocíe el ratón anestesiado con etanol al 70%. Use tijeras para cortar la piel del ratón y separar la piel para exponer el peritoneo por todos lados. Tira de la piel de la mitad superior del ratón sobre su cabeza, sacando los brazos de la piel.
- Cortar la membrana peritoneal en el esternón y a lo largo de la cara inferior de la caja torácica, exponiendo el peritoneo. Desplaza el hígado hacia abajo, revelando el diafragma. Use tijeras para perforar cuidadosamente el diafragma lejos del parénquima pulmonar para evitar perforar un agujero en los pulmones.
NOTA: La perforación inadvertida de los pulmones hará imposible el inflado posterior del aire. - Después de perforar el diafragma, el aire entra en el tórax, colapsando los pulmones. Corta la caja torácica del lado izquierdo para revelar el corazón. Inyectar 5-10 mL de PBS en el ventrículo derecho con una aguja de 30 G a razón de 1 mL por 5 s (para evitar dañar los vasos), blanqueando rápidamente los pulmones.
PRECAUCIÓN: La formalina es una sustancia volátil peligrosa que debe manipularse dentro de un gabinete de bioseguridad con conductos o una campana de gases. - Cuando termine, retire la aguja y use una aguja nueva para inyectar 5 mL de formalina tamponada neutra (NBF) al 10% en el ventrículo derecho a la misma velocidad.
5. Inflar el pulmón perfundido en el aire
- Retira la mitad anterior de la caja torácica. Para exponer la tráquea, corte las costillas superiores y las clavículas a la derecha y a la izquierda del cuello. Tenga cuidado de evitar cortar cerca de la línea media donde se encontrará la tráquea. Con pinzas, sujete las costillas superiores y las clavículas restantes en la línea media del cuello y tire hacia arriba hasta que la tráquea quede expuesta.
- Prepare un hilo de sutura de 10 cm de longitud, páselo por debajo de la tráquea y haga previamente un nudo suelto en el extremo inferior de la tráquea expuesta. Prepare una jeringa de aire de 1 mL con un catéter de 18 G. Use una aguja de 18 G para hacer un agujero en la tráquea en el extremo superior de la región expuesta.
- Coloque el catéter en ese orificio, asegurándose de un ajuste relativamente apretado para evitar que el aire se escape. Inyecte lentamente 1 ml de aire en los pulmones en el transcurso de 10 s, vigilando la inflación pulmonar de todos los lóbulos. El inflado completo hace que los pulmones se envuelvan ligeramente alrededor del corazón y llenen el volumen que ocupan en el diafragma no perforado.
- Tire del nudo con fuerza alrededor de la tráquea y retire el catéter. Sostenga la tráquea y use tijeras romas para extraer los pulmones del ratón, teniendo cuidado de no perforar el pulmón.
6. Fijación por inmersión y deshidratación
- Coloque los pulmones en el borde superior de un tubo cónico de 50 mL lleno de 20 mL de NBF al 10%. Mantenga las roscas de sutura fuera de la cónica, enrosque la tapa e invierta la cónica para que los pulmones queden suspendidos boca abajo en 20 mL de NBF. Colócalo a 4 °C durante 24-48 h.
- Enjuague los pulmones con PBS, luego colóquelos en una solución de sacarosa-PBS al 30% (p/v) durante 72-96 h a 4 °C para deshidratar los pulmones en preparación para la criopreservación. Retire los pulmones de la sacarosa, colóquelos en un crimolde con un medio de temperatura de corte óptima (OCT) y congele la muestra a -80 °C.
7. Crioseccionamiento
- Equilibrar las muestras en criobloques OCT a la temperatura de -20 °C del criostato durante 1 h antes del corte. Seccione los bloques con espesores de 20-100 μm.
NOTA: El inflado del aire puede provocar una mayor fragilidad de la muestra, y el corte con un mayor grosor puede prevenir la rotura del tejido durante el corte. - Recoja las secciones en portaobjetos de vidrio y déjelos secar durante 30 minutos a 1 hora para garantizar la adherencia del tejido al portaobjetos.
NOTA: Los portaobjetos pueden sostenerse a -80 °C en esta etapa.
8. Preparación y bloqueo de correderas
- Coloque los portaobjetos en un baño de PBS (en un plato o frasco Coplin) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) para eliminar la OCT de los portaobjetos.
NOTA: Es posible que las secciones más gruesas (40-100 μm) no se adhieran a los portaobjetos de vidrio tan bien como las secciones más delgadas, por lo que es mejor mantenerlas planas y en posición vertical en un plato en lugar de colocarlas de lado en un frasco Coplin. - Seque los portaobjetos después de que la OCT se haya disuelto lejos del tejido. Use una toallita para secar el exceso de gotas del perímetro del portaobjetos alrededor de la muestra de tejido.
- Usa un bolígrafo de Papanicolaou hidrofóbico para dibujar un perímetro alrededor de la muestra y déjala secar durante 5 minutos.
- Prepare un tampón de bloqueo de solución de bloqueo sin animales con 0.3% de Tween-20 y 1:100 Fc Block en 300 mL por portaobjetos.
NOTA: Para los objetivos intracelulares, se puede utilizar Tween-20 al 1%. Un volumen de 300 μL suele ser suficiente, pero el volumen necesario para cubrir completamente el tejido depende del tamaño del perímetro del marcador hidrofóbico. El tejido no debe secarse a partir de este punto. - Deje la solución de bloqueo en los portaobjetos durante 1 h en RT.
9. Inmunotinción
- Lave el portaobjetos pipeteando el líquido y añadiendo 300-500 μL de PBS. Repite el lavado una vez.
- Prepare el anticuerpo primario conjugado AlexaFluor-647 anti-ratón EpCAM (clon G8.8) (marcador epitelial de las vías respiratorias) en una solución bloqueadora sin animales con Tween-20 al 0,33 % (o al 1 % para objetivos intracelulares). Añadir 300 μL por portaobjetos de esta solución y teñir toda la noche a 4 °C.
NOTA: Los anticuerpos deben analizarse empíricamente para determinar la concentración, el tiempo y la temperatura de la tinción. Las secciones delgadas (8-20 μm) se tiñen durante 30 min a 37 °C y las secciones más gruesas (20-100 μm) a 4 °C durante la noche utilizando diluciones 1:100 para la mayoría de los anticuerpos. Si usa anticuerpos no conjugados, lávese 2 veces (como se indicó anteriormente) y aplique un anticuerpo fluorescente secundario durante un tiempo y una temperatura determinados empíricamente. Generalmente, la tinción secundaria de anticuerpos se realiza en RT durante 1 h con una dilución de 1:1000. - Retire la solución de anticuerpos de la muestra y lave el portaobjetos con 300 ml de PBS durante 5 min. Repita este lavado una vez. Seque los portaobjetos, eliminando todo el exceso de líquido de la muestra y del vidrio circundante.
- Agregue una gota de soporte de montaje RT soft set (por ejemplo, SlowFade Glass) a cada pieza de pañuelo. Tenga cuidado de evitar burbujas dejando que la botella se asiente boca abajo y dejando caer lentamente cada gota sobre los pañuelos. Coloque un cubreobjetos del tamaño adecuado para que se extienda más allá de la muestra y el perímetro del marcador hidrofóbico.
10. Imágenes mediante microscopía fluorescente
- Utilice un microscopio fluorescente multicanal para escanear secciones enteras de pulmón de forma imparcial utilizando un objetivo con suficiente resolución para resolver esporas individuales y células huésped (por ejemplo, Zeiss Axioscan 7 utilizando un objetivo de aceite 20x con NA = 0,8 o similar).
NOTA: Asegúrese de que la potencia del láser y la ganancia de voltaje PMT estén configuradas para maximizar las relaciones señal-ruido del objetivo sobre el fondo determinadas con un control de fluorescencia menos uno (FMO). - Recoja suficientes mosaicos de imágenes para capturar todo el lóbulo pulmonar (por ejemplo, ~ 200 mosaicos de tamaño 400 μm x 400 μm). Utilice el programa de software del microscopio (por ejemplo, Zeiss ZEN 3.7 o similar) para exportar la imagen de mosaico fusionada para el procesamiento posterior.
11. Análisis espacial a través de QuPath
- En QuPath, un software gratuito de código abierto14, cree un archivo de proyecto y agregue las imágenes fluorescentes al archivo.
- Clasifique los píxeles de EpCAM+ como epitelio haciendo clic en la opción del menú superior Clasificar, luego en Clasificación de píxeles > Crear umbral. Seleccione la resolución, el canal, el sigma de suavizado y el valor de umbral que mejor identifique la región de destino. Guarde el clasificador con un nombre único y seleccione Crear objetos.
- En la nueva ventana Crear objetos , seleccione Nuevo tipo de objeto como Anotación. Para el epitelio pulmonar, establezca el tamaño mínimo del objeto y el tamaño mínimo del orificio en 100 mm2. No es necesario seleccionar Dividir objetos aquí. Después de seleccionar Aceptar, se crearán las anotaciones y se pueden modificar a ojo usando la herramienta Pincel en el área superior izquierda.
- Para clasificar las esporas, repita los pasos de 11.3-11.4 utilizando el canal en el que se capturaron las esporas y haga que el nuevo objeto escriba Detección en lugar de Anotación. Establezca el tamaño mínimo del objeto y el tamaño mínimo del agujero en 0 mm2 y seleccione Dividir objetos.
- Para realizar un análisis espacial de las esporas, seleccione la opción del menú superior Analizar > Análisis espacial > Calcular la distancia firmada a las anotaciones 2D. Las distancias al epitelio de EpCAM+ se calcularán para cada espora detectada. Expórtelos a través de la opción del menú superior Medir > Exportar mediciones.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En última instancia, este método produce imágenes inmunofluorescentes de los pulmones de los ratones utilizando el inflado fisiológico del aire para dejar las vías respiratorias intactas. Es importante destacar que varios puntos de control a lo largo del camino confirmarán que los componentes del protocolo se han realizado correctamente. Durante la inoculación, es importante confirmar que el inóculo fue aspirado palpando "crepitaciones" en la pared torácica posterior del ratón que indican que el líquido ha entrado en las...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Hemos establecido una tubería para la inhalación de esporas y el análisis de la deposición espacial de las esporas inhaladas. Esta tubería proporciona información valiosa para determinar las regiones estromales relevantes del pulmón afectadas por la inhalación de artroconidia por Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Hemos observado que las esporas de Coccidioides y las partículas inertes de tamaño similar (datos no mostrados) se acumulan en las regiones bronquiolares...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La financiación y el apoyo se adquirieron a través de la subvención K22 AI153678-01 de los NIH y la Escuela de Estudios de Posgrado de Rutgers. Agradecemos a Fawad Yousufzai y Luke Fritzky del Rutgers Biomedical Health Sciences Cellular Imaging and Histology Core por su trabajo y experiencia en la obtención de imágenes inmunofluorescentes.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 18 G, 1 1/2 aguja (305185) | Fisher | 305185 | |
| 1 L Tarro con tapa de rosca (Nalgene) | Fisher Scientific | 11-823-33 | |
| Air-Tite Jeringas no estériles a granel 10 mL Luer Lock | Fisher | 14-817-175 | |
| AnaSed Inyección (solución estéril de xilacina) | Akorn | 59399-110-20 | |
| Bloqueador y diluyente sin animales, R.T.U. | Vector | SP-5035-100 | |
| BD Insyte Autoguard Catéter IV blindado con alas con catéter BD Vialon Material 18 G x 1.88 en | BD | 381547 | |
| BD Pharmingen Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block™) | BD | 553142 | |
| CellTracker Naranja CMRA Tinte | Fisher Scientific | NC0873640 | |
| CFSE | Labviva | 75003 | |
| Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ | BEI Resources | NR-166 | |
| Corning Filtros de 70 micras | VWR | 10054-456 | |
| EpCAM AlexaFluor647 anticuerpo monoclonal | Biolegend | 118211 | |
| Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2" | Labviva | EN3012 | |
| Fisherbrand Jeringas estériles de un solo uso (1 ml, deslizamiento de Leur) | Fisher | 14-955-462 | |
| Glucosa Monohidrato | Azer Scientific | ES17530-500G | |
| Grasa de alto vacío | VWR | 59344-055 | |
| Hoechst 33342 Solución 20 mM (5 mL) | ThermoFischer | 62249 | |
| Isoflurano USP | Covetrus | 29405 | |
| Clorhidrato de ketamina | Dechra 1000001250 | ||
| KIMWIPES Limpiaparabrisas para tareas delicadas (4,4'' x 8,4") | VWR | 21905-026 | |
| Lexer Tijeras para bebés | FST | 14078-10 | |
| Pinzas Micro-Adson | FST | 11018-12 | |
| Formol tamponado neutro (10%) (Azer Scientific) | Fisher | 22-026-350 | |
| Nunc EasYMraces de cultivo de tejidos en matraces de construcción, T75, tapones de filtro VWR | 15708-134 | ||
| PBS | VWR | 45000-446 | |
| Peel-A-Way moldes de incrustación | Sigma | E6032-1CS | |
| QuPath 0.5.1 Software | Código abierto | https://qupath.github.io/ | |
| Silk Suture tamaño de rosca 3/0 | FST | 18020-30 | |
| SlidesMicro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| SlowFade Glass Montaje antidecoloración de fraguado suave (2 mL) | ThermoFischer | S36917 | |
| Sacarosa | Sigma | S0389-500G | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compuesto, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tween 20 | ThermoFischer | J20605. | |
| Vector Laboratories ImmEDGE Juego de 2 bolígrafos de barrera hidrofóbica | Fisher Scientific | NC9545623 | |
| VWR Micro Coverglass, rectangulares (24 mm x 40 mm #1.5) | VWR | 48393-230 | |
| Malla de alambre de plástico blanco | MAPORCH 789862904922 | ||
| extracto de levadura | Fisher | BP9727-500 | |
| Zeiss AxioScan 7 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html | microscopio fluorescente multicanal |
| ZEN 3.7 Software | Carl Zeiss Microscopy GmbH | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html | software de microscopía |
Referencias
- American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. Report on an American Academy of Microbiology Colloquium. , Washington, DC. (2019).
- Crossen, A. J., et al. Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity. J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).
- Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems. , Elsevier, Academic Press. (2020).
- Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
- Kradin, R. L., Mark, E. J. The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp. Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).
- Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity. Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).
- Wiesner, D. L., et al. Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation. Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).
- Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).
- Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice. J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).
- Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals. J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).
- Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. 168, e62215(2021).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
- Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. 162, e60605(2020).
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).
- Gil, J., Weibel, E. R. Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy. Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).
- Evans, C. M., et al. The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity. Nat Commun. 6, 6281(2015).
- Galati, D. F., Asai, D. J. Immunofluorescence microscopy. Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).
- Hickey, S. M., et al. Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations. Cells. 11 (1), 35(2021).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. Mouse isoflurane anesthesia using the drop method. Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Explorar más artículos
