Técnicas de cultivo y procesamiento de organoides tridimensionales para la generación de miomas y miomas uterinos

Summary

Este protocolo describe una técnica manual para crear hidrogeles que contienen colágeno incrustados con cultivos organoides 3D de células madre a partir de tejido miometrial y mioma.

Abstract

Los fibromas uterinos son los tumores benignos, monoclonales y ginecológicos más comunes en el útero de una mujer. Para superar los obstáculos comunes relacionados con los métodos utilizados en el estudio de estas patologías, nuestro objetivo fue idear una estrategia para generar modelos organoides tridimensionales de miometrio y miomas uterinos utilizando hidrogeles que contienen colágeno como andamios de incrustación. Concretamente, se explotaron hidrogeles que contienen colágeno en placas de bajo acoplamiento en V-bottom de 96 pozos. Este método permitió el desarrollo de organoides 3D de dos tipos de células madre a partir de miometrio normal y miometrio que contiene miomas uterinos, incrustándolos en hidrogeles que contienen colágeno y formando organoides en un medio adecuado para la proliferación de células madre. Los organoides lograron diferenciarse, proliferar y autoorganizarse en estructuras complejas, desarrollando un sistema sostenible. La importancia de este modelo es la comprensión de la fisiopatología y la etiopatogénesis, así como la prueba de nuevos fármacos para prevenir o tratar los fibromas uterinos.

Introduction

Los miomas uterinos, o leiomiomas, son los tumores benignos más comunes del^{útero 1}. Afectan a una parte significativa de las mujeres durante sus años reproductivos, y la investigación sugiere que alrededor del 77% de ellas las experimenta en algún momento. Aunque muchas mujeres tienen miomas sin síntomas, un 25% sustancial experimenta síntomas como sangrado uterino anormal, dolor pélvico o^{infertilidad 2}. El desarrollo y crecimiento de los fibromas están influenciados por una variedad de factores, incluyendo hormonas sexuales, factores de crecimiento, cambios genéticos y otros mecanismos^{biológicos 3}.

Para estudiar la patogénesis y la eficacia de los fármacos de prueba, se han desarrollado modelos in vitro y animales. Las células en cultivos 2D se ven obligadas a crecer sobre una superficie plana, distorsionando su forma y alterando su comportamiento en comparación con cómo se comportarían en un entorno de tejido 3D. La principal desventaja del cultivo 2D en comparación con el cultivo 3D es que representa mal el entorno celular natural dentro de un tejido, fallando en imitar con precisión las complejas interacciones célula-célula y matriz celular que ocurren en un organismo vivo, lo que conduce a resultados potencialmente inexactos al estudiar el comportamiento celular y la respuesta a^{estímulos 4}. Además, la UF y las células miometriales pierden rápidamente la respuesta hormonal en cultivos^{2D 5}. En general, los diferentes modelos animales han proporcionado información relevante sobre la fisiopatología^{de la UF 6}. En comparación con los modelos animales, los organoides 3D ofrecen varias ventajas: simplifican los experimentos, son compatibles con la imagen en tiempo real y permiten el estudio de aspectos específicos del desarrollo y enfermedades humanas que no están bien representados en modelos^{animales 7}. Por otro lado, los experimentos con animales más sofisticados, como los primates, son muy difíciles de justificar éticamente, además de los altos^{costes 8}. El modelo organoide 3D es generalmente superior al cultivo celular 2D al imitar más de cerca la arquitectura tisular in vivo , siendo más controlado, eficiente y rentable que los modelos animales. Por ello, es esencial desarrollar modelos alternativos más eficaces que repliquen con precisión el crecimiento celular natural y la complejidad de los tejidos enfermos.

Nuestro objetivo era establecer el procedimiento para realizar el cultivo 3D de organoides de miometría y miomas uterinos utilizando hidrogeles que contienen colágeno, mediante un procedimiento manual, destacando las principales ventajas y limitaciones.

Protocol

El protocolo fue aprobado por el Comité de Etnia de la Universidad de Chicago, con el número de aprobación IRB#20-1414. Según el banco de tejidos de la Universidad de Chicago, se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos de los que se recogió el tejido.

1. 3D Cultura del organoide

1. Cultivar y mantener las células madre miometriales y UF (SC) aisladas y purificadas, tal como se describió^{anteriormente.}
2. Obtén los CS del nitrógeno líquido y déjalos descongelar. Un diagrama de flujo del proceso de cultivo se muestra en la Figura 1.
3. Añade 5 mL de la proteína del factor de unión para preparar los frascos pre-recubiertos. Incuba durante al menos 4 horas a 37 °C. Luego descarta el exceso de proteína del factor de adherencia.
4. Cultivar los SC en los² frascos prerecubiertos de 75 cm utilizando 10 mL del medio que comprende tanto el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco como F12, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 12%. Incubar el matraz en una incubadora de hipoxia a 37 °C con una concentración de oxígeno del 2% hasta alcanzar el 90% de confluencia, como se muestra en la Figura 2A.
   NOTA: La hipoxia puede desempeñar un papel importante en el crecimiento de las células madre, ya que puede promover la proliferación y la supervivencia de las células madre.
5. Al alcanzar la confluencia, desconecta las células usando una solución de tripsina al 25% y 0,1% de EDTA en HBSS sin calcio ni magnesio.
   1. Para ello, retira el medio de cultivo celular. Lava las células con 1x PBS. Añadir 1 mL de tripsina a una celda de 25 cm² e incubar durante 2-3 minutos.
   2. Cuando las células empiecen a desprenderse, añade un suero con suero para detener la reacción de tripsina. Aspira la solución de la célula en un tubo de 15 mL y centrifuga durante 5 minutos a 500 x g a temperatura ambiente.
   3. Con cuidado, descarta el sobrenadante, dejando la boluleta intacta.
6. Posteriormente, resuspende el pellet celular en 1 mL de medio proliferante de células madre sin suero. Altera cualquier grumo con pipeteo suave.
7. Realiza la cuantificación celular usando un hemocitómetro.
   1. Mezcla 100 μL de suspensión celular con 10 μL de solución de Trippan Blue al 0,4%.
   2. Se vórtice brevemente la mezcla y se pipetean 10 μL de suspensión de celóbulos azules de tripán en la cámara del hemocitómetro entre la muesca de la cámara y el protector de vidrio ( Figura 2B).
   3. Cuenta las celdas en las casillas 1-4, utiliza las siguientes ecuaciones para calcular el recuento de celdas:
      Celdas/mL = (total de celdas contadas/número total de cajas contadas) x factor de dilución x 10.000
      Total de células en la muestra = celdas/mL x volumen total de la muestra
8. Mezcla aproximadamente 10.000 células con 2 μL de hidrogeles que contienen colágeno y 98 μL de medio proliferante de células madre sin suero, obteniendo un volumen final de 100 μL por^{pozo 5}para una placa de fondo en V de 96 pozos.
9. Pipetear 100 μL de la mezcla de celda en cada pozo de una placa de bajo V-bottom de 96 pozos. Centrifuga a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 x g.
10. Coloca el plato en una incubadora a 37 °C con 5% de_CO2 durante 30 minutos.
11. Añadir un volumen adicional de 100 μL de medio proliferante de células madre sin suero sin hidrogeles que contengan colágeno a cada pozo para proporcionar la nutrición necesaria para el crecimiento de los órganos.
12. Compensar la evaporación del medio añadiendo 10-20 μL de células madre sin suero en un medio proliferante en cada pozo en caso de evaporación excesiva, que rara vez ocurre.
13. Cultivar las células durante 7 días para el crecimiento completo de los organoides Figura 2C-H. Cambiar el medio proliferante de las células madre libres de suero dos veces por semana (aspirando suavemente el medio antiguo y luego añadiendo un medio nuevo) para permitir que el cultivo de organoides derivados de los SCs se alongue hasta 21 días.

2. Seccionamiento congelado

1. Recoge las células de la placa de 96 pozos en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Para la criosección, lavar los organoides 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 1x). Añade 500 μL de PBS a los organoides, luego centrifuga y descarta el sobrenadante.
3. Fije los organoides con 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 60 minutos a 4 °C y lave de nuevo con 1x PBS.
4. Resuspende los organoides en 100 μL de azul de metileno al 2% para teñir durante 20 minutos. Lava con PBS 1x y crioprotect durante la noche por suspensión en 500 μL de sacarosa al 30%.
5. Al día siguiente, retira la solución de sacarosa mediante centrifugación. Incrustar los organoides en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y congelar rápidamente a −80 °C.
6. Seccionar los organoides incrustados en OCT mediante un criostato, la profundidad óptima de sección es de 10 μm, y colocar inmediatamente las secciones sobre las láminas, una sección por lámina.
7. Conservar las láminas a 4 °C hasta que se realice la tinción por inmunofluorescencia según el siguiente método.
8. Lava la lámina 3 veces con 100 μL de 1 PBS. Luego, añade 100 μL de Tritón al 0,1% en PBS (1x) durante 15 minutos a temperatura ambiente.
9. Bloquear los organoides con 5% de BSA en 1x PBS durante 60 minutos e incubar durante la noche con anticuerpos primarios para Sox-2 con dilución (1:500) y actina α-liso-muscular (α-SMA) con concentración final de 1 μg/mL.
10. Lava los organoides con 100 μL de 1x PBS 3x e incuba durante 1 hora en la oscuridad con anticuerpos secundarios fluorescentes marcados con Alexa Fluor (1:1000).
11. Lava con 100 μL de 1 PBS 2x y luego monta en medio antifade complementado con DAPI (1 ng/mL).
12. Adquirir imágenes usando un microscopio fluorescente con aumento de 20x. Consulta la Figura 3A y analiza las imágenes con software para el análisis de bioimagen.

3. Tinción por inmunofluorescencia de organoides de montaje completo

1. Retira los organoides del medio (paso 1.11) en un tubo de microcentrífuga y lava dos veces con 500 μL de 1 PBS.
2. Fija los organoides con 500 μL de PFA al 4% durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego descarta el PFA y lava con 500 μL de PBS 3 veces.
3. Permeabiliza los organoides fijos con 0,5 mL de tampón bloqueante durante la noche a 4 °C.
4. Al día siguiente, retirar el tampón bloqueante, añadir anticuerpos primarios (300-500 μL) de colágeno III (COL3A1) con dilución (1:500) y AHR con dilución (1:1000), e incubar las muestras a 4 °C durante la noche.
5. Lava los organoides 3 veces con 500 μL de 1 PBS y luego incuba con anticuerpos secundarios (594 IgG anticonejo de cabra y 488 IgG anti-ratón de cabra) durante la noche a 4 °C en la oscuridad.
6. Lava los organoides 3 veces con 500 μL de PBS 1x, luego incuba con 5 μg/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en 1x PBS (300-500 μL por muestra) a temperatura ambiente durante 20 minutos.
7. Lava los organoides tres veces con 500 μL de PBS 1x e imagen con un microscopio confocal (Figura 3B).

4. Disociación organoide

1. Reconstituye 100 mg de papaína en una solución activadora esterilizada con filtro a una concentración de 250 U/mL, incuba la solución a 37 °C durante 30 minutos para activar la enzima
   NOTA: Puede almacenarse a 2 - 8 °C durante hasta 2 semanas.
2. Prepara una solución de disociación (inmediatamente antes de su uso) con 30 U/mL de papaína y 125 U/mL de DNasa I en la Solución Balanceada de Sal (HBSS) de Hanks.
3. Transfiere los organoides (paso 1.11) a placas de 24 pozos y añade 500 μL de solución de disociación.
4. Incubar las muestras a 37 °C durante 30-60 minutos en un agitador orbital ajustado a 90 rpm.
5. Triturar intermitentemente 5x-6x usando un pipetador de 1 mL a temperatura ambiente para obtener una suspensión compuesta principalmente por células individuales.
6. Añadir la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mL que contiene una solución inhibidora de proteasa (1 mL de 10 mg/mL) y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos para pelletar las celdas y descartar el sobrenadante.
7. Si vuelves a suspender las celdas en el buffer correspondiente, la suspensión resultante de una sola célula se muestra en la Figura 2I.

Results

Ya el primer día tras la siembra, los SC comenzaron a auto-agregarse, formando organoides, como se representa. Determinamos que la densidad óptima de siembra era de 10.000 SCs, que formaban organoides de forma consistente cuando se cultivaban en un sistema de cultivo definido. Este sistema empleaba hidrogeles que contenían colágeno como andamiaje ECM para las células madre incrustadas y el medio de proliferación durante 7 días en una placa de 96 pozos de ...

Discussion

Los organoides son estructuras tridimensionales que se asemejan a órganos miniaturizados y consisten en células autoorganizadas derivadas de células madre o muestras^{de tejido 11}. Los organoides de células madre derivados de tejido de los pacientes tienen el potencial de revolucionar la investigación biomédica y las aplicaciones clínicas debido a su notable capacidad para replicar con precisión la fisiología y la enfermedad¹² de la UF. Aquí,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-fotones confocales   Microscopio	Leica, EE. UU.
Agarose I	VWR Corporation, EE. UU.	97062-248
Microplacas Esferoides Akura 96	InSphero	CS-09-004-03	Placas de bajo sujeción en V
Alexa Fluor 488 anti-ratón IgG	Life Technologies, CALI, EE. UU.	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 anticonejo para cabras IgG	Life Technologies, CALI, EE. UU.	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwán	(GTX227700a)	(1:1000)
Anticuerpo actina anti-alfa para músculo liso y anticuerpo actina;	Abcam, MA, EE. UU.	(ab7817)	1 & micro; g/mL
Anticuerpo anticolágeno III y nbsp;	Abcam, MA, EE. UU.	(ab7778)	(1:500)
Anticuerpo Anti-SOX1	Abcam, MA, EE. UU.	ab242125	(1:500)
Factor de ancración	Gibco, EE. UU.	S-006-100
Búfer de bloqueo	Dako	X0909	5%  suero de caballos + 0,5%  Triton X-100  en 1X  PBS
Criostato	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Thermo Scientific, Alemania	62248	1 mg/mL
DNasa I	Termo-Científica, Lituania	EN0521
Dullbecco' s modificado Eagle' s medium DMEM y  F12	Gibco, EE. UU.	21041-025
Suero bovino fetal	Omega Scientific y nbsp; Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (hidrogeles que contienen colágeno)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF plus Medium (Medio proliferante de células madre sin suero y nbsp; )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá	5446
Compuesto OCT (Compuesto a temperatura óptima de corte)	Sakura, EE. UU.	4583
Microscopio Olympus BX41	Olympus America, Center Valley, PA
Solución inhibidora de proteasa ovomucoide	Worthington Biochemical Corporation, EE. UU.	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, EE. UU.	LK003176	solución de activación (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoetanol, 5,5 mM L-cisteína HCl)
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Gibco, EE. UU.	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldehído) 4%	Invitrogen, EE. UU.	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al. & nbsp; QuPath: Software de código abierto para análisis de imágenes de patología digital.  Informes Científicos   (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Software para análisis de bioimagen
Microscopio de lapso de tiempo
Frascos de cultivo de tejidos	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Tripsina y nbsp;	Gibco, EE. UU.	A12859-01	0,25% de tripsina y 0,1% de EDTA en HBSS sin calcio ni magnesio
Medio de montaje antifade VECTASHIELD complementado con DAPI	Vector Laboratories, CALIFORNIA, EE. UU.	#  UX-93952-24	1  ng/mL