Técnicas de cultivo y procesamiento de organoides tridimensionales para la generación de miomas y miomas uterinos

Summary

Este protocolo describe una técnica manual para crear hidrogeles que contienen colágeno incrustados con cultivos organoides 3D de células madre a partir de tejido miometrial y mioma.

Abstract

Los fibromas uterinos son los tumores benignos, monoclonales y ginecológicos más comunes en el útero de una mujer. Para superar los obstáculos comunes relacionados con los métodos utilizados en el estudio de estas patologías, nuestro objetivo fue idear una estrategia para generar modelos organoides tridimensionales de miometrio y miomas uterinos utilizando hidrogeles que contienen colágeno como andamios de incrustación. Concretamente, se explotaron hidrogeles que contienen colágeno en placas de bajo acoplamiento en V-bottom de 96 pozos. Este método permitió el desarrollo de organoides 3D de dos tipos de células madre a partir de miometrio normal y miometrio que contiene miomas uterinos, incrustándolos en hidrogeles que contienen colágeno y formando organoides en un medio adecuado para la proliferación de células madre. Los organoides lograron diferenciarse, proliferar y autoorganizarse en estructuras complejas, desarrollando un sistema sostenible. La importancia de este modelo es la comprensión de la fisiopatología y la etiopatogénesis, así como la prueba de nuevos fármacos para prevenir o tratar los fibromas uterinos.

Introduction

Los miomas uterinos, o leiomiomas, son los tumores benignos más comunes del^{útero 1}. Afectan a una parte significativa de las mujeres durante sus años reproductivos, y la investigación sugiere que alrededor del 77% de ellas las experimenta en algún momento. Aunque muchas mujeres tienen miomas sin síntomas, un 25% sustancial experimenta síntomas como sangrado uterino anormal, dolor pélvico o^{infertilidad 2}. El desarrollo y crecimiento de los fibromas están influenciados por una variedad de factores, incluyendo hormonas sexuales, factores de crecimiento, cambios genéticos y otros mecanismos<....

Protocol

El protocolo fue aprobado por el Comité de Etnia de la Universidad de Chicago, con el número de aprobación IRB#20-1414. Según el banco de tejidos de la Universidad de Chicago, se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos de los que se recogió el tejido.

1. 3D Cultura del organoide

1. Cultivar y mantener las células madre miometriales y UF (SC) aisladas y purificadas, tal como se describió^{anteriormente.}
2. Obtén los CS del nitrógeno líquido y déjalos descongelar. Un diagrama de flujo del proceso de cultivo se muestra en la Figura 1

Results

Ya el primer día tras la siembra, los SC comenzaron a auto-agregarse, formando organoides, como se representa. Determinamos que la densidad óptima de siembra era de 10.000 SCs, que formaban organoides de forma consistente cuando se cultivaban en un sistema de cultivo definido. Este sistema empleaba hidrogeles que contenían colágeno como andamiaje ECM para las células madre incrustadas y el medio de proliferación durante 7 días en una placa de 96 pozos de .......

Discussion

Los organoides son estructuras tridimensionales que se asemejan a órganos miniaturizados y consisten en células autoorganizadas derivadas de células madre o muestras^{de tejido 11}. Los organoides de células madre derivados de tejido de los pacientes tienen el potencial de revolucionar la investigación biomédica y las aplicaciones clínicas debido a su notable capacidad para replicar con precisión la fisiología y la enfermedad¹² de la UF. Aquí,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-fotones confocales   Microscopio	Leica, EE. UU.
Agarose I	VWR Corporation, EE. UU.	97062-248
Microplacas Esferoides Akura 96	InSphero	CS-09-004-03	Placas de bajo sujeción en V
Alexa Fluor 488 anti-ratón IgG	Life Technologies, CALI, EE. UU.	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 anticonejo para cabras IgG	Life Technologies, CALI, EE. UU.	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwán	(GTX227700a)	(1:1000)
Anticuerpo actina anti-alfa para músculo liso y anticuerpo actina;	Abcam, MA, EE. UU.	(ab7817)	1 & micro; g/mL
Anticuerpo anticolágeno III y nbsp;	Abcam, MA, EE. UU.	(ab7778)	(1:500)
Anticuerpo Anti-SOX1	Abcam, MA, EE. UU.	ab242125	(1:500)
Factor de ancración	Gibco, EE. UU.	S-006-100
Búfer de bloqueo	Dako	X0909	5%  suero de caballos + 0,5%  Triton X-100  en 1X  PBS
Criostato	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Thermo Scientific, Alemania	62248	1 mg/mL
DNasa I	Termo-Científica, Lituania	EN0521
Dullbecco' s modificado Eagle' s medium DMEM y  F12	Gibco, EE. UU.	21041-025
Suero bovino fetal	Omega Scientific y nbsp; Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (hidrogeles que contienen colágeno)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF plus Medium (Medio proliferante de células madre sin suero y nbsp; )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá	5446
Compuesto OCT (Compuesto a temperatura óptima de corte)	Sakura, EE. UU.	4583
Microscopio Olympus BX41	Olympus America, Center Valley, PA
Solución inhibidora de proteasa ovomucoide	Worthington Biochemical Corporation, EE. UU.	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, EE. UU.	LK003176	solución de activación (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoetanol, 5,5 mM L-cisteína HCl)
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Gibco, EE. UU.	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldehído) 4%	Invitrogen, EE. UU.	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al. & nbsp; QuPath: Software de código abierto para análisis de imágenes de patología digital.  Informes Científicos   (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Software para análisis de bioimagen
Microscopio de lapso de tiempo
Frascos de cultivo de tejidos	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Tripsina y nbsp;	Gibco, EE. UU.	A12859-01	0,25% de tripsina y 0,1% de EDTA en HBSS sin calcio ni magnesio
Medio de montaje antifade VECTASHIELD complementado con DAPI	Vector Laboratories, CALIFORNIA, EE. UU.	#  UX-93952-24	1  ng/mL