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Artículo de método

Modelo murino de inmunomodulación inducida epicutáneamente

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DOI:

10.3791/67578

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24 de junio de 2025

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1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El estudio demuestra el papel de la piel en la modulación de las respuestas inmunitarias en ratones a través de la inmunización epicutánea (EC). La inmunización de la AE con un antígeno proteico puede suprimir las respuestas inmunitarias en la hipersensibilidad de contacto o revertir la supresión inducida por la piel cuando se combina con patrones moleculares asociados a patógenos. La inmunización anticonceptiva anticonceptiva (AE) se muestra prometedora como un enfoque eficaz y sin agujas para la inmunoterapia.

Resumen

La piel, como el órgano más grande del cuerpo humano que interactúa con el entorno externo, desempeña funciones fisiológicas cruciales, que incluyen (1) proteger al organismo de xenobióticos y microorganismos, (2) facilitar la termorregulación, (3) mantener el equilibrio de agua y electrolitos, (4) sintetizar vitamina D y (5) participar en la inmunidad. Este artículo destaca la participación fundamental de la piel en los mecanismos inmunológicos, mostrando su capacidad para inmunomodular mediante la supresión o potenciación de la respuesta inmune. Los hallazgos anteriores revelan que, en ratones, la inmunización epicutánea (EC) con un antígeno, ya sea sola o junto con patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), puede suprimir o potenciar las respuestas inmunitarias, respectivamente. En concreto, se observó que la inmunización de la CE con un antígeno puede suprimir las respuestas inmunitarias en varios modelos murinos de enfermedades autoinmunes o dermatitis alérgica de contacto. Los resultados indican que la inmunización de la CE con un antígeno combinado con PAMPs podría servir como una estrategia eficaz para aumentar la inmunidad contra patógenos o aliviar las alergias dependientes de linfocitos T helper tipo 2 (Th2). Este protocolo describe un método para inducir la supresión de la piel a través de la aplicación epicutánea de un antígeno en un modelo murino de dermatitis de contacto alérgica humana (ACD)-hipersensibilidad de contacto (CHS) mediada por células Th1. Sin embargo, también se puede aplicar a varios modelos de trastornos murinos. El artículo presenta la inmunomodulación inducida por la CE como un modelo murino atractivo para la inmunoterapia sin aguja en diversos trastornos.

Introducción

Este artículo presenta un método para inducir tolerancia (referida como "supresión" a lo largo de este texto) en un modelo murino de hipersensibilidad de contacto (CHS) y para revertir esta tolerancia (referida como "contrasupresión" a lo largo de este texto) a través de la aplicación epicutánea (CE) de un antígeno solo o en combinación con ligandos para receptores de reconocimiento de patógenos (PRRs), respectivamente1. En el protocolo descrito, (a) se utilizan inmunoglobulinas haptenizadas de ratón (TNP-Ig) como antígeno para suprimir la hipersensibilidad de contacto o (b) antígeno con patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), ligandos para receptores tipo Toll (TLR) y receptores similares a proteínas (NLR) que contienen dominios de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD), para revertir la supresión inducida por la piel 2,3,4. Los hallazgos indican que la inmunomodulación inducida por la CE está mediada por células T supresoras (Ts) no específicas de antígeno y células T contrasupresoras (Tcs) específicas de antígeno. Estas células pueden examinarse en un modelo de ratón de transferencia celular adoptiva para determinar el mecanismo de las reacciones probadas. El protocolo actual describe dos modelos de transferencia de células, "transferencia adoptiva de entrada" y "transferencia adoptiva de salida". La IN de transferencia adoptiva es útil para probar la inmunomodulación en las fases aferente y eferente del CHS. Por otro lado, la "transferencia adoptiva OUT" refleja el efecto de la inmunomodulación solo en la fase eferente del CHS.

El artículo describe un método de supresión inducida por la piel mediante la aplicación epicutánea de un antígeno en un modelo murino de dermatitis de contacto alérgica humana (ACD) - hipersensibilidad de contacto (CHS) mediada por linfocitos T helper tipo 1 (Th1)5. Sin embargo, también se probó la eficacia de este enfoque en la regulación (supresión, tolerancia) de modelos experimentales de CHS 6,7 mediada por linfocitos T citotóxicos tipo 1 (Tc1), enfermedades autoinmunes como la artritis inducida por colágeno (CIA)8,9, encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)10,11 y colitis ulcerosa12. Además, el protocolo describe el método de contrasupresión inducida por la piel (supresión inversa) mediante la aplicación CE de un antígeno junto con ligandos PRR en un modelo murino de CHS 13,14,15,16. Los resultados presentados indican que la supresión no específica de antígeno inducida por la CE puede revertirse mediante la purificación de los ligandos TLR2, TLR3, TLR4, TLR9 y NOD2. El método de contrasupresión inducida por la piel también se empleó en un modelo animal de dermatitis atópica (EA), lo que demuestra que el tratamiento con CE con un antígeno en presencia de moléculas sintéticas de ADN monocatenario que contienen oligodesoxinucleótidos no metilados (CpG) - ligando para TLR9 puede suprimir las respuestas mediadas por Th2 de una manera específica del antígeno (desplaza la respuesta inmunitaria hacia un fenotipo Th1/Th17)17. El método descrito también se probó en la neumonía neumocócica, demostrando que la inmunización de la CE con polisacárido antineumocócica conjugado con albúmina sérica bovina (PC-BSA), junto con CpG, podría mejorar potencialmente la inmunidad contra Streptococcus pneumoniae18.

Un aspecto fundamental de la inmunomodulación inducida por la CE es la selección del modelo y la naturaleza del antígeno. El artículo incluye una tabla que detalla los antígenos utilizados, la duración de la exposición al antígeno y la especificidad de las células T de los modelos probados (ver Tabla 1). El método descrito para la inmunomodulación está dirigido a enfermedades que involucran linfocitos T específicos de antígeno. La efectividad de este método se evaluó utilizando un antígeno compatible aplicado a la CE en el proceso. La compatibilidad del antígeno es crucial para garantizar que interactúe eficazmente con los linfocitos T implicados en el proceso de la enfermedad. La aplicación de un parche proteico o peptídico sobre la piel intacta facilita la penetración del antígeno a través de la epidermis19,20. Este aumento de la penetración del antígeno se atribuye a una mayor transpiración debajo del apósito. Las alteraciones en la permeabilidad epidérmica ocurren dentro de las 4-10 h posteriores a la aplicación del parche, mientras que la inmunomodulación inducida por la CE puede permanecer efectiva hasta por dos semanas 5,14.

Aunque el tratamiento de la AE es ampliamente utilizado, la existencia de muchas variaciones de este método podría plantear interrogantes. Los conocimientos actuales sugieren que la extensión del daño epidérmico antes de la administración del antígeno puede influir en la naturaleza de la respuesta inmunitaria resultante21. El daño epidérmico superficial desencadena la liberación de citoquinas antiinflamatorias por parte de las células de Langerhans, favoreciendo el inicio de la respuesta Th222. Por el contrario, un daño epidérmico más extenso promueve la liberación de citocinas proinflamatorias y facilita la entrega de antígenos a las células dendríticas dérmicas23. El protocolo presentado destaca (a) el reconocimiento de desafíos al aplicar este método en animales pequeños y activos, particularmente ratones; (b) considerar factores como el estado de la piel después del afeitado con navaja, el contacto adecuado de las sustancias con la piel, el tiempo de exposición y las condiciones higiénicas de la piel durante el tratamiento con CE, que pueden determinar la eficacia del tratamiento. Es crucial considerar el método de depilación de la piel, ya sea físico o químico, antes de la aplicación del antígeno, ya que las diferentes preparaciones cutáneas pueden afectar la condición de la piel de varias maneras. Se reconoce que todos estos procedimientos pueden activar las células inmunitarias de la piel, lo que puede provocar infecciones cutáneas o influir en la progresión de la enfermedad. Los posibles efectos secundarios en las afecciones de la piel después de la depilación deben ser una consideración primordial a la hora de seleccionar el método de depilación. Los investigadores describieron un método de supresión inmunitaria mediada por células T inducida a través de la aplicación de un antígeno en la piel dorsal afeitada con navaja, demostrando su efecto en varios modelos de respuestas inmunitarias de ratón. La aplicación de EC del antígeno, junto con los PAMP, induce células T contrasupresoras específicas del antígeno. Además, el método presentado de aplicación de CE, particularmente con exposición repetida a antígenos o PAMP, no causa efectos secundarios preocupantes.

El protocolo descrito subraya la importancia de varios factores para lograr resultados fiables y repetibles con este método, especialmente en animales pequeños como ratones. La naturaleza no invasiva de este enfoque generalmente resulta en un menor riesgo de reacciones adversas (como dolor, infección o cicatrices) en comparación con las técnicas de inmunización intradérmica o inyectable. La inmunización epicutánea es fácil de usar y de administrar en entornos no clínicos, lo que mejora la accesibilidad y el cumplimiento en comparación con los métodos más invasivos.

Tabla 1: Modulación de la respuesta inmune inducida por la CE en diferentes modelos de enfermedad en ratones. Abreviaturas: ACD = dermatitis alérgica de contacto; DA = dermatitis atópica; Ag = antígeno; CIA = artritis inducida por colágeno; CHS = hipersensibilidad de contacto; CFA = adyuvante de Freund completo; COLL II = colágeno tipo II; DNFB = 2,4-dinitrofluorobenceno; DNP-BSA = dinitrofenilo conjugado con albúmina sérica bovina; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; CE = epicutánea; LPS = lipopolisacárido; OVA = ovoalbúmina; PAMP = patrón molecular asociado al patógeno; PC-BSA = polisacárido neumocócico conjugado con albúmina sérica bovina; Th1 = Linfocito T helper tipo 1; Tc1 = linfocito T citotóxico de tipo 1; TNCB = 2,4,6-trinitroclorobenceno; TNP-Ig = inmunoglobulinas de ratón conjugadas con 2,4,6-trinitrofenil; Ts = Células T supresoras; Tcs = Células T contrasupresoras. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Protocolo

Todos los experimentos presentados en este artículo fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices del1º y2º Comité Ético Local de Experimentación con Animales en Cracovia, Polonia. Los procedimientos cumplieron con las recomendaciones locales, en particular en lo que respecta a la administración de ketamina/xilacina o isoflurano como anestésicos, el afeitado de la piel del ratón con hojas de afeitar, la aplicación de sustancias/haptenos en la piel afeitada y en ambos lados de las orejas, y la recolección de órganos inmunes periféricos. El estudio utilizó ratones machos y hembras CBA/J (H-2k), de 6 a 12 semanas de edad, con pesos corporales que oscilaron entre 20 y 25 g. Los detalles sobre los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación animal

  1. Ratones domésticos juntos; Es importante prevenir los efectos negativos del aislamiento en su estado de ánimo. Para obtener significación estadística, utilice de 10 a 12 animales por grupo.

2. Preparación del área operativa

  1. Limpie la mesa de operaciones con una solución de etanol al 70% antes y después de todos los procedimientos. Si el uso de ratones requiere condiciones estériles, realice todas las operaciones dentro de un gabinete de bioseguridad.

3. Inducción de células supresoras (Ts) para la reacción CHS mediada por Th1

NOTA: Este procedimiento se muestra en la Figura 1A.

  1. El día "0" anestesiar a los ratones con un 30% de isoflurano en propilenglicol. Sostenga el ratón en la mano izquierda, exponiendo el lado dorsal de su cuerpo. Con la mano derecha, enjabonar el jabón gris con abundante agua y aplicarlo sobre la piel.
    1. Con una cuchilla de afeitar estéril, afeita suavemente un área de piel de 2 cm². Evite lesionar la piel. Cualquier lesión en la piel descalificará a los ratones para realizar más procedimientos.
      NOTA: El jabón gris es un producto natural e hipoalergénico elaborado a partir de una suave base vegetal. Regenera e hidrata eficazmente las pieles secas y sensibles. Este jabón no contiene colorantes artificiales, fragancias sintéticas ni ingredientes de origen animal. Los ingredientes incluyen palmato de sodio, kernelato de palma de sodio, aqua (agua), glicerina, extracto de flor/hoja/tallo de Taraxacum officinale (diente de león), ácido de palma, ácido de palmiste, cloruro de sodio, propilenglicol, EDTA tetrasódico, ácido etidrónico. El jabón gris está diseñado para pieles sensibles y delicadas que son propensas a la irritación y la psoriasis. Limpia eficazmente la piel problemática al tiempo que evita la sequedad excesiva y la sensación de tirantez. Este jabón también calma las irritaciones, hidrata y promueve una regeneración más rápida de la piel. Es importante destacar que no compromete la barrera protectora de la piel.
  2. Coloca a los ratones en la jaula. Después del afeitado, espere al menos seis horas antes de aplicar el antígeno para permitir que la piel se seque y el animal la limpie.
  3. En el día "+1", prepare una solución de 1 mg/mL de inmunoglobulina de ratón conjugada con el antígeno 2,4,6-trinitrofenil (TNP-Ig), en solución salina estéril tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Prepare el volumen de un antígeno 1200 μL para diez ratones. Mezcle las soluciones justo antes de usar en un vial de 2 ml. Proteja el TNP-Ig de la luz cubriendo el vial con papel de aluminio.
    NOTA: Incluya un grupo de control de CHS de ratones tratados solo con el vehículo (DPBS) para evaluar las reacciones inflamatorias inespecíficas causadas por el afeitado y la aplicación del solvente en el lugar afeitado. Se debe utilizar un tipo diferente de antígeno para la inducción de Ts para probar su especificidad de antígeno. Las inmunoglobulinas (Ig) de ratón se prepararon a partir de sueros de ratón y se conjugaron con hapteno TNP (Archivo suplementario 1). Se utilizó un solo preparado con un nivel de sustitución de 40 TNP por molécula de Ig (TNP40-Ig) a lo largo de24,25.
  4. El mismo día, anestesiar ratones con un 30% de isoflurano en propilenglicol. Aplique el antígeno en la mancha previamente afeitada colocando un parche de gasa de 1cm2 empapado en 100 μL del antígeno (preparado en el paso 3.3). Cúbralo con un parche de plástico delgado (2 cm²) y asegúrelo con cinta adhesiva para tela. En el grupo de control CHS, aplique solo DPBS.
    NOTA: Se pueden utilizar fundas transparentes para documentos de 30 μm para el parche de plástico. La cinta adhesiva de tela debe ser fácilmente removible, flexible, adaptarse a las formas del cuerpo y permitir la permeabilidad al aire y al vapor de agua.
  5. En el día "+5", anestesiar a los ratones con un 30% de isoflurano en propilenglicol. Corta con cuidado el parche con unas tijeras de seguridad con esquinas redondeadas y luego retira suavemente la cinta adhesiva. Permita que los ratones se muevan libremente y limpien su piel de forma natural durante al menos 4 h. Si es necesario, afeita el vello que haya vuelto a crecer en el sitio de la aplicación del antígeno, aunque esto generalmente no es necesario.
    NOTA: Corte la cinta adhesiva solo en el área de administración del antígeno (área de gasa y plástico), donde se adhiere firmemente solo en los bordes del vendaje. Espere al menos 4 h antes de aplicar el antígeno para permitir que la piel se seque y el animal la limpie.
  6. En el día "+5", repita los pasos 3.3 y 3.4.
  7. En el día "+8", repita el paso 3.5. Esto marca la finalización de una exposición cutánea de una semana al antígeno. Después de este período, utilice los ratones para probar la supresión de la reacción CHS -modelos activos in vivo (paso 6) o eutanasiarlos para que sirvan como donantes de células T en "transferencia adoptiva IN" (paso 8) o en "transferencia adoptiva OUT" (paso 9).

4. Inducción de linfocitos T contrasupresores (Tcs) para la reacción CHS mediada por Th1

NOTA: Este procedimiento se muestra en la Figura 1B.

  1. En el día "0" ejecute los pasos 3.1-3.2.
  2. En el día "+1", prepare una mezcla de 100 μg de antígeno TNP-Ig y 100 μg de LPS (ejemplo de PAMP) en 100 μL de DPBS. Prepare la solución inmediatamente antes de usarla en un vial de 2 ml y protéjala de la luz envolviendo el vial en papel de aluminio si el antígeno es fotosensible.
    NOTA: Para evaluar la contrasupresión (reversión de la supresión inducida por la piel), se debe incluir un control de supresión (grupo control Ts), donde los ratones son tratados solo con el antígeno TNP-Ig. Además, se deben incluir ratones tratados únicamente con DPBS (control CHS) y LPS solo (control PAMP) para determinar el grado de modulación no específica de las respuestas inmunitarias. El LPS es un ejemplo de partícula inmunoestimuladora26. Las características específicas de cualquier estimulador inmunitario dependen del modelo de ratón utilizado, de los tipos de células inmunitarias implicadas en la respuesta inmunitaria que se estudia y de la farmacocinética de las sustancias investigadas.
  3. El mismo día, anestesiar ratones con un 30% de isoflurano en propilenglicol. Colocar un parchede gasa de 1 cm2 sobre la piel afeitada previamente, saturada con una solución que contenga 100 μL de la mezcla (preparada en el paso 4.2). Asegure la gasa con un parche de plástico delgado (2 cm²) y fíjela en su lugar con yeso adhesivo para telas. En los grupos de control, aplique DPBS (control CHS) o LPS (control PAMP), o TNP-Ig solo (grupo de control Ts).
    NOTA: Se pueden utilizar fundas transparentes para documentos de 30 μm para el parche de plástico. La cinta adhesiva de tela debe ser fácilmente removible, flexible, adaptarse a las formas del cuerpo y permitir la permeabilidad al aire y al vapor de agua.
  4. En el día "+5", ejecute el paso 3.5.
  5. En el día "+5", repita los pasos 4.2 y 4.3.
  6. En el día "+8", repita el paso 3.5. Se termina una semana de exposición cutánea al antígeno mezclado con LPS. Después de este período, pruebe ratones en la reacción CHS - modelos activos in vivo (paso 6), o eutanasiar para que sirvan como donantes de células Tcs en "transferencia adoptiva OUT" (paso 10).

5. Inducción de células T efectoras (Teff) para la reacción CHS mediada por Th1 (fase de sensibilización de CHS)

  1. En el día "0", afeitar el pecho y el abdomen de los ratones (área de 2 × 2 cm) con jabón gris con agua seguido de una cuchilla de afeitar. Deje reposar la piel durante 6 horas antes de aplicar el hapteno para asegurar la ausencia de irritación.
  2. El mismo día, justo antes de usar, prepare la solución de hapteno (5%) en un vial de vidrio y cúbralo con papel de aluminio para protegerlo de la luz: 2,4,6-trinitroclorobenceno (TNCB) en una mezcla de acetona y etanol (proporción 1:3).
  3. El mismo día, sensibilizar a los ratones aplicando 150 μL de hapteno en la mancha previamente afeitada. Aplicar el vehículo solo (mezcla de acetona-etanol) en el grupo control negativo para evaluar la reacción inflamatoria inespecífica. Antes de devolver al animal a la jaula, espere 30 segundos para que la piel se seque.
    PRECAUCIÓN: Use guantes; El TNCB causa reacciones alérgicas graves en la mayoría de las personas.

6. Modelo activo: Pruebas de células Ts o Tcs en CHS mediado por Th1

NOTA: Este procedimiento se muestra en la Figura 2.

  1. Induzca la célula Ts o Tcs siguiendo los pasos 3 y 4. Este procedimiento durará desde el día "0" hasta el día "+8".
  2. En el día "+8", comience a inducir células de Teff siguiendo el paso 5.
  3. Cuatro días después, evalúe la respuesta de CHS realizando la fase de elicitación (desafío). En resumen, aplique TNCB a ambos lados de las orejas. Luego, cuantifica el grosor de las orejas midiéndolas con un micrómetro. Una descripción detallada de esta prueba y de otros posibles criterios de valoración se presenta en otra parte (Zemelka-Wiacek M. et al.27).

7. Aislamiento de células Teff, Ts o Tcs de ratones donantes

  1. Esterilice la mesa de operaciones con una solución de etanol al 70% antes y después de cada procedimiento. Llevar a cabo todos los procedimientos dentro de un gabinete de bioseguridad para mantener la esterilidad y utilizar instrumentos esterilizados. Para aislar las células Ts, Tcs y Teff en el día "+8", utilice ratones inmunizados con CE descritos en los pasos 3, 4 y 5, respectivamente.
    NOTA: Respete una proporción de donante a receptor de 1:1.
  2. Anestesiar a los donantes con una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (90-120 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg). Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado durante al menos 5 minutos.
  3. Desinfectar toda el área abdominal del ratón anestesiado con etanol al 70%, luego incidir la capa abdominal (3-4 cm) para exponer la cavidad peritoneal. Aísle los ganglios linfáticos auxiliares e inguinales (ALN) y el bazo (SPL) con las pinzas estériles en tubos llenos de DPBS estéril que se complementa con suero fetal bovino (FBS) al 1%. Agrupe los ALN de todos los donantes en un vial y los SPL en otro y mantenga los viales en hielo. Cada axila contiene dos ganglios linfáticos axilares, mientras que un solo ganglio linfático inguinal está situado en la región de la cadera adyacente a tres vasos sanguíneos. Los SPL se colocan en el lado izquierdo del cuerpo, detrás del intestino y el estómago.
    NOTA: Trabaje con herramientas estériles debajo de la cabina de bioseguridad para mantener las condiciones estériles. Después de este procedimiento, los ratones deben ser sacrificados siguiendo protocolos aprobados institucionalmente.
    1. Machaca el tejido entre los extremos esmerilados de dos portaobjetos de microscopio. Cuele la suspensión celular a través de un colador celular con un tamaño de poro de 70 μm.
  4. Enjuague las células con 30 mL de DPBS suplementado con FBS al 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 1-5 mL de DPBS.
  5. Cuente la viabilidad de la célula usando un hemocitómetro y azul de tripán. Mezcle 10 μL de suspensión celular con 90-990 μL de Trypan Blue, ajustando el volumen en función del recuento de células. Incorporar este factor de dilución en el cálculo de viabilidad.
  6. Prepare una mezcla de ALN y SPL (proporción 1:1). Respete el número de células: utilice de 1 a 5 x 107 células Ts o Tcs por recipiente en 1 ml de DPBS suplementado con 1% de FBS y 7 x 107 células Teff/receptor en 1 ml de DPBS. Mantener la proporción donante-receptor para todas las poblaciones celulares en 1:1 y también la relación donante-DPBS en 1:1. Mantenga los viales con células en el hielo.
    NOTA: La realización de nuevos experimentos in vitro requiere un aumento proporcional en el número de donantes de células.
    NOTA: Además, las células Teff, Ts y Tcs aisladas pueden someterse a una purificación adicional o a análisis mediante citometría de flujo, como el fenotipado o la evaluación de la secreción de citocinas. También es factible iniciar cultivos celulares para explorar la capacidad de proliferación celular o cuantificar los niveles de citocinas en los sobrenadantes de cultivo. La realización de nuevos experimentos requiere un aumento proporcional en el número de donantes de células.

8. Transferencia adoptiva IN: Pruebas de Ts en CHS mediada por Th1

NOTA: Este procedimiento se muestra en la Figura 3. Trabaje estérilmente y use una solución de etanol al 70% antes y después de cada procedimiento. Asegúrese de que todas las operaciones de las células se lleven a cabo dentro de un gabinete de bioseguridad para mantener la esterilidad y utilizar instrumentos esterilizados.

  1. Induzca y aísle las células T (donantes) siguiendo los pasos 3 y 7. Enjuague las células con 30 mL de DPBS. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de células en 200 μL de DPBS por receptor (relación donante-receptor 1:1).
  2. Receptores (ratones singénicos naïve): anestesiar a los receptores con una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (90-120 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg). Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado durante al menos 5 minutos.
  3. Administrar una inyección intravenosa (i.v.) de una mezcla preparada de 1-5 x 107 células Ts (paso 8.2) en 200 μL en el receptor anestesiado.
  4. El mismo día, inducir una reacción CHS mediada por Th1. En resumen, inducir la célula de Teff (fase de sensibilización) descrita en los pasos 5.1-5.3). Cuatro días después, evalúe la respuesta de CHS realizando la fase de elicitación (desafío) descrita en el paso 6.3.

9. Transferencia adoptiva OUT: Pruebas de Ts en CHS mediada por Th1

  1. Induzca y aísle las células T y Teff (donantes) siguiendo los pasos 3, 5 y 7. Mantenga el Ts y el Teff aislados en dos viales separados. Divida las células de Teff en dos viales: uno para el "grupo de prueba Ts" y otro para el "control CHS".
    NOTA: Trabaje estérilmente y use una solución de etanol al 70% antes y después de cada procedimiento. Asegúrese de que todas las operaciones de las células se lleven a cabo dentro de un gabinete de bioseguridad para mantener la esterilidad y utilizar instrumentos esterilizados. Incluya un grupo de control de receptores a los que solo se administrarán células de Teff ("control de CHS"). Para este grupo, se deben utilizar donantes adicionales para adherirse a la proporción donante-receptor de 1:1. Para mejorar la calidad de los resultados, se deben añadir los receptores que reciben células de control transferidas de donantes tratados con CE con una solución solvente. La decisión de agregar cualquier grupo adicional de receptores y donantes debe planificarse cuidadosamente, porque este enfoque requiere muchos ratones, lo que no cumple con el principio de las 3R (Reducir, Refinar, Reemplazar).
  2. Agregue células Ts a células Teff para el "grupo de prueba Ts". Añada DPBS adecuado a las células de Teff en el vial de "control CHS".
    NOTA: Mantenga el número de pilas 1-5 x 107 Ts y 7 x 107 pilas Teff por recipiente.
  3. Mezcle todos los viales suavemente. Mantener los viales en el baño de agua (37 °C) durante 30 min, mezclando suavemente cada 5 min.
  4. Enjuague cada vial de células con 30 mL de DPBS suplementado con FBS al 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 200 μL de DPBS/recipiente.
  5. Pase cada suspensión celular a través de un filtro de células de poro de 70 μm. Si es necesario, ajuste el volumen de 200 μL de DPBS/recipiente.
  6. Receptores (ratones singénicos naïve): anestesiar a los receptores con una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (90-120 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg). Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado durante al menos 5 minutos.
  7. Administrar una inyección intravenosa (i.v.) de células preparadas.
  8. El mismo día, inducir la fase de elicitación de CHS (desafío) descrita en el paso 6.3. Incluir el "control negativo", donde la conducta solo desafía a CHS.

10. Transferencia adoptiva OUT: Pruebas de Tcs en CHS mediada por Th1

  1. Induzca y aísle las células Ts, Tcs y Teff (donantes) siguiendo los pasos 3 a 5 y 7.
    NOTA: Trabaje estérilmente y use una solución de etanol al 70% antes y después de cada procedimiento. Asegúrese de que todas las operaciones de las células se lleven a cabo dentro de un gabinete de bioseguridad para mantener la esterilidad y utilizar instrumentos esterilizados. Incluya dos grupos de control de receptores: un "control CHS" en el que solo se administrarán células Teff y un "control Ts" en el que las células Teff se incubarán únicamente con células Ts. Para estos grupos, utilice donantes adicionales para cumplir con la proporción de donante-receptor de 1:1.
  2. Mantenga las células Ts y Tcs aisladas en viales separados. Divida las células de Teff en tres viales: uno para el "grupo de prueba Tcs", uno para el "control Ts" y otro para el "control CHS".
  3. Primera incubación: Para el (a) "grupo de prueba de Tcs", agregue células Tcs a las células Teff. Para el (b) "control de Ts" y (c) "control de CHS", agregue una cantidad adecuada de DPBS a las celdas de Teff (ver Tabla 2).
    NOTA: Conserve el número de pilas 1-5 x 107 Tcs y 7 x 107 pilas Teff por recipiente.
  4. Mezcle todos los viales suavemente. Conservar al baño maría (37 °C) durante 30 min, mezclando suavemente cada 5 min.
  5. Enjuague cada vial de células con 30 mL de DPBS suplementado con FBS al 1%. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 1 mL de DPBS suplementado con 1% de FBS por recipiente. Mantenga una relación mezcla de celdas-DPBS de 1:1.
  6. Segunda incubación: Para el (a) "grupo de prueba de Tcs", agregue células Ts a la mezcla de células Teff y Tcs preincubadas. Para el (b) "control de Ts", agregue células Ts a la mezcla de células Teff preincubadas con DPBS. Para el (c) "control CHS", agregue DPBS adecuado a las células Teff preincubadas.
    NOTA: Mantenga el número de celdas 1-5 x 107 Ts por recipiente. Realizar incubaciones en todos los grupos experimentales (a, b y c) para garantizar la uniformidad en la pérdida de células durante los procedimientos de lavado y centrifugación.
  7. Mezcle todos los viales suavemente. Conservar al baño maría (37 °C) durante 30 min, mezclando suavemente cada 5 min.
  8. Enjuague cada vial de células con 30 mL de DPBS. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 200 μL de DPBS/recipiente.
  9. Pase cada suspensión celular a través de un filtro de células de poro de 70 μm. Si es necesario, ajuste el volumen de 200 μL de DPBS/recipiente.
  10. Receptores (ratones singénicos naïve): anestesiar a los receptores con una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (90-120 mg/kg) y xilacina (5-10 mg/kg). Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado durante al menos 5 minutos.
  11. Administrar una inyección intravenosa (i.v.) de células preparadas.
  12. El mismo día, inducir la fase de elicitación de CHS (desafío) descrita en el paso 6.3. Incluir el "control negativo", donde la conducta solo desafía a CHS.

Tabla 2: Calendario de incubaciones celulares durante la "transferencia OUT" de Tcs. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Resultados

Este estudio examina si los antígenos aplicados a través de la piel solos o combinados con PAMP pueden inducir células T o Tcs, respectivamente, que modulan la reacción CHS. La inmunización de ratones CBA/J vía EC con 100 μg de TNP-Ig o TNP-Ig más 100 μg de LPS induce células Ts o Tcs, respectivamente. A continuación, los ratones se sensibilizaron con TNCB al 5% y se desafiaron con el mismo hapteno 4 días después. La reacción se evaluó midiendo la hinchazón de los oídos...

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Discusión

Las investigaciones se llevaron a cabo en muchos modelos animales diferentes y el uso de muchas cepas de ratón como BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 y B10.PL y SJL demuestran que la inmunización de la CE con un antígeno asignado puede servir como un medio versátil y potencialmente ilimitado para crear tolerancia y controlar las respuestas inmunitarias no deseadas. El protocolo actual describe dos modelos de transferencia celular: (1) 'transferencia adoptiva de IN', que es útil para eval...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por subvenciones del Comité Polaco de Investigación Científica Grants 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 y del Centro Nacional de Ciencias N N401 3554 33 a M.S. Los gráficos se dibujaron con el software GraphPad Prism 10.2.3, y las figuras 1-3 se crearon en BioRender. Zemelka-Wiacek, M. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7 ; (3) https://BioRender.com/0qziglw. Los autores agradecen a Dorota Woźniak por cuidar de las colonias de ratones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2,4,6-trinitroclorobenceno (TNCB)Industria Química de Tokio CO., LTD, JapónC0307
Inmunoglobulina de ratón conjugada con 2,4,6-trinitrofenil (TNP-Ig)Cátedra de Ciencias Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Facultad de Medicina de la Universidad Jaguelónica, Cracovia, Polonia
acetona (reactivo ACS, ≥ 99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Alemania179124
Papel de aluminioMerck KGaA, Darmstadt, AlemaniaZ185140   
balance analítico  Sartorius Weighing Technology GmbH, Gotinga, AlemaniaPRACTUM224-1, 29105177
Alpómina sérica bovina (BSA)Merck KGaA, Darmstadt, AlemaniaA9418
CBA/J (H-2k) Unidad de mejoramiento de la Cátedra de Ciencias Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Facultad de Medicina de la Universidad Jaguelónica, Cracovia, Polonia
Colador de celdas, tamaño de poro 70 y mu; mBIOLOGIX, China15-1070
capacidad de las pipetas desechables: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, AlemaniaZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco y prime; Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)ThermoFisher Scientific,   Waltham, Massachusetts, EE. UU.14190144
Tubos Eppendorf Safe-Lock 1,5 mlEppenforf, Alemania30120086
Tubos de bloqueo Eppendorf Safe-Lock, 2,0 mlEppenforf, Alemania30120094
etanol 100% (alcohol absoluto)Merck KGaA, Darmstadt, Alemania1.07017
etanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Alemania1.59010
Suero fetal bovino (FBS)ThermoFisher Scientific,   Waltham, Massachusetts, EE. UU.A3160802
Portaobjetos de microscopio de vidrio (arenados con arena esmerilado simple)ThermoScientific, Portsmouth, NH, EE. UU.421-004T
Prisma Graph PadGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
jabón gris (jabón de jabón Bialy jelen)Polena ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Polonia163057
HemocitómetroVWR, AVANTOR, EE.UU.612-5719
incubadora Heracell 150iTermo Electron  LED Gmbh, Alemania41071068
isoflurano (Aerrane)Baxter, Deerfield, IL, EE. UU.8AGG9623
Ketamina 100 mg/mL, solución para inyecciónBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poloniacat.# no disponible
Centrífuga de laboratorio (Heraeus Fresco 21)Thermo Scientific, Alemania75002425
Centrifugadora de laboratorio (Heraeus Megafuge 1.0R)  Thermo Scientific, AlemaniaB00013899
Lipopolisacáridos (LPS)Merck KGaA, Darmstadt, AlemaniaL-8274
máscara (FFP2)VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos111-0917
MicrometerMitutoyo, Tokio, Japón193-111
Microscopio con objetivosLeica Microsystems CMS GmbH, AlemaniaDM1000, 294011-082007
propilenglicol  Chempur, Piekary figure-materials-1 Polonia114489005
Cuchilla de afeitarVWR, Radnor, Pensilvania, Estados UnidosPERS94-0462
Fundas transparentes para documentos 30 y micro; mESQUEMA5906961126542
Trippan azulMerck KGaA, Darmstadt, AlemaniaT8154
tubos 15 mL estérilesMerck KGaA, Darmstadt, AlemaniaCLS430055 (Corninig)
tubos de 50 mL, estérilesMerck KGaA, Darmstadt, AlemaniaCLS430290 (Corning)
viales, tapa de rosca, cristal transparente (solo vial) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Alemania27173
Viscoplast Polovis, adhesivo de seda, 5x0.0125m3M Polonia, Nadarzyn, Polonia7100231620
baño marea y nbsp;AJL Electronic, PoloniaLW102
Solución de xilazina (xilapan: 20 mg/mL) para inyecciónVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poloniacat.# no disponible

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