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Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular

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DOI:

10.3791/67579

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15 de noviembre de 2024

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1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, Emory University, 2Atlanta Veterans Affairs Health Care System

En este artículo

Resumen

El abuso del alcohol perjudica la inmunidad de los macrófagos alveolares (AM) debido a la supresión de la respiración mitocondrial y la bioenergética. Recientemente demostramos que la exposición al etanol (EtOH) aumenta la dependencia de la glutamina para la respiración mitocondrial en los AM. En este artículo, se proporcionan métodos para determinar el uso de glutamina para la respiración mitocondrial en AM tratados con EtOH utilizando un bioanalizador de flujo extracelular.

Resumen

Los macrófagos alveolares (AM) son la primera línea de defensa celular en las vías respiratorias inferiores contra los patógenos. Sin embargo, el consumo crónico y excesivo de alcohol afecta la capacidad de los AM para fagocitar y eliminar patógenos del espacio alveolar, en parte a través del metabolismo del combustible desregulado y la bioenergética. Nuestro trabajo previo ha demostrado que el consumo crónico de etanol (EtOH) perjudica la bioenergética mitocondrial y aumenta los niveles de lactato en los AM. Además, recientemente demostramos que el EtOH aumenta la dependencia de la glutamina y la respiración máxima dependiente de la glutamina, al tiempo que disminuye la flexibilidad, alejándose de la respiración dependiente de piruvato y acercándose a la respiración dependiente de la glutamina. La glutaminólisis es una vía compensatoria importante para la respiración mitocondrial cuando se utiliza piruvato para la producción de ácido láctico o cuando otras fuentes de combustible son insuficientes. Utilizando una línea celular AM de ratón, células MH-S, expuestas a ningún EtOH o a EtOH (0,08%) durante 72 h, determinamos la dependencia de la respiración mitocondrial y la bioenergética de la glutamina como fuente de combustible utilizando un bioanalizador de flujo extracelular. Se realizaron mediciones en tiempo real en respuesta al sulfuro de etilo de bis-2-(5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES), un inhibidor de la glutaminasa 1, que previene la conversión enzimática de glutamina en glutamato, en el medio o en respuesta al vehículo solo, seguido de pruebas de estrés mitocondrial. El protocolo paso a paso proporcionado en este documento describe nuestros métodos y cálculos para analizar los niveles promedio de respiración mitocondrial basal dependiente de glutamina, respiración mitocondrial ligada a ATP, respiración mitocondrial máxima y capacidad respiratoria mitocondrial de reserva en múltiples réplicas biológicas y experimentales.

Introducción

El trastorno por consumo de alcohol (TCA) afecta a más de 28 millones de personas enlos Estados Unidos. Las personas con trastorno por consumo de alcohol tienen entre 2 y 4 veces más probabilidades de desarrollar infecciones respiratorias 2,3, lo que aumenta el riesgo de morbilidad y mortalidad prematuras 3,4,5. El abuso del alcohol aumenta la susceptibilidad a las infecciones respiratorias, en parte a través de la supresión de la función inmunitaria pulmonar. Los macrófagos alveolares (AM) son la primera línea de defensa celular contra los patógenos en la parte inferior del pulmón, donde fagocitan y eliminan los microbios inhalados. Sin embargo, el consumo crónico de alcohol perjudica la capacidad de los AM para engullir y matar patógenos 6,7.

Las funciones inmunitarias de los AM, como la fagocitosis, son procesos que requieren mucha energía y que requieren vías metabólicamente activas necesarias para la generación de trifosfato de adenosina (ATP). La fosforilación oxidativa mitocondrial es el proceso celular más eficiente para producir ATP, pero la exposición crónica al etanol (EtOH) aumenta el estrés oxidativo derivado de las mitocondrias, lo que puede resultar en disfunción mitocondrial en los AM 8,9,10. La respiración mitocondrial medida mediante la tasa de consumo de oxígeno celular (OCR) se puede cuantificar utilizando un bioanalizador de flujo extracelular en tiempo real. Para determinar la bioenergética mitocondrial se utilizan los perfiles de respiración mitocondrial evaluados en respuesta a la oligomicina (inhibidor de la ATP sintasa), el cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP, desacoplador de protones) y la rotenona/antimicina A (R/A, inhibidores del complejo mitocondrial I y III, respectivamente). El EtOH crónico disminuye la bioenergética mitocondrial en los MA, como lo demuestra la disminución de la respiración basal mitocondrial, la respiración ligada al ATP, la respiración máxima y la capacidad respiratoria ociosa10.

Las células tienen varios niveles de dependencia de fuentes de combustibles, como el piruvato, la glutamina o los ácidos grasos, para la producción de ATP. También tienen un nivel de flexibilidad mediante el cual pueden cambiar el uso de combustible para regular la bioenergética celular. La glutaminólisis es una vía clave para la respiración mitocondrial, particularmente cuando el piruvato se desvía hacia la producción de ácido láctico o cuando los ácidos grasos son insuficientes. Nuestro estudio reciente mostró que la exposición crónica a EtOH aumenta la dependencia de la AM a la glutamina y disminuye la flexibilidad de la AM para usar la glutamina y otras fuentes de combustiblepara la respiración mitocondrial. Estos resultados, junto con los datos que demuestran que el tratamiento de las células MH-S expuestas a EtOH con el inhibidor de la oxidación de piruvato UK5099 no alteró la bioenergética mitocondrial en comparación con las células MH-S expuestas al control de medios tratadas con UK5099, sugirieron un cambio de la respiración dependiente de piruvato hacia la respiración dependiente de glutamina en las células EtOH MH-S. Sin embargo, este cambio es insuficiente para satisfacer las demandas bioenergéticas de MA11. En este trabajo, describimos los métodos para evaluar la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial en AM crónicas expuestas a EtOH utilizando un bioanalizador de flujo extracelular. Este protocolo fue creado y optimizado para un formato de 96 pocillos (11,04 mm2 de área) y debe ajustarse para tamaños de pocillos de cultivo celular más grandes. La dependencia de glutamina para la bioenergética mitocondrial se determina utilizando el sulfuro de etilo de bis-2-(5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES, inhibidor de la glutaminasa 1) para inhibir selectivamente la conversión enzimática de glutamina en glutamato. Los datos presentados en este estudio son réplicas biológicas adicionales para los grupos experimentales tratados con control de medios y BPTES de células AM de ratón no tratadas y crónicas expuestas a EtOH, células MH-S, que se publican en Crotty et al.11.

Protocolo

1. Exposición crónica a EtOH in vitro

  1. Cultivo de células MH-S, una línea celular de macrófagos alveolares de ratón, en medios completos que contienen RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina, 11,9 mM de bicarbonato de sodio, 40 mg/mL de gentamicina y 50 μM de 2-mercaptoetanol a 37 °C con 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
  2. Tratar las células MH-S cultivadas con o sin EtOH (0,8 mg/ml o 0,08%) durante 72 h, donde el EtOH debe cambiarse cada 24 h. Incubar las células MH-S tratadas con EtOH a 37 °C con 5% de CO2 en una incubadora humidificada separada que contenga 0,08% de EtOH en el agua de la incubadora.

2. Recubrimiento de células MH-S para evaluar la glutamina como fuente de combustible utilizando un bioanalizador de flujo extracelular

  1. Asegúrese de que las células MH-S tratadas con (Con)- control y EtOH crónicas no tratadas se cultiven hasta alcanzar al menos un 50% de confluencia (70%-90% de confluencia ideal) en matraces T-75 para pasar a una placa de microcultivo de flujo extracelular de 96 pocillos. Prepare un mapa de placas para 5-6 réplicas técnicas por réplica biológica de las condiciones experimentales de Con y EtOH y controles de medios para cada una para compararlas con las inyecciones de BPTES (cuatro grupos en total para biológicos n = 1).
  2. Enjuague las células con medios o solución salina tamponada con fosfato.
  3. Añada 6 mL de medio que contenga suero al matraz.
  4. Raspe las celdas hasta que se desprendan y la parte inferior de la placa esté limpia. La tripsina no es necesaria para el desprendimiento de células MH-S, pero puede ser útil en otros tipos de células.
  5. Separe las células con una pipeta serológica o una pipeta de 1 mL.
  6. Transfiera las células suspendidas a un tubo cónico de 15 mL y centrifuérrelas a 200 x g durante 6 min.
  7. Aspirar el sobrenadante.
  8. Agregue 1 ml de medio y vuelva a suspender las células completamente.
  9. Transfiera 10 μL a un tubo de microcentrífuga y agregue 10 μL de azul de tripano. Mezclar bien.
  10. Transfiera 10 μL de la mezcla de celda y azul de tripano a un lado de un hemocitómetro o contador de células.
  11. Cuente el número de células con un microscopio óptico o un contador de células.
  12. Calcule la densidad de células como un recuento promedio de células vivas por mililitro.
  13. Realice cálculos para las diluciones que se necesitan:
    Número de pocillos necesarios x 10000-15000 celdas = número total de celdas necesarias.
    Número de pocillos necesarios x 80 μL = volumen total de células resuspendidas necesarias.
  14. Aplique 80 μL de células a los pocillos necesarios de la placa de microcultivo de flujo extracelular de 96 pocillos.
  15. Deje los pozos de las esquinas completamente desprovistos de celdas o medios. Estos pozos se utilizarán para las mediciones de fondo.
  16. Incubar las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante la noche para permitir que las células se adhieran y se equilibren en la placa de microcultivo de flujo extracelular.
  17. Trate las células MH-S en la placa de microcultivo de flujo extracelular de 96 pocillos durante 72 h mediante el paso 1.
  18. Al menos 4 h y hasta 24 h antes de ejecutar el experimento del bioanalizador de flujo extracelular, hidrate un cartucho de 96 pocillos de flujo extracelular.
    1. Retire la parte superior del paquete de flujo extracelular y coloque la parte sondeada del paquete de flujo boca arriba en el banco. Aplique 200 μL de solución calibradora de flujo extracelular a cada pocillo en la parte inferior del cartucho de paquete de flujo extracelular.
    2. Junte las secciones y envuelva el cartucho de fundente extracelular en parafilm. Colóquelo en una incubadora humidificada sin CO2 a 37 °C o en un baño de perlas a 37 °C.
  19. Encienda la computadora que contiene el diseño del ensayo y abra el software de ejecución/análisis conectado al instrumento bioanalizador de flujo extracelular para permitir que se caliente al menos 4 horas antes de realizar el experimento.

3. Uso de un bioanalizador de flujo extracelular para evaluar la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial en células MH-S

NOTA: La descripción general de este procedimiento se muestra en la Figura 1.

  1. Revise las células MH-S cultivadas tratadas con Con Con y EtOH bajo un microscopio óptico y asegúrese de que las células estén sanas y adheridas a los pocillos en una monocapa. Asegúrese de que las células tengan al menos un 70 % de confluencia (lo ideal es una confluencia del 90 %) para realizar el ensayo de forma fiable.
  2. Prepare el medio base de flujo extracelular con los siguientes suplementos:
    1. Alícuota de 35 mL de medio base de flujo extracelular en un tubo de 50 mL.
    2. Agregue 350 μL de piruvato de sodio de 100 mM (concentración final de 1 mM), 350 μL de D-glucosa (concentración final de 10 mM) y 350 μL de GlutaMAX, que es más estable en comparación con la L-glutamina (concentración final de 2 mM).
      NOTA: La L-glutamina fresca también se puede usar en la misma concentración.
    3. Caliente la solución a 37 °C y asegúrese de que el pH sea de 7,4 ± 0,05 a 37 °C.
  3. Aspire suavemente el medio de crecimiento de la placa de microcultivo extracelular. Deje la menor cantidad de medio posible sin aspirar las células desde la parte inferior. Lavar una vez con un máximo de 50 μL del medio base suplementado con flujo extracelular.
  4. Agregue 180 μL de medio base suplementado con flujo extracelular a cada pocillo e incube la placa de microcultivo extracelular en una incubadora humidificada sin CO2 a 37 °C durante 30 min a 1 h para permitir el equilibrio.
  5. Disuelva los reactivos de prueba de oxidación de glutamina:
    1. En el tubo BPTES, agregue 700 μL de medio base suplementado con flujo extracelular para hacer una solución madre de 120 mM. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10 veces para solubilizar correctamente el compuesto.
      PRECAUCIÓN: Los BPTES causan irritación de la piel y los ojos y pueden causar irritación respiratoria. Use guantes protectores, protección para los ojos y protección facial al manipular. Deseche el contenido y los contenedores en una instalación de eliminación de residuos aprobada.
    2. En el tubo de oligomicina, agregue 630 μL de medio base suplementado con flujo extracelular para hacer una solución madre de 100 mM. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10 veces para solubilizar correctamente el compuesto.
    3. En el tubo de FCCP, agregue 720 μL de medio base suplementado con flujo extracelular para hacer una solución madre de 100 mM. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10 veces para solubilizar correctamente el compuesto.
      PRECAUCIÓN: El FCCP es dañino si se ingiere, causa quemaduras graves en la piel y daño ocular, puede causar una reacción alérgica en la piel y puede causar efectos nocivos duraderos para la vida acuática. Use guantes protectores, ropa protectora, protección para los ojos y protección facial al manipular. Deseche el contenido y los contenedores en una instalación de eliminación de residuos aprobada.
    4. En el tubo R/A, agregue 540 μL de medio base suplementado con flujo extracelular para hacer una solución madre de 50 mM. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10 veces para solubilizar correctamente el compuesto.
      PRECAUCIÓN: La rotenona es mortal si se ingiere o se inhala, causa irritación de la piel, causa irritación grave de los ojos, puede causar irritación respiratoria y es muy tóxica para la vida acuática con efectos duraderos. Use guantes protectores, protección para los ojos, protección facial y protección respiratoria. Deseche el contenido y los contenedores en una instalación de eliminación de residuos aprobada. La antimicina A es mortal si se ingiere y es muy tóxica para la vida acuática, con efectos duraderos. Deseche el contenido y los contenedores en una instalación de eliminación de residuos aprobada.
  6. Prepare las concentraciones de trabajo de los reactivos de prueba de oxidación del sustrato y estrés mitocondrial:
    1. En el caso de los BPTES, mezcle 1.500 μL de medio base suplementado con flujo extracelular con 500 μL de solución madre de BPTES de 120 mM para hacer una solución de trabajo de 30 μM de BPTES.
    2. Para la oligomicina, mezcle 2.520 μL de medio base suplementado con flujo extracelular con 480 μL de oligomicina 100 mM para hacer una solución de trabajo de oligomicina de 16 mM.
    3. Para FCCP, mezcle 2.865 μL de medio base suplementado con flujo extracelular con 135 μL de 100 mM de FCCP para hacer una solución de trabajo de FCCP de 4,5 mM.
    4. Para R/A, mezcle 2.700 μL de medio base suplementado con flujo extracelular con 300 μL de 50 mM R/A para hacer una solución de trabajo de 5 mM R/A.
  7. Cargue los puertos de la parte superior del cartucho de paquete de flujo extracelular con lo siguiente:
    1. Cargue los pocillos de control de fondo y medios con 20 μL de medio base suplementado con flujo extracelular en el puerto A, 22 μL de oligomicina en el puerto B, 25 μL de FCCP en el puerto C y 27 μL de R/A en el puerto D.
    2. Cargue los pocillos que contienen celdas con 20 μL de control de medios o BPTES en el puerto A (concentración final de 3 μM para BPTES), 22 μL de oligomicina en el puerto B (concentración final de 2 μM para oligomicina), 25 μL de FCCP en el puerto C (concentración final de 0,5 μM para FCCP) y 27 μL de R/A (concentración final de 0,5 μM para R/A) en el puerto D.
  8. Realice el experimento del bioanalizador de flujo extracelular utilizando el programa de software informático para el diseño y análisis de ensayos que se adjunta al instrumento utilizando la siguiente estrategia de sincronización e inyección:
    1. Para la inyección con el puerto A para BPTES, establezca el número de mediciones en 6. Ajuste el tiempo de mezcla a 3 minutos, con un tiempo de espera de 0 minutos y un tiempo de medición de 3 minutos.
    2. Para la inyección con el puerto B para oligomicina, ajuste el número de mediciones a 3. Ajuste el tiempo de mezcla a 3 minutos, con un tiempo de espera de 0 minutos y un tiempo de medición de 3 minutos.
    3. Para la inyección con el puerto C para FCCP, establezca el número de mediciones en 3. Ajuste el tiempo de mezcla a 3 minutos, con un tiempo de espera de 6 minutos y un tiempo de medición de 3 minutos.
    4. Para la inyección con el puerto D para R/A, establezca el número de mediciones en 3. Ajuste el tiempo de mezcla a 3 minutos, con un tiempo de espera de 0 minutos y un tiempo de medición de 3 minutos.
    5. Revise todos los pozos de fondo, control de medios y grupo experimental. Guarde y ejecute el ensayo. Primero, cargue el paquete de flujo extracelular con inyecciones A-D. La calibración se realizará hasta que la placa de la celda esté lista para cargarse.
    6. Retire la placa celular inmediatamente al final del ensayo. Guarde los resultados para analizarlos más tarde en otro dispositivo.
    7. Compruebe si las células todavía se adhieren utilizando un microscopio óptico. Lavar 1 vez con solución salina tamponada con fosfato y lisar las células con un tampón de lisis celular preferido. Almacene a -80 °C o analice inmediatamente la concentración de proteínas.

4. Análisis de resultados para evaluar la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial en células MH-S

  1. Extraiga la proteína de las células de cada pocillo para normalizar los datos de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) a proteína:
    1. Calcule la concentración (nanogramos/microlitro [ng/μL]) de proteína por pocillo.
    2. Calcular la concentración media de proteína (ng/μL) para toda la placa de microcultivo de flujo extracelular.
    3. Divida la concentración de proteína de cada pocillo por la concentración de proteína promedio del plato para obtener un factor de normalización.
    4. Aplique el factor de normalización al archivo de datos de interés utilizando el programa de software informático para el diseño y análisis de ensayos.
  2. Asegúrese de que los valores de OCR de todos los pozos de fondo estén cerca de 0.
  3. Anule la selección de los pozos de celda en los que el OCR sea < 10 en la línea de base. Los datos no se eliminarán, pero los pozos resaltados aparecerán en el archivo de datos exportado.
  4. Exporte los datos del programa informático para el diseño y análisis de ensayos a un programa informático de hoja de cálculo.
  5. Abra el archivo en el programa de hoja de cálculo de la computadora y ordene todos los datos disminuyendo los valores de OCR. Elimine los pocillos de fondo, los pocillos que se deseleccionaron previamente (y no se habían eliminado), los pocillos con baja viabilidad celular, los pocillos con baja confluencia celular, los pocillos sin finalización completa de la estrategia de inyección, los pocillos con lecturas inexactas de concentración de proteínas, pocillos con OCR de referencia < 10 y cualquier otro criterio predeterminado.
  6. Ordene todos los datos restantes por medición, luego por grupo y luego por OCR.
  7. El promedio técnico de cada N biológico se replica de forma independiente por medición. Asegúrese de que haya un mínimo de 18 valores diferentes (3 basales, 3 después de la media/BPTES, 3 después de la oligomicina, 3 después de la FCCP y 6 después de la rotenona/antimicina A) por grupo experimental por N biológico después de promediar las réplicas técnicas. Haga esto para cada N biológico por separado, de modo que la desviación estándar o el error estándar de la media se pueda calcular más tarde para los datos analizados.
  8. Copie todos los valores promediados en una nueva hoja de cálculo, separados por grupo experimental.
  9. Promediar los valores de OCR por estrategia de inyección en cada grupo experimental.
  10. Calcular los parámetros de la bioenergética mitocondrial en función del consumo de oxígeno:
    1. Calcular la respiración basal:
      1. Calcule la respiración mitocondrial basal de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial basal (pmol O2 consumido) = ([Mediciones de OCR AVG #1, 2, 3 - Mediciones de OCR AVG #16, 17, 18] x [Tiempo #3 - Tiempo #1])
        NOTA: La respiración basal debe ser similar entre los grupos de control de medios y BPTES porque esto es antes de que se inyecte el inhibidor.
      2. Calcule la respiración mitocondrial basal no dependiente de la glutamina de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial basal no dependiente de la glutamina (pmol O2 consumido) = ([Mediciones de AVG OCR #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Mediciones AVG OCR #16, 17, 18] x [Tiempo #9 - Tiempo #4])
        NOTA: La respiración mitocondrial basal que no depende de la glutamina debe ser menor que la respiración mitocondrial basal, a menos que las células no dependan en gran medida de la glutamina.
      3. Calcule la respiración mitocondrial basal dependiente de la glutamina de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial basal dependiente de la glutamina (pmol O2 consumido) = ([Mediciones de OCR AVG #1, 2, 3 - Mediciones de OCR AVG #4, 5, 6, 7, 8, 9] x [Tiempo #9 - Tiempo #4])
        NOTA: La respiración mitocondrial basal total no debe restarse de la respiración mitocondrial basal, y no debe depender de la glutamina, ya que estas se calculan en diferentes puntos temporales.
    2. Calcule la respiración ligada al ATP de la siguiente manera:
      1. Calcule la respiración mitocondrial total ligada al ATP de todos los combustibles de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial total ligada al ATP de todos los combustibles (pmolO2 consumido) = ([Mediciones de OCR AVG #1, 2, 3 - Mediciones de OCR AVG #10, 11, 12] x [Tiempo #12 - Tiempo #10])
        NOTA: El OCR promedio para las mediciones # 10, 11 y 12 debe ser similar entre los grupos de control de medios y BPTES, ya que la oligomicina debería inhibir fuertemente la ATP sintasa, y la inhibición de una vía de combustible no debería cambiar la respiración total vinculada al ATP.
      2. Calcule la respiración mitocondrial ligada al ATP que no depende de la glutamina de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial ligada al ATP que no depende de la glutamina (pmolO2 consumido) = ([Mediciones de OCR AVG #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Mediciones de OCR AVG #10, 11, 12] x [Tiempo #12 - Tiempo #10])
        NOTA: La respiración mitocondrial ligada al ATP que no depende de la glutamina debe ser menor que la respiración mitocondrial ligada al ATP, a menos que las células no dependan en gran medida de la glutamina.
      3. Calcule la respiración mitocondrial ligada al ATP dependiente de la glutamina de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial ligada al ATP dependiente de la glutamina (pmolO2 consumido) = Respiración mitocondrial total ligada al ATP de todos los combustibles - Respiración mitocondrial ligada al ATP no dependiente de la glutamina
    3. Calcule la respiración máxima de la siguiente manera:
      1. Calcule la respiración mitocondrial máxima total de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial máxima total (pmol O2 consumido) = ([Mediciones de AVG OCR #13, 14, 15 - Mediciones AVG OCR #16, 17, 18] x [Tiempo #15 - Tiempo #13])
      2. Calcule la respiración mitocondrial máxima que no depende de la glutamina de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial máxima no dependiente de la glutamina (pmolO2 consumido) = ([Mediciones de OCR AVG #13, 14, 15 de los grupos BPTES - Mediciones de OCR AVG #16, 17, 18 de los grupos BPTES] x [Tiempo #15 - #Time 13])
      3. Calcule la respiración mitocondrial máxima dependiente de la glutamina de la siguiente manera:
        Respiración mitocondrial máxima dependiente de la glutamina (pmolO2 consumido) = Respiración mitocondrial máxima total de todos los combustibles - Respiración mitocondrial máxima no dependiente de la glutamina
        NOTA: Este cálculo se puede utilizar para determinar la dependencia de la celda para la capacidad de reserva de glutamina en comparación con otros combustibles. Cuanto mayor es la respiración mitocondrial máxima, mayor es la dependencia de la glutamina, que puede expresarse como grupos BPTES: grupos de control para mostrar una pérdida en la respiración mitocondrial máxima o como porcentaje de la respiración total.
    4. Calcule la capacidad respiratoria ociosa de la siguiente manera:
      1. Calcule la capacidad respiratoria total excedentaria de la siguiente manera:
        Capacidad respiratoria redisponible total (pmol O2 consumido) = ([Mediciones de OCR AVG #13, 14, 15 - Mediciones de OCR AVG #1, 2, 3] x [Tiempo #15 - Tiempo #13])
      2. Calcule la capacidad respiratoria ociosa no dependiente de la glutamina de la siguiente manera:
        Capacidad respiratoria ociosa no dependiente de la glutamina (pmol O2 consumido) = ([Mediciones de OCR AVG #13, 14, 15 de los grupos BPTES - Mediciones de OCR AVG #1, 2, 3 de los grupos BPTES] x [Tiempo #15 - Tiempo #13])
      3. Calcule la capacidad respiratoria ociosa dependiente de la glutamina de la siguiente manera:
        Capacidad respiratoria excedentaria dependiente de la glutamina (pmolO2 consumido) = Capacidad respiratoria excedentaria total procedente de todos los combustibles - Capacidad respiratoria excedentaria no dependiente de la glutamina
        NOTA: Este cálculo representa la flexibilidad de las células dependientes de la glutamina y si pueden lograr una mayor respiración sin glutamina cuando sea necesario.
  11. Reste los controles de medios por grupos de inhibidores y normalice el pmol O2 consumido en relación con el grupo de control si lo desea.
  12. Cree gráficos de los perfiles bioenergéticos de OCR (pmol O2/min), la respiración basal (pmol O2), la respiración ligada al ATP (pmol O2), la respiración máxima (pmol O2) y la capacidad respiratoria ociosa (pmol O2) dependiente de la glutamina.
  13. Representar los valores de los puntos finales bioenergéticos mitocondriales en gráficos de barras o expresarlos como medias de los grupos inhibidores en relación con los grupos de control de medios. Si cada N biológico se calcula por separado, entonces calcule la desviación estándar o el error estándar de la media para los datos analizados en todos los N biológicos.

5. Análisis estadístico

  1. Realizar todos los análisis estadísticos utilizando un software de análisis de datos adecuado.
  2. Para puntos lineales de los perfiles bioenergéticos de OCR, realice un ANOVA de dos vías seguido de los análisis post hoc de Tukey para comparar los datos de estos cuatro grupos experimentales con dos factores (tratamiento y estrategia de inyección): Con + medios, Con + BPTES, EtOH + medios y EtOH + BPTES.
  3. Para gráficos de barras de respiración basal, respiración ligada a ATP, respiración máxima y capacidad respiratoria adicional dependiente de la glutamina, realice análisis de prueba t de Student para comparar datos de dos grupos experimentales, Con + BPTES y EtOH + BPTES.
  4. Presentar los datos como medio ± error estándar de la media (SEM). Considere que p < 0,05 es estadísticamente significativo.

Resultados

La exposición crónica al EtOH disminuye la dependencia de la glutamina en las células MH-S.
La glutaminólisis es una vía crítica para la respiración mitocondrial, ya que apoya a la glutamina como una importante fuente de combustible para la bioenergética celular. Para determinar si la exposición crónica a EtOH altera la dependencia de las células MH-S de la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial, las células MH-S se trataron sin control de EtOH (Con) o EtOH, y se midió el OCR a lo largo del tiempo en respuesta a inyecciones seriadas de reactivos asociados con la respiración mitocondrial. Los perfiles bioenergéticos de OCR en respuesta a inyecciones seriadas de oligomicina (inhibidor de la ATP sintasa), FCCP (desacoplador de protones) y R/A (inhibidores del complejo mitocondrial I y del complejo III, respectivamente) se utilizan para calcular otros parámetros de la bioenergética mitocondrial, como la respiración ligada al ATP, la respiración máxima y la capacidad respiratoria de reserva. Todos los datos mostrados son réplicas biológicas adicionales de los grupos experimentales de células Con + media, Con + BPTES y EtOH + media, EtOH + BPTES MH-S que se publicaron en Crotty et al.11. Como se muestra en la Figura 2A, la oligomicina disminuyó el OCR debido a la inhibición del complejo V, el FCCP aumentó el OCR debido al desacoplamiento mitocondrial del potencial de membrana y la generación12 de ATP dependiente de las mitocondrias, y R/A desactivó eficazmente el OCR dependiente de las mitocondrias. Estos perfiles de las respuestas bioenergéticas de OCR a las inyecciones seriadas son consistentes con la guía del usuario para evaluar el estrés mitocondrial utilizando un bioanalizador de flujo extracelular13,14.

Después de medir el OCR basal en células MH-S tratadas con Con y EtOH, se cargó una inyección de control de medios o BPTES, un inhibidor de la glutaminasa 1. Las células MH-S de Con + medios frente a las células MH-S de Con + BPTES y las células MH-S de EtOH + BPTES no mostraron diferencias en los perfiles bioenergéticos de OCR (Figura 2A). Las células MH-S de EtOH + BPTES mostraron una disminución en la respiración basal dependiente de glutamina en comparación con Con + BPTES (medición #4 comparada con la medición #3 en la Figura 2A y la Figura 2B), lo que sugiere que EtOH disminuye la oxidación basal de glutamina de las células MH-S contribuyendo a la respiración mitocondrial. Las células MH-S de EtOH + BPTES mostraron una pérdida de respiración mitocondrial ligada a ATP dependiente de glutamina en comparación con Con + BPTES (Figura 2C). Aunque las células MH-S de EtOH + BPTES mostraron una pérdida atenuada en la respiración máxima dependiente de la glutamina en comparación con las células Con + BPTES (Figura 2D), las células EtOH + BPTES MH-S mostraron una disminución de la capacidad respiratoria de repuesto dependiente de la glutamina en comparación con las células Con + BPTES (Figura 2E). Estos resultados sugieren que las células EtOH MH-S tienen la capacidad de ser más dependientes de la glutamina para la respiración, como cuando están estresadas con FCCP, pero que pueden ser incapaces de hacerlo debido a un aumento en la demanda de glutamina que se ve compensado por una disminución en la biodisponibilidad de glutamina.

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Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo para medir la respiración mitocondrial dependiente de glutamina y la bioenergética en células MH-S, una línea celular de macrófagos alveolares de ratón. Las monocapas de células MH-S cultivadas en pocillos de placa de microcultivo de flujo extracelular (paso 3.1) se incubaron con medio base de flujo extracelular con suplementos añadidos (paso 3.2) a 37 °C en una incubadora humidificada sin CO2 durante 30 min-1 h (paso 3.4). El medio base de flujo extracelular con suplementos añadidos (paso 3.2) se utilizó como medio de control y para diluir las concentraciones de trabajo del inhibidor de la oxidación de la glutamina BPTES a una concentración final de 3 μM, el inhibidor del complejo mitocondrial V oligomicina (Oligo) a una concentración final de 0,5 μM, el desacoplador mitocondrial cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) a una concentración final de 0,5 μM, y los inhibidores del complejo mitocondrial I y del complejo III rotenona/antimicina A (R/A) a 0,5 μM concentración final para los puertos de carga A-D en el cartucho de fundente extracelular superior (paso 3.7). La estrategia de inyección para los tiempos de mezcla, espera y medición para la ejecución experimental utilizando el bioanalizador de flujo extracelular fue: 3 min de tiempo de mezcla, 0 min de tiempo de espera y 6 mediciones de 3 min de tiempo de medida para el puerto A (control de medios o BPTES); 3 minutos de tiempo de mezcla, 0 minutos de tiempo de espera y 3 mediciones de 3 minutos de tiempo de medición para el puerto B (Oligo); Tiempo de mezcla de 3 minutos, tiempo de espera de 6 minutos y 3 mediciones de tiempo de medición de 3 minutos para el puerto C (FCCP); y 3 minutos de tiempo de mezcla, 0 minutos de tiempo de espera y 3 mediciones de 3 minutos de tiempo de medición para el puerto D (R/A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: El etanol crónico (EtOH) disminuye la respiración mitocondrial dependiente de glutamina en las células MH-S, una línea celular de macrófagos alveolares de ratón. Las células MH-S no fueron tratadas (Con) o tratadas con EtOH (0,08%, 72 h), y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) a lo largo del tiempo se midió utilizando un bioanalizador de flujo extracelular antes y después de la inyección con control de medios o un inhibidor de la oxidación de glutamina (GLN) (3 μM de BPTES), seguido de inyecciones seriadas de inhibidor del complejo V mitocondrial (0,5 μM de oligomicina, Oligo), desacoplador mitocondrial (0,5 μM de cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona, FCCP) e inhibidores del complejo mitocondrial I y del complejo III (0,5 μM de rotenona/0,5 μM de antimicina A, R/A). (A) Se utilizaron perfiles bioenergéticos OCR para calcular la respiración basal dependiente de glutamina (B), (C) la respiración ligada al ATP, (D) la respiración máxima y (E) la capacidad respiratoria ociosa. Los puntos lineales representan medias ± SEM (n = 4, #p < 0,05 frente a Con + medio y *p < 0,05 frente a Con + BPTES, ANOVA de un factor con post hoc de Tukey). Las barras representan medias ± SEM (n = 4, *p < 0,05 frente a Con + BPTES, prueba t de Student). Los datos presentados son réplicas biológicas adicionales para los grupos experimentales tratados con medios de control y BPTES de células MH-S no tratadas con control y crónicas expuestas a EtOH, que se publican en Crotty et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los datos presentados en este documento son réplicas biológicas adicionales para células MH-S no tratadas y crónicas expuestas a EtOH tratadas con control de medios o BPTES, que se publican en Crotty et al.11. El protocolo descrito se utiliza para evaluar la dependencia de las células MH-S expuestas a EtOH de la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial y la bioenergética utilizando un bioanalizador de flujo extracelular. Hay varios pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, la formación y confluencia de células MH-S son importantes. Las células MH-S se cultivan inicialmente en pocillos de microcultivo de flujo extracelular a baja confluencia y se utilizan cuando las células están en una monocapa con una confluencia final del 90%. Dado que la exposición al EtOH de las células MH-S fue durante 72 h, la confluencia final del 90% se logró antes de la ejecución experimental en el bioanalizador de flujo extracelular. Esto es consistente con otros reportes de formación de monocapas celulares y confluencia del 90%-100% antes de realizar estos experimentos 15,16,17. En segundo lugar, es fundamental la normalización de los valores de respiración mitocondrial a proteínas en cada muestra. Algunos estudios normalizan la bioenergética mitocondrial al número de células 18,19,20. Sin embargo, la estrategia de inyección en serie en este ensayo está destinada a estresar secuencialmente las mitocondrias. En las células que dependen principalmente de la fosforilación oxidativa, como las AM, esto puede provocar la muerte celular durante la ejecución experimental en el bioanalizador de flujo extracelular. Por lo tanto, el número de células puede no ser consistente desde el comienzo del experimento hasta el final de la ejecución experimental, y la normalización de los valores de respiración mitocondrial a proteína es óptima21,22. Aquí se sugiere un factor de normalización de proteínas que utilice el promedio de proteínas en todos los pocillos para informar perfiles de OCR específicos de células más precisos. En tercer lugar, el análisis de los resultados a través de las réplicas biológicas es clave. A veces, se presentan imágenes representativas de los perfiles bioenergéticos mitocondriales22,23 en lugar de la respiración mitocondrial promedio a través de múltiples réplicas biológicas 10,11,24. Sin embargo, estas imágenes representativas no proporcionan una imagen completa de las variaciones entre los experimentos. Al calcular cada réplica biológica por separado, el error estándar de la media puede mostrar la variación de los valores medios de respiración mitocondrial en todas las réplicas biológicas y utilizarse para calcular las diferencias estadísticas entre los perfiles bioenergéticos mitocondriales.

Antes de ejecutar el ensayo en el bioanalizador de flujo extracelular, era necesario determinar la densidad celular óptima de las células MH-S para el cultivo en la placa de microcultivo de flujo extracelular para lograr una monocapa de células en cada pocillo. Dado que también era necesario establecer las concentraciones apropiadas de Oligo y FCCP para las células MH-S, se realizaron pruebas de diferentes densidades de células MH-S con diluciones seriadas de Oligo y FCCP21,25. El cultivo inicial de 10.000-15.000 células MH-S dio como resultado una monocapa de células con una confluencia del 90% después de 72 h de exposición con y sin EtOH10. Con base en estos experimentos de optimización, se determinó que 2 μM de Oligo y 0,5 μM de FCCP son las concentraciones mínimas de estos reactivos que causaron alteraciones en la respiración mitocondrial10.

Las mediciones en tiempo real de la respiración mitocondrial al inicio y después del tratamiento con BPTES, un inhibidor de la glutaminasa 1, que evita la conversión enzimática de glutamina en glutamato, se utilizan para determinar la dependencia de la glutamina para la respiración basal en células MH-S expuestas a Con y EtOH. Una limitación de los datos presentados en este estudio es que no se han investigado las funciones de los ácidos grasos de cadena corta y media como fuentes de combustible para la respiración mitocondrial y la bioenergética, además de la glutamina en las células MH-S expuestas a EtOH. Los resultados del estudio previo de Crotty et al.11 sugirieron que las células EtOH MH-S mostraron un cambio de la respiración dependiente de piruvato hacia la respiración dependiente de glutamina sin una compensación completa por la pérdida de la respiración mitocondrial total. Además, al realizar el mismo experimento con una inyección combinada de UK5099 (un inhibidor de la oxidación del piruvato) y etomoxir (un inhibidor de la oxidación de ácidos grasos de cadena larga), se pudo determinar la contribución de la glutamina en ausencia de piruvato y ácidos grasos como fuentes de combustible para la respiración mitocondrial en las células MH-S expuestas a EtOH.

La respiración mitocondrial se ha medido utilizando un electrodo de Clark durante casi setenta años26, y también existen ensayos de fluorescencia basados en placas para medir la respiración mitocondrial27. Sin embargo, estos métodos requieren mucho más tiempo y/o carecen de la sensibilidad de las mediciones que se pueden lograr con un bioanalizador de flujo extracelular. La ventaja de utilizar un bioanalizador de flujo extracelular para evaluar la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial y la bioenergética es que se pueden realizar experimentos con múltiples réplicas biológicas al mismo tiempo. Además, el bioanalizador de flujo extracelular permite la flexibilidad de experimentar con mitocondrias aisladas o células intactas. Para las células que no tienen una alta concentración de mitocondrias, como las células del músculo liso de la arteria pulmonar, es difícil aislar suficientes mitocondrias de muestras limitadas. Utilizando el bioanalizador de flujo extracelular, se puede medir la respiración mitocondrial en células intactas del músculo liso de la arteria pulmonar28 o AM primarias de ratón10,11. El protocolo utilizado en este estudio podría utilizarse para evaluar la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial y la bioenergética de otras muestras de tamaño limitado, como los AM humanos primarios. Hemos demostrado previamente que el estrés oxidativo derivado de la mitocondria inducido por EtOH y los trastornos en las células MH-S exhiben un perfil similar de desregulación mitocondrial en AM primarios de ratón y AM humanos 6,7,11,28,29,30. En conjunto, los estudios respaldan el uso de este método para evaluar la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial y la bioenergética en AM en condiciones patológicas que se caracterizan por el estrés oxidativo derivado de las mitocondrias.

Divulgaciones

No todos los autores tienen ningún conflicto de interés financiero relevante para informar.

Agradecimientos

Reconocemos las contribuciones de Sarah S. Chang, BS, para el cultivo celular inicial y la preparación de células MH-S para la experimentación. Este trabajo fue apoyado por NIAAA R01-AA026086 a SMY (ORCID: 0000-0001-9309-0233), NIAAA F31-F31AA029938 a KMC y NIGMS T32-GM008602 a Randy Hall, Departamento de Farmacología y Biología Química de la Universidad de Emory. El contenido de este informe no representa las opiniones del Departamento de Asuntos de Veteranos ni del Gobierno de los Estados Unidos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo cónico de 15 mL VWR International, Inc.21008-670Se utiliza para preparar concentraciones de reactivos relacionados con las mitocondrias.
2-mercaptoetanol Sigma Aldrich Co.M6250Se utiliza para el cultivo de células MH-S.
Raspador de célulasDot Scientific, Inc.70-1180Se utiliza para raspar células MH-S de matraces T-75.
Countess 3 FL Instrumento: contador de célulasFisher Scientific CompanyAMQAF2000Se utiliza para contar el número de células MH-S para placas para experimentos.
D-glucosa Sigma Aldrich Co.G8270Se utiliza para el medio base de flujo extracelular.
EthanolFisher Scientific Company4355720Tratamiento experimental para células MH-S.
Suero fetal bovinoSciencell Research Laboratories500Se utiliza para el cultivo de células MH-S.
GentamicinaSigma Aldrich Co.G1397Se utiliza para el cultivo de células MH-S.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Se utiliza para el medio base de flujo extracelular.
GraphPad Prism 10.2.3GraphPad SoftwareN/ASoftware para análisis estadístico. Descargable después de la compra en https://www.graphpad.com/features.
Células MH-SColección de cultivos tipo americanoCRL-2019Línea celular de macrófagos alveolares de ratón.
Tubo de microcentrífuga USA Scientific, Inc.4036-3212Se utiliza para preparar concentraciones de trabajo de reactivos relacionados con las mitocondrias.
Microsoft 365 Excel: programa informático de hojas de cálculoMicrosoftN/ASoftware para la organización de datos y cálculos bioenergéticos mitocondriales. Se puede descargar después de la compra en https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicilina/estreptomicinaFisher Scientific Company15140122utiliza para el cultivo de células MH-S.
Solución salina tamponada con fosfatoVWR International, Inc.45000-446Se utiliza para lavar celdas MH-S.
RPMI-1640VWR International, Inc.45000-396Se utiliza para el cultivo de células MH-S.
Seahorse Wave Pro Software: programa de software informático para el diseño y análisis de ensayosAgilent Technologies, Inc.N/AEl ordenador está conectado al instrumento Seahorse XF Pro Analyzer. Descargable desde  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: medio base de flujo extracelular, pH 7.4Agilent Technologies, Inc.103334-100Se utiliza para la preparación de reservas y concentraciones de trabajo de reactivos relacionados con las mitocondrias y el cultivo de células MH-S antes de las pruebas experimentales.
Kit de prueba de estrés por oxidación de glutamina Seahorse XFAgilent Technologies, Inc.103674-100Contiene BPTES de stock, oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A.
Seahorse XF Pro Analyzer: bioanalizador de flujo extracelularAgilent Technologies, Inc.N/ABioanalizador de flujo extracelular.
Seahorse XFe96 FluxPak: cartuchos de fundente extracelular de 96 pocillos, placas de microcultivo de flujo extracelular de 96 pocillos y solución calibranteAgilent Technologies, Inc.102416-100Se utiliza para preparar células MH-S para ensayos utilizando un bioanalizador de flujo extracelular.
Pipeta serológica Santa Cruz Biotecnología, Inc.sc-550678Se utiliza para eliminar medios de las celdas MH-S.
Bicarbonato de sodioSigma Aldrich Co.S6014Se utiliza para el cultivo de células MH-S.
Piruvato de sodio Sigma Aldrich Co.P4562Se utiliza para el medio base de flujo extracelular.
Matraces T-75Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-200263Se utiliza para el cultivo de células MH-S.

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Metabolismo de la glutaminaexposición crónica al etanolrespiración mitocondrialglutaminólisistasa de consumo de oxígenorespiración ligada al ATPcélulas MHSinhibidor BPTES
Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular
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