Artículo de método

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

DOI:

10.3791/67584

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10 de junio de 2025

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1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La inmunofluorescencia múltiple (mIF) es una técnica avanzada que permite el análisis detallado y espacialmente resuelto de muestras de tejido mediante la visualización de múltiples biomarcadores de proteínas dentro de una sola sección. Sin embargo, la mayoría de las tecnologías mIF se enfrentan a importantes compensaciones entre la sensibilidad y el rendimiento al multiplexar, lo que plantea una limitación crítica para la detección robusta de biomarcadores de baja abundancia en múltiples secciones de tejido. Un nuevo enfoque para la mIF utiliza códigos de barras de ADN únicos vinculados a los anticuerpos, que se amplifican a través de un mecanismo de amplificación paralelo de una sola molécula. Este método logra una calidad de tinción muy comparable a la inmunohistoquímica (IHC) de grado clínico, al tiempo que proporciona altas capacidades de multiplexación e imágenes de portaobjetos completos de alto rendimiento. Este ensayo consiste en amplificar un cóctel de anticuerpos con código de barras de ADN en el tejido, seguido de rondas secuenciales de pasos de detección para visualizar cuatro oligonucleótidos marcados con fluorescencia por ciclo. Por lo tanto, este proceso permite la detección de ocho o más biomarcadores por muestra de tejido. Los pasos clave de este método incluyen la preparación automatizada de tejidos, la aplicación de anticuerpos primarios conjugados con códigos de barras de ADN, la amplificación de señales y los ciclos iterativos de detección, obtención de imágenes y eliminación de señales. A la adquisición de imágenes le sigue el registro de imágenes y el análisis de una sola celda mediante una plataforma de ciencia de datos de imágenes espaciales mejorada por IA. Para este estudio, el protocolo se aplicó a micromatrices (TMA) de múltiples tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE), incluidos núcleos de amígdalas, melanoma, colon y ganglios linfáticos por triplicado. Las tecnologías avanzadas de mIF proporcionan más información sobre la respuesta tumoral, el microambiente tumoral y el panorama inmunitario. Al superar las compensaciones inherentes entre la sensibilidad, las capacidades de multiplexación y el rendimiento de las imágenes, los investigadores ahora pueden tratar de comprender la heterogeneidad de las firmas moleculares desafiantes y los biomarcadores de las respuestas terapéuticas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La inmunofluorescencia altamente multiplexada (mIF) es una técnica avanzada que está revolucionando el campo del análisis de tejidos al permitir la visualización simultánea de múltiples biomarcadores de proteínas dentro de una sola sección de tejido 1,2. Esta capacidad proporciona un nivel de detalle y resolución espacial sin precedentes, que a menudo es crucial para comprender las interacciones entre tipos de células con morfologías complejas dentro del microambiente tisular a través de múltiples escalas espaciales3. La técnica es particularmente valiosa en la investigación oncológica, donde se puede utilizar para colocalizar biomarcadores tumorales, dianas proteicas de fármacos, el estado inmunitario local y de puntos de control, las interacciones entre diferentes tipos de células e incluso los patrones de colocalización subcelular relacionados con el metabolismo de fármacos dentro del tejido 4,5,6.

A pesar de su potencial, la mayoría de las tecnologías mIF aún enfrentan desafíos significativos, particularmente en el equilibrio de la sensibilidad y el rendimiento con las capacidades de multiplexación. Esta limitación es especialmente crítica para la detección de biomarcadores clínicos que pueden mostrar una expresión muy baja, como HER2 y PD-L1 7,8,9. Para ver por qué esto es así, es esencial entender otras modalidades de mIF. Estos métodos tradicionales han allanado el camino para plataformas mIF más sofisticadas, pero vienen con sus propios conjuntos de ventajas y limitaciones.

La inmunofluorescencia directa (DIF) utiliza anticuerpos directamente conjugados con fluoróforos, o con un oligonucleótido capaz de reclutar fluoróforos10. Este método es sencillo de multiplexar, pero sufre de una menor sensibilidad y dificultad para resolver la señal del fondo del tejido o los artefactos de tinción.

La inmunofluorescencia indirecta (FII) utiliza un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario. Esto ha aumentado la señal en comparación con el DIF primario. Cuando se combina con diseños mejorados de celdas de flujo, el IIF secuencial puede detectar hasta 40 biomarcadores en un ensayo 2,11. Sin embargo, estos todavía sufren de una relativa falta de sensibilidad en comparación con las estrategias basadas en enzimas para la amplificación de señales, como las que se encuentran en las técnicas de inmunohistoquímica (IHQ).

La inmunofluorescencia basada en catálisis enzimática se observa con mayor frecuencia en los métodos de IHQ que utilizan peroxidasa de rábano picante (HRP) para la deposición cromogénica (DAB) o de colorante fluorescente (p. ej., amplificación de señal de tiramida (TSA)). Dado que estos ensayos se basan en la misma enzima catalítica, su sensibilidad de detección es similar, lo que hace que los ensayos multiespectrales de mIF basados en TSA sean adecuados para aplicaciones clínicas 2,12. La ventaja de la amplificación de señales basada en ADN es el alto grado de multiplexación posible, al tiempo que se conserva una excelente amplificación y modularidad de la señal. Por el contrario, los métodos basados en HRP son menos modulares y difíciles de optimizar, lo que requiere ciclos adicionales de desarrollo y prueba de paneles.

Inmunofluorescencia de anticuerpos con código de barras de ADN
El ensayo mIF demostrado aquí utiliza una ADN polimerasa para amplificar simultáneamente anticuerpos con código de barras de ADN, seguido de ciclos de tinción y decoloración de la sonda reportera utilizando cuatro oligonucleótidos fluorescentes por ronda de imágenes (Figura 1).

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Figura 1: Ilustración gráfica del protocolo de ensayo de inmunofluorescencia multiplex. Los anticuerpos conjugados con código de barras se agregan en un solo paso y los códigos de barras se amplifican simultáneamente. En cada ciclo se añaden grupos de cuatro sondas fluorescentes, lo que permite visualizar cuatro marcadores a la vez. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esta adición de anticuerpos de una sola ronda y la amplificación de un solo paso simplifican enormemente el protocolo de ensayo. El proceso se ve facilitado por los sistemas automatizados de tinción y escaneo de alto rendimiento, que garantizan resultados reproducibles de portaobjetos y de lote a lote en un gran número de muestras utilizadas en estudios clínicos13.

Una de las principales ventajas de esta tecnología es su capacidad para mantener una alta sensibilidad al tiempo que permite una amplia multiplexación2. El flujo de trabajo también garantiza que el rendimiento de las imágenes siga siendo alto, abordando así una de las principales limitaciones de las tecnologías mIF altamente multiplexadas (por ejemplo, > 8 biomarcadores) para estudios clínicos. Esto es particularmente importante en la investigación clínica, donde las variaciones sutiles en los objetivos de los fármacos de baja abundancia (por ejemplo, HER2 bajo) entre los pacientes pueden proporcionar información crítica sobre la respuesta terapéutica.

Además de estos atributos clave, este ensayo también ofrece la capacidad de configuración del panel, las capacidades de obtención de imágenes de portaobjetos completos de alto rendimiento y la resolución óptica necesaria para investigar los procesos y compartimentos subcelulares, así como las protuberancias celulares asociadas con macrófagos y células dendríticas. La capacidad de investigar fenotipos celulares complejos a través de múltiples escalas espaciales es una ventaja crítica de las imágenes ópticas en comparación con los métodos basados en la citometría de masas (IMC)2.

En este trabajo, se presenta un protocolo para un ensayo de mIF de 8 plex utilizando un autostainer y un escáner de portaobjetos completos. Este ensayo incluye un panel de ocho anticuerpos primarios: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 y pan-citoqueratina14. Este panel de marcadores permitirá el inmunoperfil del tejido tumoral y la identificación de las células que se encuentran en el entorno del tumor o del estroma. Este protocolo utiliza un tintor de portaobjetos automatizado para la tinción inicial y las rondas de intercambio de sondas, y la tinción y la obtención de imágenes se pueden completar en 2 días. También se muestran los métodos para validar un ensayo de mIF y realizar análisis de las imágenes resultantes.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos deben seguir las directrices del comité institucional de ética de la investigación en seres humanos. Todas las secciones de tejido empleadas en este protocolo se obtuvieron de un proveedor externo de tejidos.

1. Preparación de muestras de tejido

  1. Seleccione el bloque de tejido FFPE que se va a teñir mediante el ensayo mIF. Si utiliza portaobjetos de tejido FFPE, asegúrese de que las muestras tengan un grosor de entre 3 y 5 μm, estén montadas sobre portaobjetos de vidrio cargados positivamente y estén libres de arrugas u otros desgarros que puedan afectar negativamente a los resultados finales.
    NOTA: Para obtener los mejores resultados, evite teñir muestras de tejido que hayan sido seccionadas más de 2 meses antes. Además, evite los bloques que hayan estado almacenados durante más de 10 años o que parezcan estar visualmente secos.
  2. Si trabaja con bloques de tejido FFPE, utilice un micrótomo para cortar el número requerido de portaobjetos de tejido con un grosor de 4 μm, montando los portaobjetos en un portaobjetos de vidrio cargado positivamente. Para lograr los resultados más consistentes, monte todas las diapositivas en la misma orientación. Asegúrese de que el tejido esté libre de arrugas y desgarros.
  3. Si las muestras no se van a teñir inmediatamente, guárdelas en una caja portaobjetos bajo nitrógeno hasta por 2 meses.

2. Registro de reactivos auxiliares y anticuerpos primarios para la configuración inicial

  1. Dentro del software de autostainer, vaya a la pestaña Configuración de reactivos en la parte superior de la pantalla. Haga clic en Agregar para agregar nuevos reactivos.
  2. Los ensayos de tinción e intercambio utilizarán nueve contenedores de reactivos, siguiendo la información que se encuentra en la Tabla 1. Para utilizarlos, por ejemplo, para el primer reactivo llamado Wash Buffer, con el nombre abreviado ISPWsh1, siga los pasos. Seleccione el tipo como Auxiliar y compruebe que tanto *BWash como DI aparezcan en Bulk Compatibles. Marque la casilla Preferido antes de guardar.
  3. Repita este proceso para los reactivos auxiliares restantes, utilizando los nombres y los nombres abreviados que se encuentran en la Tabla 1.
    1. El reactivo de solución de amplificación (ULTAmp1) no es compatible con Bond Wash. Para ello, seleccione *BWash y haga clic en el botón << para sacar este reactivo de la lista de reactivos compatibles y llevarlo a la sección de reactivos disponibles. Si no se elimina Bond Wash como reactivo compatible para el reactivo de solución de amplificación, es posible que se reduzca significativamente el rendimiento de tinción del ensayo.
  4. Una vez que todos los contenedores de reactivos estén registrados, cree un kit de detección de investigación antes de comenzar la ejecución inicial. El kit de detección necesitará un recipiente de valoración de 30 mL.
  5. Añada el recipiente de valoración de 30 ml al kit de detección. Para evitar que los dos se separen, pegue el recipiente de valoración a la varilla.
  6. Escanee el código de barras en el lado izquierdo del kit de detección. En la siguiente ventana emergente, asigne un nombre al kit de detección (por ejemplo, InSituPlex Kit). Establezca la fecha de vencimiento en 10 años a partir de la fecha de registro.
    NOTA: La fecha de caducidad establecida aquí no es la fecha que aparece en el reactivo, sino la fecha de caducidad del reactivo en el recipiente de valoración. Establecer la fecha de caducidad en un futuro lejano garantiza que el kit no caduque innecesariamente.
  7. Para la primera posición de reactivo del kit, seleccione Tampón de lavado como reactivo en el menú desplegable.
  8. Haga clic en el campo de código de barras para esta posición de reactivo y escanee el código de barras del recipiente de valoración de 30 ml con cinta adhesiva para registrar este recipiente como tampón de lavado y vincular el recipiente de reactivo a la varilla de detección.
  9. Una vez que el contenedor de valoración esté vinculado al kit, haga clic en el botón Agregar para guardar y cerrar la ventana emergente.
  10. Llene el recipiente de valoración con 30 ml de 1x Bond Wash y guárdelo refrigerado a 4 °C entre ciclos de tinción.

Tabla 1: Reactivos auxiliares para la configuración. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

3. Configuración inicial del protocolo

  1. Una vez registrado correctamente todos los contenedores de reactivos, vaya a la pestaña Configuración del protocolo en la parte superior de la pantalla del software del autostainer.
  2. Confirme qué versión de software se está ejecutando actualmente haciendo clic en el logotipo en la parte superior derecha de la pantalla. La ventana emergente resultante mostrará la versión del software instalada actualmente en el encabezado de información del software.
  3. Si el software es la versión 7.0 o posterior, habrá una plantilla preinstalada del protocolo de tinción. En la parte inferior de la pantalla, compruebe que la selección de Estado preferido esté establecida en Todos. Asigne al protocolo de plantilla el nombre *ISP Staining Assay. Para versiones anteriores de software, el protocolo se puede encontrar en la Tabla 2.
  4. Haga clic con el botón derecho en el ensayo de tinción *ISP y copie el protocolo. En la ventana emergente resultante, cambie el nombre del protocolo Ensayo de tinción 1 con el nombre abreviado (ISP_IHC1)
  5. En el sistema de detección preferido, seleccione el que se creó durante la configuración inicial del reactivo en el paso 2.6.

Tabla 2: Protocolo para el protocolo de tinción de inmunofluorescencia multiplex. *MARKER corresponde a la solución de anticuerpos, y Wash Buffer corresponde a la solución BOND Wash. Todos los demás reactivos auxiliares tienen componentes de kit con el nombre correspondiente. Este protocolo es compatible con la versión de software 7.0 y superior, BXD 39 y superior. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

4. Configuración de reactivos

  1. Descongele todos los reactivos del kit, excepto los conjugados de anticuerpos, la enzima de amplificación, el iniciador de intercambio y el neutralizador de intercambio a temperatura ambiente. Guarde el resto de los componentes del kit a -20 °C hasta su uso.
  2. Si aún no lo ha hecho, registre un nuevo contenedor de valoración para cada uno de los reactivos definidos en el paso 2.3. Coloque un nuevo inserto de valoración en cada uno.
  3. Tome el sistema de detección de investigación registrado en el paso 2.6 y asegúrese de que el recipiente tampón de lavado asociado esté lleno hasta 30 ml con 1x solución de lavado Bond. Coloque los recipientes de valoración para cada reactivo en el sistema.
  4. Prepara el Diluyente Ab en el recipiente correspondiente. El volumen requerido es 350 + (150 μL x número de portaobjetos) y está compuesto por el diluyente de anticuerpos proporcionado. Agite el tampón para mezclar después de descongelar.
  5. Prepare la solución de tinción de anticuerpos en el recipiente de 1 solución de tinción de anticuerpos. Agregue todos los anticuerpos en una dilución de 1:100 en el diluyente de anticuerpos provisto. El volumen requerido es de 350 + (150 μL x número de portaobjetos). No haga vórtices con las existencias de anticuerpos o con la solución de tinción de anticuerpos completa, mezcle solo con pipeteo.
  6. Prepare la mezcla de preamplificación en el recipiente de mezcla de preamplificación. El volumen requerido es de 350 + (150 μL x número de portaobjetos) y se compone de una mezcla de preamplificación como se proporciona. Agite esta solución después de la descongelación.
  7. Prepare la solución de amplificación en el contenedor de la solución de amplificación. El volumen requerido es de 350 + (150 μL x número de portaobjetos), y se compone de enzima de amplificación diluida 1:10 en tampón de amplificación. No haga vórtice la enzima de amplificación o la solución de amplificación completa, mezcle solo pipeteando.
  8. Prepare la contratinción nuclear en un recipiente de contratinción nuclear. El volumen requerido es de 350 + (300 μL x número de portaobjetos) y se compone de la solución de contratinción nuclear suministrada diluida 1:100 en agua ultrapura. Mezclar por vórtice.
  9. Prepare la mezcla de sondas fluorescentes correspondiente a la primera ronda de imágenes en el contenedor de la sonda fluorescente. El volumen requerido es de 350 + (450 μL x número de portaobjetos), que consiste en las sondas fluorescentes 1 solución diluida 1:20 dentro del tampón de la sonda. Agite los componentes después de la descongelación, así como la mezcla completa final.
  10. Una vez que todos los reactivos estén preparados y colocados en sus recipientes correspondientes, coloque la varilla de reactivo completa en el software para permitir que se mida el volumen de reactivo.

5. Ejecute la configuración

  1. Una vez que todos los reactivos estén preparados, vaya a la pestaña Configuración de portaobjetos en la parte superior del software y seleccione el botón Nuevo estudio . Agregue el ID de estudio, el nombre del estudio y los comentarios del estudio según lo desee. Consulte la Figura 2 como ejemplo.
  2. En Volumen de dispensación, seleccione 150 μL y *Desparafinar 4 pasos como protocolo de preparación. Si los pasos de *Dewax 4 no aparecen en el menú desplegable, localice este protocolo en el menú Configuración del protocolo y marque la casilla Preferido . Presione Aceptar.
  3. Una vez que se haya creado el estudio, seleccione el botón Agregar diapositiva en el lado derecho de la pantalla de configuración de diapositivas. En Comentarios de diapositiva, asigne un nombre único a la diapositiva.
  4. Para los campos adicionales de esta pantalla, establezca Tipo de tejido en Tejido de prueba y establezca el volumen de dispensación en 150 μL con el modo de tinción Único en el menú desplegable de la izquierda y Rutina en el menú desplegable de la derecha. En proceso, seleccione IHQ, siendo el marcador Solución de tinción de anticuerpos.
  5. Dentro de la sección de protocolo de la ventana Agregar diapositiva, seleccione Ensayo de tinción 1 para la tinción, * Desparafinar 4 pasos como preparación y *HIER 20 min con ER2 como HIER. El protocolo enzimático seguirá siendo *----. Una vez que se haya completado, haga clic en Agregar diapositiva. Consulte la Figura 2 como ejemplo.
  6. Repita este proceso según sea necesario para el número de diapositivas que se van a ejecutar en el estudio, asegurándose de que el campo Comentarios de diapositiva se actualice para cada diapositiva agregada para que puedan identificarse de forma única más adelante. Una vez agregadas todas las diapositivas, cierre la ventana Agregar diapositiva e imprima todas las etiquetas, pegándolas a sus secciones de tejido correspondientes.
  7. Cargue cada portaobjetos en la bandeja y coloque los azulejos de cubierta en la parte superior de cada sección antes de cargar la bandeja en el software. Una vez que se agregan los reactivos y los portaobjetos, seleccione el autostainer correspondiente en el lado derecho del software. Una vez seleccionado, las tres bandejas de portaobjetos y la información de todos los reactivos en el software serán visibles, incluidos los reactivos a granel y los añadidos durante la preparación del reactivo.
  8. Asegúrese de que los contenedores de reactivos a granel estén llenos y de que los contenedores de residuos tengan suficiente volumen restante para completar la ejecución, luego presione el botón Reproducir para comenzar la ejecución.
  9. Cada carrera tarda aproximadamente 5 h y 15 min en completarse. Tome nota de la hora de parada y asegúrese de que los portaobjetos se retiren del autostainer de inmediato una vez que se haya completado el protocolo.

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Figura 2: Indicaciones para el software. (A) Nueva indicación de estudio sobre el software Autostainer, que muestra la configuración correcta para el protocolo de tinción de inmunofluorescencia multiplexada (mIF). (B) Agregue un mensaje de diapositiva en el software, que muestra la configuración correcta para el protocolo de tinción mIF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Imágenes

  1. Una vez finalizado el protocolo de tinción, retire los portaobjetos manchados y el cubreobjetos en el medio de montaje. Deje que el medio de montaje se cure en la oscuridad hasta que el cubreobjetos esté firmemente fijado en su lugar (generalmente 1 h o más, punto de pausa).
  2. Portaobjetos de imagen en un microscopio de fluorescencia o un escáner de portaobjetos completos con filtros adecuados para el ensayo. Los colorantes utilizados en este ensayo suelen ser compatibles con los filtros para DAPI, FITC, TRITC, Cy5 y Cy7.
  3. Las imágenes aparecerán similares a las de la Figura 3A. Asegúrese visualmente de que todas las áreas del tejido estén correctamente enfocadas y que las señales aparezcan a un nivel de intensidad adecuado (no sobreexpuestas o subexpuestas). Si es necesario, vuelva a crear imágenes de diapositivas con diferentes ajustes de exposición.
  4. Después de la toma de imágenes, si es necesaria una ronda adicional de imágenes, remoje los portaobjetos en 1x PBS hasta que los cubreobjetos se caigan por sí solos. (punto de pausa)

7. Configuración inicial del protocolo Exchange

  1. Si el software es la versión 7.0 o posterior, habrá una plantilla preinstalada del protocolo autostainer. En la parte inferior de la pantalla, verifique que la selección de Estado preferido esté establecida en Todos. El protocolo de plantilla se llamará *ISP Signal Exchg. Para versiones anteriores de software, el protocolo se puede encontrar en la Tabla 3.
  2. Haga clic con el botón derecho en *ISP Signal Exchg y copie el protocolo. En la ventana emergente resultante, cambie el nombre del protocolo Exchange Protocol 1 con el nombre abreviado ISPEXCH1. Asegúrese de que la casilla Preferido esté marcada antes de continuar y asigne el mismo nombre de kit que se estableció en el paso 2.6.

Tabla 3: Protocolo para el protocolo de intercambio de señales de inmunofluorescencia multiplex. El tampón de lavado corresponde a la solución de lavado BOND. Todos los demás reactivos auxiliares tienen componentes de kit con el nombre correspondiente. Este protocolo es compatible con la versión de software 7.0 y superior, BXD 39 y superior. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

8. Configuración y ejecución del protocolo Exchange

  1. Descongele el tampón de intercambio a temperatura ambiente. Mantenga el neutralizador de intercambio y el iniciador de intercambio a -20 °C hasta su uso. Se necesitan dos contenedores de valoración de reactivos y el kit de detección para realizar el protocolo de intercambio.
  2. Prepare la solución de intercambio en el contenedor correspondiente. El volumen requerido es 350 + (450 μL x número de portaobjetos), y está compuesto por un iniciador de intercambio diluido 1:500 en el tampón de intercambio. No haga vórtices con la enzima de intercambio o la solución de intercambio completa, mezcle solo pipeteando.
  3. Prepare la segunda mezcla de sondas fluorescentes en el contenedor de 2 sondas fluorescentes. El volumen requerido es de 350 + (450 μL x número de portaobjetos) y está compuesto por la solución de sondas fluorescentes 2 diluida 1:20 y el neutralizador de intercambio diluido 1:40 dentro del tampón de sonda 2. La mezcla de la sonda fluorescente y el tampón de la sonda pueden estar en vórtice, pero el neutralizador de intercambio y la solución combinada final solo deben mezclarse con pipeta.
  4. Una vez que todos los reactivos estén preparados, coloque la varilla llena en el autotintor y deje que la máquina pruebe los reactivos.
  5. Agregue todas las diapositivas siguiendo el paso 5. Durante la adición de diapositivas, cambie el marcador a *Negativo. En Preparación, HIER y Enzima, seleccione la opción *----, ya que no es necesario desparafinar ni recuperar antígenos para el protocolo de intercambio. Una vez que se haya completado, haga clic en Agregar diapositiva.
  6. Repita este proceso según sea necesario para el número de diapositivas que se van a ejecutar en el estudio, asegurándose de que el campo Comentarios de diapositiva se actualice para cada diapositiva agregada para que puedan identificarse de forma única más adelante.
  7. Una vez agregadas todas las diapositivas, cierre la ventana Agregar diapositiva e imprima todas las etiquetas, pegándolas a sus secciones de tejido correspondientes.
  8. Cargue cada portaobjetos en la bandeja y coloque los azulejos de cubierta en la parte superior de cada sección antes de cargar la bandeja en el software.
  9. Una vez que se hayan agregado todos los reactivos y portaobjetos, seleccione el Autostainer correspondiente en el software; Esto estará en el lado derecho. Una vez seleccionado, las tres bandejas de portaobjetos y la información de todos los reactivos en el software serán visibles, incluidos los reactivos a granel y los añadidos durante la preparación del reactivo.
  10. Asegúrese de que los contenedores de reactivos a granel estén llenos y de que los contenedores de residuos tengan suficiente volumen restante para completar la ejecución.
  11. Una vez confirmado, presione el botón Reproducir para comenzar la ejecución. El protocolo tarda aproximadamente 90 minutos en completarse. Tome nota de la hora de parada y asegúrese de que las correderas se retiren rápidamente una vez que se complete la ejecución.

9. Imágenes

  1. Repita la adquisición de imágenes para la nueva ronda de sondas, como en el paso 5. Las imágenes aparecerán como en la Figura 3B.

10. Apilamiento (para imágenes de proteínas >4-plex)

  1. Ahora existirán varias imágenes para la misma diapositiva. Combine las imágenes en el software de corregistro de imágenes para generar una imagen apilada de 8 plex.
  2. Registra las imágenes de cada ronda de la siguiente manera.
    1. Cada imagen redonda se denomina de la siguiente manera: _ donde es el nombre único de la diapositiva (código de barras) y es una cadena que, cuando se ordena alfabéticamente, pondrá la imagen de la ronda 1 primero y la imagen de la ronda 2 después. Por ejemplo, para = 1234ABC, los archivos pueden denominarse 1234ABC_Round1 y 1234ABC_Round2, y todos los archivos tienen la extensión adecuada (por ejemplo, .czi) del escáner. Coloque todas las imágenes redondas en una sola carpeta llamada, por ejemplo, Imágenes de origen.
    2. Dentro del software de corregistro, haga clic en el botón Establecer en la sección del directorio de imágenes de origen de la interfaz de usuario y, cuando se le solicite, seleccione la carpeta creada anteriormente.
    3. Establezca el tipo de archivo en la sección Imágenes de origen con la extensión de las imágenes de origen (por ejemplo, .czi, .qptiff, etc.). El software ahora mostrará las dos imágenes redondas juntas en una tabla que muestra que la diapositiva 1234ABC tiene 2 imágenes redondas.
    4. Si lo desea, establezca la ubicación de las imágenes apiladas de salida en un directorio diferente al de la carpeta de imágenes de origen utilizando el botón Establecer en la sección del directorio de imágenes apiladas de la interfaz de usuario y, cuando se le solicite, elija la carpeta de salida deseada . De lo contrario, la carpeta de imágenes de origen se utilizará de forma predeterminada.
    5. De forma predeterminada, solo se crea una representación de archivo .afi de la pila. Marque la opción para guardar un archivo OME.tif de toda la pila en la sección de opciones de procesamiento de la interfaz.
    6. Para validar la precisión del corregistro en toda la muestra, marque la opción Validación en la sección de salida de la interfaz.
    7. Presione el botón START para iniciar el registro conjunto de imágenes.

11. Análisis de imágenes

  1. Una vez que se han creado las imágenes, visualice y analice las diapositivas utilizando cualquier método de análisis de su elección, como la suite de procesamiento de imágenes STARVUE de Ultivue o QuPath15.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siguiendo el protocolo anterior, el tejido FFPE se teñirá con múltiples dianas y se han obtenido imágenes de alta calidad de todos los marcadores en grupos de cuatro (Figura 3A,B). El software de corregistro de imágenes permitirá que las imágenes de la misma diapositiva se combinen y se registren conjuntamente, como se ve en la Figura 3C. En la Figura 4 se muestran resultados similares para un portaobjetos de tejido de cáncer colorrectal (CCR).

El éxito del protocolo debe determinarse evaluando el patrón de tinción esperado. En el ejemplo de CCR mostrado, cada uno de los objetivos teñidos se expresa en el compartimento subcelular esperado, por ejemplo, FoxP3 nuclear, CD3 membranoso, CD68 citoplasmático (Figura 4B-D). Cada una de las dianas funcionales se expresa en el tipo de célula apropiado, como lo demuestra el ejemplo de la colocalización de PD1 y CD3 o de PDL-1 y CD68, que muestran células T agotadas y macrófagos inmunosupresores, respectivamente. La evaluación de una buena relación señal-fondo, que permite distinguir con éxito la señal positiva verdadera del ruido de fondo potencial, suele ser realizada cualitativamente por patólogos o expertos en análisis de imágenes que confirman la calidad de la tinción, lo que permite un análisis de imágenes exitoso. Para confirmar aún más la calidad y el rendimiento de la tinción, se puede agregar la comparación con el IHQ (DAB cromogénico) estándar de oro en secciones seriadas (ver ejemplo en la Figura 5), así como una muestra de tejido de control positiva, como la amígdala humana, que para la mayoría de los objetivos inmunológicos puede ser útil para confirmar el éxito de la tirada. Tenga en cuenta que los cánceres pueden mostrar una menor expresión de objetivos que la amígdala humana16.

Una vez que los resultados se confirman cualitativamente, se puede llevar a cabo un análisis cuantitativo. En este trabajo, esto consiste principalmente en calcular la densidad celular de diferentes fenotipos (número de células/mm2) que expresan un determinado objetivo o objetivos, así como calcular los niveles de intensidad promedio de los objetivos funcionales que pueden mostrar un amplio rango dinámico de expresión. Al evaluar la precisión de los ensayos de mIF, las secciones seriadas teñidas con los mismos marcadores deben mostrar señales comparables entre portaobjetos, lo que se puede ver cualitativamente en la Figura 6. En la Figura 7 se muestran ejemplos de resultados cuantitativos de densidades de marcadores individuales en diferentes tipos de tejidos. El análisis de imágenes en estas imágenes permite identificar las células positivas, y se puede calcular la densidad de células positivas correspondiente para cada marcador, así como la intensidad media de la señal por célula positiva. Esto permite calcular un coeficiente de variabilidad (CV) para cada marcador con el fin de evaluar la precisión del ensayo de multiplexación (Tabla 4).

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Figura 3: Imágenes de un núcleo de microarray tisular (TMA) obtenido a partir de sucesivas rondas de tinción en el protocolo de inmunofluorescencia 8-plex. (A) Imagen obtenida de la primera ronda de imágenes, con los marcadores CD8, PD1, PD-L1 y CD68. Después del protocolo de intercambio, (B) muestra la segunda ronda de imágenes en la misma diapositiva para la segunda ronda de marcadores CD3, CD4, FoxP3 y CK/SOX10, y (C) muestra una imagen registrada conjuntamente que combina las imágenes (A) y (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Tinción representativa de tejido de cáncer colorrectal (CCR) con tinción de inmunofluorescencia de 8 plex. La figura muestra fenotipos celulares que se pueden identificar mediante la colocalización de múltiples objetivos en la misma célula. (arriba) Imagen de portaobjetos completos del tejido del CCR. (abajo) Vistas detalladas de regiones de tejido destacando (A) células T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) células que expresan PD-1 y PD-L1 dentro del tumor y el estroma, (C) células T citotóxicas agotadas (CD3+/CD8+/PD-1), (D) células tumorales evasivas inmunitarias (PD-L1+/CK+) y macrófagos inmunosupresores (CD68+/PDL1+). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Comparación cualitativa de la inmunohistoquímica (IHQ) con la tinción con inmunofluorescencia (IF). Secciones seriadas teñidas con tinción inmunohistoquímica de marcador único (DAB, fila superior), inmunofluorescencia de marcador único (ISP monoplex) y vista de inmunofluorescencia multiplex de un solo canal (ISP multiplex) que demuestran la concordancia cualitativa entre los diferentes métodos de tinción. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Tinción de sección en serie. (A) Diagrama que muestra la disposición de un TMA multitejido. (B) Imágenes representativas de 8-plex de núcleos de tejido de cada tipo de tejido en el TMA. (C) Imágenes representativas de CD8 en un núcleo de amígdalas a través de seis secciones seriadas de TMA teñidas en una sola ejecución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Cuantificación de la densidad de un solo marcador por tipo de tejido incluido en el TMA. Las densidades por tejido son las densidades promedio en tres núcleos representativos de cada tipo de tejido en el portaobjetos TMA. El eje Y representa las densidades de marcadores individuales en diferentes tipos de tejidos en el eje X, en unidades de células positivas/mm2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Análisis de la región de interés (ROI) de la señal fluorescente relativa comparando el MIF del ISP amplificado descrito en este protocolo con el IF indirecto. (A) Portaobjetos representativo teñido para CK (izquierda) o PD-L1 (derecha) con cinco ROI indicados. (B) Imágenes representativas de ROI para CK (arriba) y PD-L1 (abajo). Intensidad media de la señal lograda con mIF amplificado (púrpura) e IF indirecto (azul) para (C) CK y (D) PD-L1 en cinco ROI, cada uno de los cuales mide 100 μm x 100 μm y contiene aproximadamente 200 celdas. Los valores del eje Y muestran unidades fluorescentes arbitrarias y las barras de error muestran desviaciones estándar (n=3). (E) La intensidad relativa de la señal lograda con ISP amplificado mIF (púrpura) e IF indirecto (azul) se calculó tomando la relación entre la señal mIF amplificada media y la señal IF indirecta media en todos los ROI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 4: Coeficiente de varianza (CV) calculado. En la Figura 6 se muestra el CV de la densidad celular positiva y la intensidad media de la señal para las imágenes de amígdalas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

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En este informe se describe un protocolo para la tinción de inmunofluorescencia multiplex de alto rendimiento y alta sensibilidad mediante un autostainer. Al llevar a cabo este protocolo, los pasos de preparación de reactivos son críticos y merecen atención. Es necesario asegurarse de que los reactivos se mezclen de manera adecuada y se midan correctamente para minimizar la variabilidad de la tinción entre diferentes portaobjetos en la misma tirada o entre diferentes tiradas que utilizan los mismos componentes.

Los problemas comunes al llevar a cabo este protocolo incluyen no mezclar los reactivos correctamente antes de la carga y la posibilidad de pérdida de tejido debido a un procedimiento de deslizamiento inadecuado. Si bien este protocolo de tinción es aplicable a cualquier tipo de tejido FFPE, incluidos los tipos de cáncer, algunos tipos de tejido pueden requerir un manejo más cuidadoso (por ejemplo, tejidos con alto contenido de grasa). Para evitar la pérdida de tejido, deje que los portaobjetos deslizantes de la cubierta se remojen durante un tiempo lo suficientemente largo como para que el cubreobjetos se desprenda por sí solo. No fuerce el cubreobjetos para que se desprenda o haga palanca para quitar el vidrio.

Una limitación es que, si bien muchas de las dianas más utilizadas en inmunooncología están validadas y listas para su uso, algunas dianas pueden requerir el desarrollo de ensayos antes de ser incluidas en un panel multiplex. Si bien este proceso es relativamente rápido, esto podría requerir algunas semanas adicionales antes de poder usar un panel multiplex personalizado.

Existen varias diferencias entre este ensayo y otras tecnologías de inmunofluorescencia multiplex. En comparación con las tecnologías basadas en inmunofluorescencia directa e indirecta, el ensayo demostrado aquí tiene un nivel significativamente mayor de amplificación, lo que permite una relación señal-ruido significativamente mejorada, particularmente en los canales que tienden a mostrar autofluorescencia tisular, como el canal FITC. Esto da como resultado una señal ~30 veces más fuerte que la inmunofluorescencia directa y una señal ~10 veces más fuerte que la inmunofluorescencia indirecta, cuantificada mediante el análisis de intensidad de portaobjetos completos y el análisis manual basado en ROI (Figura 8). Este método permite una detección de proteínas objetivo mucho más sensible con tiempos de exposición sustancialmente más bajos y elimina la necesidad de manipulación de la imagen, incluida la sustracción de fondo que corre el riesgo de eliminar las señales de baja intensidad.

En comparación con los ensayos de mIF basados en la amplificación catalizada por enzimas, el ensayo demostrado aquí tiene una capacidad significativamente mejorada para llevar a cabo la multiplexación, además de tener un flujo de trabajo más simple y, en general, un tiempo de ejecución de ensayo más corto (Figura 1). En este ensayo, los anticuerpos se suman en un solo paso y se amplifican simultáneamente, lo que simplifica enormemente el protocolo de ensayo. Además, algunas tecnologías basadas en enzimas, como la amplificación de señal de tiramida (TSA), pueden mostrar interferencia entre diferentes anticuerpos, en lo que se denomina el efecto paraguas 12,17,18. La tecnología de amplificación utilizada aquí evita este problema, permitiendo la detección de múltiples marcadores colocalizados y coexpresados en la misma célula, como se puede ver en la Figura 4.

Aproximadamente el 90% de los cánceres humanos surgen de las células epiteliales19. Esto se debe a que a menudo forman la primera línea de defensa contra el entorno externo y proliferan más rápido, lo que lleva a una acumulación más rápida de mutaciones potencialmente oncogénicas. Aquí, la inflamación desempeña un papel fundamental en la tumorigénesis, la progresión y la diseminación. Durante la última década, muchas terapias dirigidas a los inhibidores de puntos de control inmunitario y a las células inmunitarias han surgido como un poderoso arsenal contra muchos tipos de tumores 5,20,21. Sin embargo, una parte importante de los pacientes sigue sin responder. Es probable que el microambiente tumoral (TME) y el paisaje inmunitario local desempeñen un papel fundamental. Al perfilar las firmas moleculares de TME asociadas con la respuesta diferencial a los fármacos en muchos pacientes, podría ser posible definir mejor los biomarcadores terapéuticos. Este informe demuestra que la tecnología mIF se puede utilizar para perfilar múltiples biomarcadores de proteínas en paralelo, incluidos marcadores con baja expresión, en cientos de portaobjetos de muestras completas o micromatrices tumorales.

Divulgaciones

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Los autores K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. y A. Vasaturo son empleados de Ultivue, que produce los kits de inmunofluorescencia multiplex utilizados en este trabajo.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo de Ultivue.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anti-CD3UltivueClon BC33 (BioCare). Parte de ULT50801
anti-CD4UltivueSP35 (Abcam). Parte de ULT50801
finalanti-CD68KP1 (BioCare). Parte de ULT50801
anti-CD8UltivueC8/144B (BioCare). Parte de ULT50801
de Anti-Cytokeratin + Anti-SOX10UltivueAE1 / AE3 (Bethyl Labs) y BC34 (BioCare). Parte de ULT50801, suministrado como mezcla
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo). Parte de ULT50801
anti-PD1UltivueCAL20 (Abcam). Parte de ULT50801
UltivueAnti-PDL173-10 (Abcam). Parte de ULT50801
microscopio Axioscan.Z1Zeissllamado microscopio de fluorescencia en texto
Solución de desparafinado de Bondde Bond LeicaAR9222
de enlace LeicaAR9640
30 mlde detección de
de LeicaLeicaDS9455
Insertos de valoración BondKit de valoración LeicaOPT9049
BondLeicaOPT9719
Bond Universal CovertilesLeicaS21.4611
Bond Wash Solution 10x ConcentrateLeicaAR9590
BondRX AutostainerLeicallamado "autostainer" en texto
SoftwareBondRXLeicaversión 6.0 o posterior
Coverslips, espesor #1.5Corning2980-244
Etanol, 200 pruebasVWR89370-084
Bloques de tejido FFPE Los tiposBioIVTvarían Ensayo
OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)UltivueULT50801contiene todos los demás componentes de Ultivue
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7,4 con 2,7 mM de KCl y 137 mM de NaCl)
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144llamado "medio de montaje" en
elUltiAnalyzer.AI Ultivue
UltiStacker.AIUltivue
Ultivue Amplification BufferUltivueparte de ULT50801
Ultivue Antibody DiluentUltivueparte de ULT50801
Ultivue Exchange BufferUltivueparte de ULT50801
Ultivue Exchange InitiatorUltivueparte de ULT50801
Ultivue Exchange NeutralizerUltivueparte de ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 1Ultivueparte de ULT50801
Sondas fluorescentes Ultivue 2Ultivueparte de ULT50801
mezcla de preamplificación Ultivueparte de ULT50801
tampón de sondaUltivueparte de ULT50801
agua ultrapuraSigma-AldrichW4502
clonclon clonclonesclonclon Solución de recuperación de epítopos 2 Contenedores abiertos , de kit investigación de OP309700 de tejido texto

Referencias

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