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Artículo de método

Fenotipado basado en purificación, expansión y citometría de flujo de células madre mesenquimales de médula ósea derivadas de ratón

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DOI:

10.3791/67600

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11 de julio de 2025

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Central Laboratory for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe un método rentable para purificar, expandir y caracterizar células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) altamente homogéneas de ratones. Este enfoque facilita la adquisición de grandes cantidades de BMSCs con alto potencial de proliferación y diferenciación, apoyando modelos de ratón y avanzando en la investigación preclínica.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) son una población de células madre que pueden autorrenovarse y diferenciarse en múltiples linajes celulares. Entre ellas, las MSC que se encuentran en la médula ósea, conocidas como células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC), desempeñan un papel crucial en la osteogénesis, el soporte hematopoyético, la localización/migración y la inmunosupresión. Las BMSC se utilizan ampliamente en la investigación en biología celular e ingeniería de tejidos debido a su potencial para estrategias terapéuticas celulares, así como a su fácil disponibilidad, estabilidad genética y baja inmunogenicidad. Las células madre hematopoyéticas (HSC) y las BMSC coexisten en la médula ósea, pero tienen células progenitoras distintas. Al extraer células de la médula ósea, normalmente se obtienen múltiples tipos de células, lo que puede dar lugar a una heterogeneidad en la población celular, lo que puede causar sesgos y no cumplir con los altos estándares experimentales. Por lo tanto, es crucial desarrollar técnicas efectivas para mejorar la homogeneidad y el rendimiento de las BMSC in vitro. Este estudio presenta un protocolo detallado para la purificación, expansión y fenotipado basado en citometría de flujo de BMSCs obtenidas de ratones BALB/c. La homogeneidad y el fenotipo de las células madre de las BMSC de tercer paso se caracterizaron mediante citometría de flujo, demostrando positividad para CD29, CD44 y Sca-1, negatividad para CD45 y CD31, y confirmando su capacidad de diferenciación osteogénica y adipogénica. Este protocolo rentable proporciona un método fácil y eficiente para obtener un número suficiente de BMSC homogéneas con alto potencial de proliferación y diferenciación, lo cual es esencial para avanzar en la investigación en modelos de ratón y estudios preclínicos extensos.

Introducción

Las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC) son conocidas por sus características multipotentes y son ampliamente utilizadas en el tratamiento de diversas enfermedades debido a sus propiedades autorrenovables, diferenciadoras e inmunomoduladoras 1,2. Las BMSC se pueden obtener fácilmente, son capaces de expandirse ampliamente, exhiben propiedades inmunosupresoras y no desencadenan reacciones inmunitarias inmediatas3, lo que las hace atractivas para aplicaciones de ingeniería de tejidos y portadoras efectivas para la terapia celular.

En la médula ósea, dos poblaciones principales de células madre y sus progenies, las células madre hematopoyéticas y las BMSC, son los residentes primarios4. Tradicionalmente, las BMSC se obtienen a través de la aspiración dirigida de la médula ósea y se identifican como células adherentes al plástico in vitro. Sin embargo, este método es insuficiente para diferenciar las BMSC de otras subpoblaciones de médula ósea, incluidas las células endoteliales, los pericitos, los leucocitos y las células madre hematopoyéticas5. Por lo tanto, se necesita un protocolo fácil y eficaz para el aislamiento de las BMSC.

El trabajo actual detalla la separación y purificación de BMSCs a través de su adherencia física a placas de cultivo celular de plástico. Los experimentos de citometría de flujo se llevaron a cabo en BMSC de tercer paso utilizando los marcadores de superficie CD29, CD44 y Sca-1, según lo descrito por el comité de células estromales mesenquimales (MSC) de la Sociedad Internacional de Terapia Celular y Génica (ISCT)6. De acuerdo con los criterios de la ISCT, las MSC de ratón se caracterizan por positividad para CD29, CD44 y antígeno de células madre 1 (Sca-1), y negatividad para el marcador de células hematopoyéticas CD45 y el marcador de células endoteliales CD31. Además, las BMSC deben ser multipotentes, demostrando una diferenciación de tres linajes en osteoblastos, condrocitos y adipocitos. En este experimento, se indujo osteogénesis en las BMSC extraídas, con tinción de ALP realizada el día 7 y un ensayo de rojo de alizarina S el día 21 para evaluar la diferenciación. También se indujo la diferenciación adipogénica de BMSCs aisladas y purificadas, con tinción de Oil Red O realizada el día 21 para evaluar la adipogénesis.

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Protocolo

El manejo de animales fue aprobado de acuerdo con las pautas de Ética de Animales de Laboratorio (Aprobación ética No.: PZSHUTCM2211070009) de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai. En este estudio se utilizaron ratones hembra BALB/c de ocho semanas de edad (grado SPF, 20 ± 1 g de peso corporal). Este protocolo describe la purificación, el paso, el fenotipado basado en citometría de flujo y la diferenciación osteogénica y adipogénica de las BMSC derivadas de ratones. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Manejo de animales

  1. Ratones domésticos en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en jaulas ventiladas individualmente, con cinco ratones por jaula. Proporcione alimento de grado SPF y agua estéril. Mantenga un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas.
    NOTA: Este método ha sido probado y se ha encontrado que es factible en las cepas de ratón BALB/c y C57BL/6. En este documento se utiliza principalmente BALB/c como ejemplo.

2. Recolección de fémures y tibias de las extremidades traseras de los ratones

  1. Sacrificar a los animales mediante asfixia por CO2 seguida de luxación cervical7 siguiendo las pautas éticas.
  2. Remoje los ratones en etanol al 75% durante 5 minutos (Figura 1A).
    NOTA: Las células madre se recolectaron dentro de los 30 minutos2 después de la eutanasia, y todo el proceso, incluido el lavado de la médula, la filtración y la siembra en placas de cultivo, se completó dentro de las 2 horas para garantizar la viabilidad celular óptima.
    NOTA: Utilice ratones adultos (≥8 semanas de edad) para obtener un rendimiento óptimo de BMSC; Los ratones de 8 a 12 semanas de edad son ideales8.
  3. Realizar una incisión de aproximadamente 1 cm en la extremidad posterior del tendón de Aquiles con tijeras de disección estériles (Figura 1B).
  4. Realice una incisión circular alrededor de la extremidad posterior del tendón de Aquiles con tijeras estériles para exponer la tibia distal (Figura 1C).
  5. Retire la piel desde la incisión hacia la cadera para extraerla de ambas extremidades traseras (Figura 1D).
  6. Corte a lo largo del hueso ilíaco para separar la cabeza femoral del hueso de la cadera (Figura 2A).
    NOTA: Evite dañar las articulaciones bilaterales del fémur durante la disección para evitar la pérdida de médula ósea.
  7. Colocar los fémures y tibias recolectados en una placa de 60 mm que contenga PBS prefrío estéril que contenga un 2% de penicilina/estreptomicina (Figura 2B).
  8. Corte la mayor cantidad posible de tendón y músculo de la tibia y el peroné con un bisturí estéril para facilitar el lavado posterior (Figura 2C).
  9. Regrese los huesos procesados a PBS que contenga 2% de penicilina/estreptomicina y transfiéralos a la campana estéril para los siguientes pasos de aislamiento.

3. Purificación y cultivo de BMSCs de ratón

  1. Prepare el medio completo de modificación alfa de MEM (αMEM) para el cultivo de BMSC suplementando αMEM con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina.
    NOTA: Elija el medio αMEM ya que contiene 1000 mg/L de glucosa, que es una concentración relativamente baja. Esto ayuda a prevenir la inhibición de la proliferación celular que puede ocurrir en ambientes con alto contenido de glucosa9
  2. Tome una jeringa de 50 ml y coloque la aguja que viene con la jeringa.
  3. Extraiga 20 ml de medio αMEM en la jeringa de 50 ml, luego reemplace la aguja con la que viene con la jeringa de 1 ml.
    NOTA: Utilice una aguja de jeringa de 1 ml para acomodar el tamaño del hueso y minimizar el daño celular. Una jeringa de 50 ml permite un lavado eficiente de la médula ósea con un riesgo reducido de contaminación celular por inserciones repetidas.
  4. Use una tijera para cortar ambos extremos del fémur o la tibia separados en una capucha estéril.
  5. Inserte la aguja en el hueso a lo largo del borde cortado y enjuague la médula ósea en una placa de cultivo de 100 mm que contenga medio αMEM completo (Figura 2D).
  6. Enjuague las cavidades óseas repetidamente hasta que las piezas óseas parezcan pálidas para asegurarse de que se haya extraído la mayor parte de la médula ósea (Figura 2E).
  7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 40 veces suavemente con la punta de una pipeta para dispersar las células agregadas tanto como sea posible.
  8. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo de centrífuga de 50 mL para eliminar desechos, fragmentos de tejido y grumos no dispersos.
  9. Transfiera la suspensión celular filtrada a una placa de cultivo celular de 100 mm y agregue el medio αMEM completo hasta un volumen final de 15 mL por placa.
    NOTA: Cultive todas las células de médula ósea recolectadas de los fémures y tibias de cada ratón en una placa de cultivo de 100 mm para facilitar el crecimiento celular. Sobre la base de experimentos previos, se pueden aislar aproximadamente 1 × 107 BMC de un ratón de 8 semanas de edad (de dos fémures y dos tibias). Estas células se siembran en una placa de cultivo de 100 mm a una densidad de 1,8 ×10 5 células/cm2 para el cultivo primario.
  10. Sostenga el plato con ambas manos y gírelo suavemente en forma de ocho 15 veces para garantizar una distribución uniforme de las células en el plato.
  11. Colocar la placa de cultivo a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% y cultivar durante 5 días (Figura 3A).
    NOTA: Evite mover la placa de cultivo durante este período para asegurar un crecimiento celular uniforme.

4. Sustitución del medio αMEM para el cultivo de BMSC

  1. Observe las células bajo un microscopio para determinar si han alcanzado el 80% de confluencia. De lo contrario, proceda con el reemplazo del medio el5º día.
  2. Extraiga 3 mL de PBS con una pipeta Pasteur estéril y dispense desde una altura de 1 cm por encima de la placa de cultivo en diferentes posiciones.
    NOTA: Evite dispensar líquido por un lado del plato, ya que esto puede eliminar las células adherentes debido a una fuerza de impacto excesiva e impedir la eliminación efectiva de las células no deseadas.
  3. Después de agregar 3 mL de PBS, agite suavemente la placa de cultivo para lavar bien las células y retire el PBS de la placa con una pipeta. Repita el proceso de lavado una vez más para asegurarse de que las celdas se laven a fondo.
  4. Extraiga 15 mL de medio αMEM completo con una pipeta Pasteur estéril y dispense desde 1 cm por encima de la placa de cultivo en diferentes posiciones.
  5. Regrese la placa de cultivo a la incubadora y monitoree hasta que las células alcancen el 80% de confluencia antes de subcultivar (Figura 3B).

5. Aprobación de las BMSC

  1. Lave el 80% de las células confluentes dos veces con PBS (Figura 3C).
    NOTA: Lavar las células con PBS antes de la digestión ayuda a eliminar el medio residual y las secreciones celulares y reduce la adhesión de MSC a la placa de cultivo.
  2. Digiera las células con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25% incubando a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 2-3 min.
  3. Neutralice la tripsina añadiendo 4 mL de medio αMEM completo a la suspensión celular.
  4. Aspire la suspensión celular de la placa de cultivo con una punta de pipeta de 1 ml y enjuague suavemente el fondo de la placa para separar todas las células adheridas.
  5. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  6. Utilice una pipeta para desechar el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en 2 mL de medio αMEM completo.
    NOTA: Para el subcultivo, se encontró que una densidad de siembra de aproximadamente 4 × 104 células/cm2 es óptima para el crecimiento y la proliferación continuos.
  7. Divida las células en una proporción de 1:1-1:2 en nuevas placas de cultivo celular de 100 mm (esto constituye el1er paso, P1) (Figura 3D).
  8. Divida las celdas aproximadamente cada tres días en una proporción de 1:1.5 cuando alcancen el 80% de confluencia para generar el segundo paso (P2) (Figura 3E) y el tercer paso (P3) (Figura 3F) de BMSC.

6. Preparación de BMSCs P3 para la identificación fenotípica y la diferenciación osteogénica

  1. Deseche el medio de cultivo celular.
  2. Lave los BMSC P3 con 3 mL de PBS dos veces.
  3. Digiera las BMSC P3 con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25 % incubando a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % durante 2-3 minutos cuando alcancen el 80 % de confluencia.
  4. Neutralice la tripsina añadiendo 4 mL de medio αMEM completo a la suspensión celular.
  5. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugue a 300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
    NOTA: Los gránulos P3 BMSC preparados aquí se utilizarán para la identificación fenotípica mediante citometría de flujo y para evaluar la diferenciación osteogénica o adipogénica.

7. Identificación fenotípica de BMSCs por citómetro de flujo

  1. Vuelva a suspender los gránulos de células de BMSC P3 con 1,5 ml de solución de PBS que contenga 2% de FBS y ajuste la concentración a 5 × 106 células/ml.
  2. Alícuota 100 μL de la suspensión celular en cada uno de los 11 tubos para lograr 5 × 105 células por tubo. Prepare los siguientes grupos: etiqueta en blanco, control de isotipo CD29, CD29, control de isotipo CD44, CD44, control de isotipo Sca-1, Sca-1, control de isotipo CD31, CD31, control de isotipo CD45 y CD45.
    NOTA: En el presente estudio se utilizaron los siguientes fluorocromos: CD29-FITC, CD29 isotipo-FITC, CD44-APC, CD44 isotipo-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotipo-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotipo-PerCPcy5.5, CD31-PE e ISO31-PE (como se muestra en la tabla de materiales). Estos fluorocromos se pueden modificar en función de las configuraciones de los diferentes citómetros de flujo.
  3. Para cada grupo, añadir los siguientes reactivos: 2 μL de PBS al grupo de etiqueta en blanco, 2 μL de isotipo CD29 al grupo de control del isotipo CD29 (dilución 1:50), 2 μL de CD29 al grupo CD29 (dilución 1:50), 0,5 μL de isotipo CD44 al grupo control del isotipo CD44 (dilución 1:200), 0,5 μL de CD44 al grupo CD44 (dilución 1:200), 0,5 μL de isotipo Sca-1 para el grupo de control del isotipo Sca-1 (dilución 1:200), 0,5 μL de Sca-1 para el grupo Sca-1 (dilución 1:200), 2 μL de isotipo CD31 para el grupo control del isotipo CD31 (dilución 1:50), 2 μL de CD31 para el grupo CD31 (dilución 1:50), 2 μL del isotipo CD45 para el grupo control del isotipo CD45 (dilución 1:50), y 2 μL de CD45 al grupo CD45 (dilución 1:50).
    NOTA: Los anticuerpos se utilizaron de acuerdo con las recomendaciones optimizadas del fabricante para la citometría de flujo. Los experimentos preliminares confirmaron la tinción óptima y la especificidad para las células diana. Consulte las pautas de dosificación del fabricante y realice pruebas previas de titulación según sea necesario.
  4. Mezclar suavemente, centrifugar con una centrífuga de palma e incubar durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.
  5. Añadir 900 μL de PBS a cada tubo, mezclar invirtiendo y centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante para eliminar el exceso de anticuerpos.
  6. Vuelva a suspender el pellet celular en cada tubo con 300 μL de PBS y analice con un citómetro de flujo.
    NOTA: No es necesario fijar las celdas con formaldehído neutro al 2,5% si el ensayo del citómetro de flujo se puede completar en 1-2 h. Si el análisis no se puede realizar en 1-2 h, fije las celdas con formalina tamponada neutra al 2,5 % (preparada mezclando formalina tamponada neutra al 10 % con PBS en una proporción de 1:3) y almacene a 4 °C en la oscuridad durante la noche para el ensayo posterior con citómetro de flujo.
  7. Ajuste el voltaje del citómetro de flujo utilizando el grupo en blanco de etiqueta para garantizar que la autofluorescencia de la celda esté dentro de aproximadamente 1/4–1/3 del eje de coordenadas. Cargue secuencialmente las células de los grupos de isotipo CD29, CD29, isotipo CD44, CD44, isotipo Sca-1, Sca-1, isotipo CD31, CD31, isotipo CD45 y CD45. Configure la puerta P1 (como se define en el gráfico FSC/SSC) para capturar 10.000 celdas, funcionando a velocidad media.
    NOTA: Asegúrese de que el citómetro de flujo esté equipado con los canales adecuados, como los que se utilizan habitualmente en los experimentos: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 y APC, u otros canales que correspondan a fluoresceínas acopladas a anticuerpos.

8. Diferenciación osteogénica de las BMSC

  1. Resuspenda los gránulos de P3 BMSC en medio αMEM completo, ajustando la concentración a 1 × 105 células/mL.
  2. Siembre las BMSC P3 en una placa de cultivo celular de 24 pocillos agregando 1 mL de medio αMEM completo que contenga 1 × 105 células a cada pocillo.
  3. Cultive las BMSC P3 a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2 durante 3-5 días hasta que alcancen más del 90% de confluencia. Reemplace el medio αMEM completo con medio nuevo cada 2 días.
  4. Divida los diferentes pocillos en partes iguales en dos grupos: el grupo de control negativo (sin inducción de diferenciación osteogénica) y el grupo de diferenciación osteogénica
  5. Prepare el medio de inducción de diferenciación osteogénica suplementando el medio αMEM completo con 10 mmol/L de β-glicerofosfato, 50 mg/L de ácido L-ascórbico y 10-8 mol/L de dexametasona.
  6. Deseche el medio de cultivo celular y lave las BMSC P3 con 1 mL de PBS.
  7. Agregue el medio de inducción de diferenciación osteogénica a los pocillos del grupo de diferenciación osteogénica para la inducción de diferenciación osteogénica (1 mL/pocillo).
  8. Agregue el medio αMEM completo a los pocillos del grupo de control (1 mL/pocillo).
  9. Cultivar las BMSC P3 a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 7 o 21 días, sustituyendo el medio de inducción de diferenciación osteogénica o el medio αMEM completo por el mismo medio fresco cada 3 días.
    NOTA: Las células con una inducción de 7 días se utilizan para la tinción de fosfatasa alcalina (ALP). Las células con una inducción de 21 días se utilizan para el ensayo S rojo de alizarina.

9. Identificación de células osteogénicas diferenciadas con tinción de ALP

  1. Lave las celdas en cada pocillo de la placa de 24 pocillos con 1 mL de PBS una vez.
  2. Fije las células añadiendo 0,5 mL de solución de formalina tamponada al 10% e incubando durante 20 min.
  3. Lave las celdas de cada pocillo nuevamente con 1 mL de PBS una vez.
  4. Añada 0,5 ml de reactivo de tinción de fosfatasa alcalina NBT/BCIP de 1 paso a cada pocillo e incube a 37 °C durante 30 min con una envoltura de papel de aluminio para protegerlo de la luz.
  5. Deseche la solución, lave las celdas de cada pocillo con 1 ml de agua destilada una vez y deje que la placa se seque.
  6. Observe y adquiera imágenes de colonias teñidas usando una cámara para identificar células ALP positivas con precipitado negro-púrpura.
    NOTA: El reactivo de tinción de fosfatasa alcalina (ALP) NBT/BCIP de 1 paso produce un precipitado negro-púrpura fuerte e insoluble al reaccionar con ALP, que se puede visualizar fácilmente.

10. Identificación de células osteogénicas diferenciadas mediante el ensayo S de rojo de alizarina

  1. Lave las celdas en cada pocillo de la placa de 24 pocillos con 1 mL de PBS una vez.
  2. Fije las células añadiendo 0,5 mL de solución de formalina tamponada al 10% e incubando durante 20 min.
  3. Lave las celdas en cada pocillo de la placa de 24 pocillos con 1 mL de PBS una vez.
  4. Añadir 0,5 mL de alizarina roja S al 0,1% en Tris-HCl 0,1 mol/L (pH 8,3) a cada pocillo e incubar a 37 °C durante 30-60 min.
  5. Deseche la solución, lave las celdas de cada pocillo con 1 ml de agua destilada una vez y deje que la placa se seque.
  6. Observe y adquiera imágenes de colonias teñidas usando una cámara para identificar células S positivas de rojo alizarina.
    NOTA: El ensayo de rojo de alizarina S para la diferenciación de MSC en células óseas mineralizadas maduras da como resultado la formación de un complejo de S-calcio rojo de alizarina, que produce una tinción roja brillante que se puede observar visualmente.

11. Preparación de medios de diferenciación por inducción adipogénica A para BMSC

NOTA: Para la diferenciación de adipocitos de BMSC, a menudo se usa un kit de diferenciación adipogénica de células madre mesenquimales de médula ósea de ratón (consulte la tabla de materiales) de acuerdo con las pautas.

  1. Coloque el Suero Fetal Bovino (un componente del Kit, denominado suero) en el refrigerador a 4 °C durante al menos 6 h antes de la descongelación completa.
  2. Coloque el Suplemento A-I (componente del Kit) en el refrigerador a 4° C al menos 30 minutos antes de la preparación; coloque el Suplemento A-II (componente del Kit) a temperatura ambiente hasta que esté completamente descongelado.
  3. Invierta o golpee suavemente el tubo de reactivo para mezclar el contenido.
  4. Centrifugar el tubo de reactivo del Suplemento A-II a 300 × g durante 30 s a temperatura ambiente para asegurarse de que el reactivo se acumule en el fondo para facilitar su recuperación.
  5. Limpie a fondo el embalaje exterior de todos los componentes con alcohol medicinal al 75% y ábralos en un armario de bioseguridad.
  6. Agregue suero, Suplemento A-I y Suplemento A-II en el medio.
    NOTA: Para asegurar una disolución adecuada, precaliente el medio basal (un componente del kit) a 37 °C, o el suplemento A-II puede precipitar debido a la exposición al frío.
  7. Use una pequeña cantidad de medio basal para enjuagar cada botella y tubo, asegurándose de transferir todos los componentes al medio basal.
  8. Asegure la tapa en el frasco Basal Medium y agite suavemente para mezclar bien.
  9. Selle la botella con una película de parafina, envuélvala en papel de aluminio y etiquétela con el nombre, la fecha de preparación y otros detalles.

12. Preparación de medios de diferenciación por inducción adipogénica B para BMSCs

  1. Coloque el suero fetal bovino en el refrigerador a 4 °C durante al menos 6 h antes de la descongelación completa.
  2. Coloque el Suplemento B (un componente del Kit) en un refrigerador a 4 °C hasta que esté completamente descongelado durante al menos 30 minutos antes de la preparación.
  3. Invierta o golpee suavemente el tubo de reactivo para mezclar el contenido.
  4. Centrifugar el tubo del Suplemento B para concentrar el reactivo en el fondo y facilitar la recolección.
  5. Limpie a fondo el embalaje exterior de todos los componentes con alcohol medicinal al 75% y ábralos en un armario de bioseguridad.
  6. Añadir suero y Suplemento B en el medio basal.
  7. Use una pequeña porción del medio basal para lavar cada botella y tubo, asegurándose de que todos los componentes se transfieran completamente al medio.
  8. Asegure la tapa en el frasco Basal Medium y agite suavemente para mezclar bien.
  9. Selle la botella con parafilm, envuélvala en papel de aluminio y etiquétela con el nombre, la fecha de preparación y otros detalles.

13. Diferenciación de adipocitos de BMSCs

  1. Agregue 1 ml de gelatina al 0,1% a un plato de seis pocillos, agitándolo para cubrir uniformemente el fondo de cada pocillo.
  2. Coloque la placa de seis pocillos cubierta con gelatina al 0,1% en una campana estéril o en una incubadora deCO2 durante al menos 30 minutos.
  3. Aspire la gelatina y el plato estará listo para la siembra de células, o espere a que los pocillos se sequen antes de sembrar después de 30 minutos.
  4. Siembre las BMSC P3 a una densidad de 4 × 104 células/cm2 en cada pocillo de la placa de seis pocillos, agregando 2 mL de medio completo a cada pocillo.
  5. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO2 con 5% de CO2 y humedad saturada.
  6. Aspire el medio con cuidado y agregue 2 mL de medio de inducción de diferenciación adipogénica A a cada pocillo cuando las células alcancen el 100% de confluencia.
  7. Aspirar el medio A de los pocillos después de 3 días de inducción, y añadir 2 mL de medio de diferenciación adipogénico B.
  8. Aspire el medio B después de 1 día y vuelva a cambiar al medio A para una mayor inducción.
  9. Alterne entre el medio A y B, y observe las células diariamente. Si se produce una contracción o muerte celular durante la inducción con el medio A, cambie al medio B de inmediato.
  10. Repita el proceso de inducción y mantenimiento hasta que aparezca un número suficiente de gotas de lípidos del tamaño adecuado y luego prepárese para la tinción.

14. Mancha de aceite rojo O (ORO)

NOTA: Realice todos los procedimientos con la mayor suavidad posible para evitar el desprendimiento de las gotas de lípidos.

  1. Aspire el medio de diferenciación de inducción adipogénica de la placa de 6 pocillos después de completar la diferenciación por inducción adipogénica y lave suavemente con 1×PBS 2-3 veces.
  2. Agregue 2 mL de formalina tamponada neutra al 10% por pocillo y fije durante 20 min a temperatura ambiente.
  3. Prepare la solución de trabajo de Oil Red O mezclando el caldo de Oil Red O con agua destilada en una proporción de 3:2. Después de mezclar, centrifugar a 250 × g durante 4 min y utilizar el sobrenadante.
  4. Aspire el fijador y lávelo suavemente con PBS 2 o 3 veces, asegurándose de retirar completamente el fijador.
  5. Agregue 0,8 mL de solución de tinción de rojo O a cada pocillo, deje a temperatura ambiente durante 30 min.
  6. Aspirar la solución antimanchas, lavar dos veces con 1 mL de etanol al 75%.
  7. Agregue 1 mL de contratinción de hematoxilina a cada pocillo durante 2 min, luego aspire.
  8. Agregue 2 mL de PBS a cada pocillo y observe los resultados de la tinción adipogénica bajo un microscopio.
  9. Selle la placa de seis pocillos teñida con parafilm y guárdela a 4 °C.
    NOTA: No lo almacene durante más de 1 semana. Las gotas de lípidos pueden fusionarse, perdiendo el estado de tinción.

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Resultados

Las BMSC derivadas de ratones se aislaron y cultivaron durante aproximadamente 2 semanas para generar las BMSC del tercer paso (P3) (Figura 3). Como se muestra en la Figura 3A, las células recién extraídas de la médula ósea permanecieron mononucleares con gotas de grasa visibles. Las células fusiformes aparecieron en la placa de cultivo, alcanzando una confluencia del 60%-80% en el5º día de cultivo (

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Discusión

La terapia con células madre ha despertado un interés considerable debido a su potencial para revolucionar la medicina regenerativa. Los estudios preclínicos han proporcionado evidencia sustancial que apoya la aplicación clínica de las células madre, particularmente las BMSC13. Sin embargo, desafíos como el bajo rendimiento celular, la contaminación y el crecimiento lento han impedido su aplicación clínica. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de investigaci...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses en relación con este estudio.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2020YFE0201600) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82174408 y 82374477).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de 1 ml (aguja de jeringa de 22 G)AMABLE GRUPO (KDL)60017031
NBT/BCIP de 1 pasoBiotecnología Pierce, Inc.34042Tinción de fosfatasa alcalina
Formalina tamponada neutra al 10%Wexis5200250Fijación celular
Placa de 6 pocillosSelección de laboratorio11110Cultivo celular
Placa de 24 pocillosSelección de laboratorio11310Cultivo celular
40 μ m Filtro de célulasCornig352340Filtración para eliminar aglomerados
Jeringa de 50 mlAMABLE GRUPO (KDL)60017040
75% de etanolShanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd31009001Desinfectar la piel de los ratones
Alizarin Red SSigma-Aldrich A5533Detección de depósitos de calcio y nódulos calcificados
Anticuerpo monoclonal APC CD44 (clon: IM7)eBiociencia17-0441-82Citometría de flujo 
Control de isotipo IgG2b kappa de rata de APC (clon: eB149 / 10H5)eBiociencia17-4031-82Citometría de flujo 
AutoclaveCompañía Hiryama de JapónHVE-50Instrumentos quirúrgicos de esterilización
Incubadora de CO2Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.300583057Cultivo celular
Flujometría CytoflexBeckman Coulter A00-1-1102Citometría de flujo 
dexametasonaSigma-Aldrich D4902Diferenciación osteogénica de BMSC
Plato (100 mm)Corning430167Cultivo celular
Plato (60mm)Corning430166Colocación de la muestra durante el trasplante
Bolas de algodón desinfectanteShanghai Honglong Industrial Co., Ltd.20230627Desinfectar la piel de los ratones
Guantes estériles desechablesShanghai Honglong Industrial Co., LtdYT21131Funcionamiento estéril
Dieta de roedores irradiados de doble leónTecnología de alimentación animal experimental Suzhou Shuangshi Co., Ltd.GB 14924.3Alimentación animal
Suero fetal bovinoShanghai Biosun Sci& Tech Co., Ltd.BS-0002-500Cultivo celular
FITC Hamster Anti-Rat CD29 (clon: Ha2/5)BD Biociencias555003Citometría de flujo 
FITC IgM de hámster, λ 1 Control de isotipo (clon: G235-1)BD Biociencias553960Citometría de flujo 
gelatina (0,1%)OriCellGLT-11301Mejorar la capacidad de adhesión de las células
Jaula de ratones IVCsTecnología de equipos experimentales de animales del Rey Mono de Suzhou Co., Ltd.HH-MMB-2Barrera animal
Ácido L-ascórbicoSigma-Aldrich A8960Diferenciación osteogénica de BMSC
Rotulador MarkZebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.YYST5Marcar la información celular en la placa de Petri
Modificación de MEM Alpha (1X)Shanghai NianYue Biotechnology Co., LtdSH30265Cultivo celular
Kit de diferenciación adipogénica de células madre mesenquimales de médula ósea de ratónCyagenMUXMX-90031Diferenciación adipogénica de BMSCs
Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti2 SynstemJapón Nikon CorporatinTi2-UObserva las celdas y toma fotos
Tijeras oftálmicas Shanghai NianYue Biotechnology Co., LtdY00030 JZCortar la piel
Pinzas oftálmicasShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdBS-ZER-S-100 BiosharpObtener tejido óseo de ratón.
PIPETA PASTEURShanghai NianYue Biotechnology Co., LtdBS-XG-03MAspirar el medio de cultivo
PE Rat Anti-Mouse CD31 (clon: Ha2/5)BD Biociencias553373Citometría de flujo 
Rata PE IgG2a, κ Control de isotipo (clon: R35-95)BD Biociencias553930Citometría de flujo 
Anticuerpo monoclonal PE-cianina7 Ly-6A/E (Sca-1) (clon: D7)eBiociencia25-5981-82Citometría de flujo 
Control de isotipo PE-Cianine7 Rat IgG2a kappa (clon: eBR2a)eBiociencia25-4321-82Citometría de flujo 
Penicilina-EstreptomicinaShanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd2585636Cultivo celular
PerCP-Cy5.5 Anti-rata antiratón CD45 (clon: Ha2 / 5)BD Biociencias561869Citometría de flujo 
PerCP-Cy5.5 Rata IgG2b, κ Control de isotipo (clon: A95-1)BD Biociencias550764Citometría de flujo 
Escalpelos¿Fábrica de instrumentos quirúrgicos de Shanghai Medical Devices? Grupo?Co., Ltd. J11010-10# JZAislar las extremidades traseras y el torso del ratón y eliminar los tejidos extraños del hueso
Capucha estérilThermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.ECO0.9Mesa de operaciones quirúrgicas
paños quirúrgicos estérilesEquipo médico Henan Huayu Co., Ltd.20160900Proporcionar un área de cirugía estéril
Tubo (50 ml)Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.BLD-BL2002500Almacenar la solución celular filtrada
tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200056digerir las células adherentes
β-glicerofosfatoSigma-Aldrich G5422Diferenciación osteogénica de BMSC

Referencias

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