Este protocolo describe un método para injertar una perla magnética en el corazón del pez cebra en desarrollo a través de la microcirugía, lo que permite la manipulación de fuerzas mecánicas in vivo y desencadena la afluencia de calcio dependiente del estímulo mecánico en las células endocárdicas.
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Artículo de método
Manipulación de fuerzas mecánicas en el corazón de pez cebra en desarrollo utilizando perlas magnéticas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las fuerzas mecánicas proporcionan continuamente retroalimentación a los programas morfogenéticos de las válvulas cardíacas. En el pez cebra, el desarrollo de la válvula cardíaca depende de la contracción del corazón y de los estímulos físicos generados por el corazón latiendo. La hemodinámica intracardíaca, impulsada por el flujo sanguíneo, emerge como información fundamental que da forma al desarrollo del corazón embrionario. Aquí, describimos un método efectivo para manipular fuerzas mecánicas in vivo mediante el injerto de una perla magnética de 30 μm a 60 μm de diámetro en el lumen cardíaco. La inserción de la cuenta se lleva a cabo mediante microcirugía en larvas anestesiadas sin perturbar la función cardíaca y permite la alteración artificial de las condiciones límite, modificando así las fuerzas de flujo en el sistema. Como resultado, la presencia de la perla amplifica las fuerzas mecánicas experimentadas por las células endocárdicas y puede desencadenar directamente la afluencia de calcio dependiente de estímulos mecánicos. Este enfoque facilita la investigación de las vías de mecanotransducción que gobiernan el desarrollo del corazón y puede proporcionar información sobre el papel de las fuerzas mecánicas en la morfogénesis de la válvula cardíaca.
Introducción
Desde su introducción a finales dela década de 1970, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un poderoso sistema modelo para estudiar las complejidades del desarrollo cardíaco y los trastornos cardíacos congénitos. A diferencia de la mayoría de los vertebrados, incluidos los embriones de ratón y pollo, que dependen de un sistema cardiovascular funcional y no pueden sobrevivir a los defectos cardíacos tempranos, el pez cebra proporciona una ventaja única al permitir la investigación de fenotipos cardíacos graves. Esto se debe a su pequeño tamaño, que facilita un suministro suficiente de oxígeno a través de la difusión pasiva, permitiendo la supervivencia incluso en ausencia de contracción cardíaca y circulación sanguínea activa 2,3,4. Además, entre las muchas características significativas del pez cebra se encuentra la transparencia óptica de sus embriones, lo que permite el monitoreo no invasivo del corazón en desarrollo 5,6,7,8.
Las fuerzas mecánicas proporcionan continuamente retroalimentación a los programas morfogenéticos de la válvula cardíaca 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 , y el flujo sanguíneo aberrante es ampliamente reconocido como un factor compartido en diversos trastornos cardiovasculares23,24. En el pez cebra, el desarrollo de la válvula cardíaca depende de la contracción del corazón y de las fuerzas mecánicas generadas por el latido del corazón. Múltiples mutantes del pez cebra han demostrado la importancia de los estímulos mecánicos generados por el corazón en la valvulogénesis. Sorprendentemente, la ausencia completa de contracción cardíaca y, en consecuencia, de flujo sanguíneo debido a las mutaciones de la troponina T cardíaca (tnnt2) en mutantes cardíacos silentes (sih) resulta en la ausencia de convergencia tisular y agrupamiento de células endocárdicas (EdC) durante las etapas morfogenéticas tempranas25.
La hemodinámica intracardíaca y las fuerzas mecánicas generadas por el flujo sanguíneo emergen como componentes epigenéticos fundamentales que dan forma al desarrollo del corazón embrionario del pez cebra. Numerosos estudios sugieren que la morfogénesis cardíaca adecuada en el pez cebra requiere estímulos de flujo distintos, y las desviaciones de estos patrones fisiológicos conducen a defectos de las válvulas cardíacas 10,13,14,22,26. Aquí, describimos un método efectivo, adaptado de Fukui et al.13, para manipular fuerzas mecánicas in vivo mediante el injerto de una cuenta magnética de 30 μm a 60 μm de diámetro dentro del corazón palpitante del pez cebra en desarrollo. La técnica consiste en la inserción microquirúrgica de una perla en la luz cardíaca de las larvas anestesiadas sin alterar la función cardíaca. La presencia de la perla conduce a la amplificación de las fuerzas mecánicas experimentadas por las EdC, desencadenando directamente la afluencia de calcio dependiente del estímulo mecánico13. Este enfoque permite la investigación de las vías de mecanotransducción que regulan la morfogénesis del corazón y ofrece un medio para profundizar nuestra comprensión del papel de las fuerzas mecánicas en la formación de válvulas.
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Protocolo
Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra descritos en este protocolo se adhieren a la directiva europea 2010/63/UE y a las directrices del Ministerio del Interior en virtud de la licencia de proyecto PP6020928.
1. Obtención de embriones de pez cebra para injerto de cuentas
- Cruza la línea de pez cebra correspondiente y cultiva los embriones en el medio de Danieau a 28,5 °C. Para obtener instrucciones más detalladas sobre cómo cruzar líneas de pez cebra, consulte la Base de Datos de Educación Científica de JoVE27.
- Tratar los embriones con 1-fenil-2-tiourea (PTU) a partir de las 24 h post fecundación (hpf) para inhibir la formación de pigmento, utilizando una concentración de PTU al 0,003% en el medio de Danieau.
- Si utiliza una línea marcada con fluorescencia, examine los embriones bajo un estereoscopio de fluorescencia antes de comenzar el injerto de perlas, y seleccione de 10 a 20 embriones sanos que exhiban fluorescencia brillante. Decorionar suavemente los embriones preseleccionados bajo el microscopio estereoscópico con pinzas, asegurándose de que los embriones no se dañen.
2. Montaje de embriones de pez cebra
- Prepare 20 ml de medio Danieau que contenga 0,02% de tricaína.
- Prepare 2 mL de alícuotas de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) al 1% que contenga 0,02% de tricaína en tubos de microcentrífuga de 2 mL. Coloque los tubos en un bloque térmico a 38 °C para mantener la agarosa LMP en estado líquido.
NOTA: La agarosa LMP al 1% se puede preparar con anticipación para su uso el día del montaje y el injerto del cordón. - Transfiera de 3 a 6 embriones decorionados a una placa de Petri que contenga medio de Danieau suplementado con tricaína al 0,02%.
- Cuando los embriones estén anestesiados, transfiéralos a un plato con fondo de vidrio de 35 mm x 15 mm con un medio mínimo. Agregue rápidamente 300-400 μL de agarosa LMP al 1% que contenga tricaína para crear una cúpula. Con pinzas, coloque los embriones de manera que queden rectos, en contacto con el vidrio, con el lado ventral hacia arriba, como se muestra en la Figura 1. Espere ~ 4 minutos para que la agarosa se solidifique.
NOTA: La cantidad de agarosa utilizada para el montaje de los embriones es muy importante. Apunta a una cúpula de aproximadamente 350 μL, que debe proporcionar suficiente cobertura y dejar unos pocos milímetros de espacio por encima de los embriones. Para los principiantes, montar un número menor de embriones a la vez puede ser un enfoque más seguro.
3. Injerto de cuentas
- Una vez que la agarosa se solidifique, deposite aproximadamente 0,5 μL de perlas magnéticas en la parte superior.
NOTA: Utilice una punta de pipeta de 10 μL para transferir las perlas magnéticas. No es necesaria una medición precisa de 0,5 μL, ya que las perlas están muy concentradas en la suspensión. Simplemente insertar la punta en el vial después de girar será suficiente para recoger una cantidad adecuada de perlas. - Añade una gota de Danieau's medium que contenga un 0,02% de tricaína encima de la agarosa y las perlas.
- Seleccione la cuenta adecuada.
NOTA: Este paso es fundamental. El tamaño de las cuentas puede variar ligeramente, oscilando entre los 30 μm y los 60 μm de diámetro, por lo que es esencial seleccionar la cuenta adecuada a ojo, en función de la muestra y el tamaño del corazón. - Una vez seleccionada la cuenta adecuada, utilice unas pinzas para colocarla encima de la yema (Figura 2A y Video 1).
- Cree una lesión o "agujero" en el centro de la yema usando un brazo de las pinzas (Figura 2B y Video 2).
NOTA: La profundidad de la lesión no debe penetrar demasiado profundamente en la yema; Debe estar aproximadamente al nivel de la vena cardinal. El diámetro del orificio creado corresponderá a la punta del brazo de la pinza. Asegúrese de que la lesión se haga en la yema y evite entrar en contacto con las venas cardinales apuntando por debajo de ellas. Por lo general, saldrá una pequeña cantidad de yema cuando se cree el agujero. - Coloque la perla en la lesión creada en el paso 3.5 y empújela suavemente hacia delante hasta que llegue al polo venoso. Allí, las contracciones cardíacas crearán succión, atrayendo la perla hacia el lumen cardíaco (Figura 2 y Video 2).
NOTA: La pared venosa se rompe durante la inserción de las perlas, y la alta densidad de la yema ayuda a minimizar el sangrado extenso. La lesión de la yema generalmente se cura a los pocos minutos después de la inserción de la perla. Algunos embriones pueden presentar edema pericárdico 20-24 h después del injerto de perlas.
4. Desmontaje de embriones de pez cebra
- Después de injertar perlas magnéticas en todos los embriones montados, agregue 1-2 mL del medio de Danieau que contiene PTU en el plato con fondo de vidrio.
- Con unas pinzas, rompa suavemente la agarosa LMP y retire con cuidado los peces, asegurándose de que no quede agarosa en ellos.
- Con una pipeta Pasteur, transfiera los embriones a una nueva placa de Petri que contenga medio de Danieau con PTU y permita que se recuperen y desarrollen a 28,5 °C.
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Resultados
En la Figura 3, el Video 3 y el Video 4 se muestran ejemplos de injertos de cordón exitosos. La perla magnética se colocó correctamente dentro de la aurícula del corazón del pez cebra, lo que permitió un flujo sanguíneo sin obstrucciones y no se observó ninguna hemorragia. Además, las paredes del corazón mantuvieron su integridad estructural sin colapsar (Figura 3 y Video 3). Después de 24 h, el embrión no mostr...
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Discusión
Pasos críticos en el protocolo y solución de problemas
Montaje de embriones de pez cebra
La cantidad de agarosa utilizada para montar los embriones es importante. La cúpula formada no debe ser excesivamente grande, ya que esto puede dificultar la manipulación de la cuenta desde la superficie hasta los embriones. Por el contrario, no debe ser demasiado pequeño; Tener múltiples perlas encima ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio Vermot por las discusiones y comentarios sobre el protocolo. Agradecemos a todos los miembros del personal de las instalaciones de pescado del Imperial College London. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea: GA N°682939, Additional Ventures (número de adjudicación 1019496), MRC (MR/X019837/1) y BBSRC (BB/Y00566X/1). El CV-P fue apoyado por una Beca Departamental de Bioingeniería (Imperial College London). HF contó con el apoyo de JSPS KAKENHI (23H04726 y 24K02207), el programa JST FOREST (23719210), la Fundación Uehara Memorial, la Fundación de Investigación de Ciencias Celulares, la Fundación de Investigación Médica Takeda y la Fundación de Investigación Novartis.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales | |||
| Equipo esencial para la cría, cría y recolección | |||
| Plato con fondo de vidrio (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
| Bloque de calor | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Pinzas de joyería | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont n.º 5, L 4 1/4 pulg., aleación de acero inoxidable |
| Tubos de microcentrífuga 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| Pasteur Pipeta | |||
| Placa | de Petri | ||
| Microscopio estereoscópico | |||
| Reactivos | |||
| 4 mg/mL solución | |||
| Medio de Danieau (solución madre 60x) | |||
| PureCube Glutatión MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU (1-fenil-2-tiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure agarosa de bajo punto de fusión | Invitrogen | 16520-050 | |
| Danieau's medium (60x stock solution) | |||
| 34.8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1.6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5.8 g CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9.78 g MgCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| Disuelva los ingredientes en H2O hasta un volumen final de 2 L. Ajuste el pH a 7,2 usando NaOH, luego autoclave. | |||
| 4 mg/mL de solución madre de tricaína | |||
| 400 mg de tricaína en polvo (sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97,9 mL de H2O | |||
| 2,1 mL 1 M Tris (pH 9) | |||
| Ajuste el pH a 7, luego alícuota y almacene a -20 °C. |
Referencias
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84 (1), 4-16 (2012).
- Stainier, D. Y. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2 (1), 39-48 (2001).
- Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 13(2016).
- Hoo, J. Y., Kumari, Y., Shaikh, M. F., Hue, S. M., Goh, B. H. Zebrafish: A versatile animal model for fertility research. Biomed Res Int. 2016 (2016), 9732780(2016).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (1), R3-R9 (2002).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J. Mechanically activated piezo channels modulate outflow tract valve development through the Yap1 and Klf2-Notch signaling axis. Elife. 8, e44706(2019).
- Vignes, H., et al. Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev Cell. 57 (5), 598-609.e595 (2022).
- Steed, E., et al. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646(2016).
- Chow, R. W., et al. Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol. 20 (1), e3001505(2022).
- Fukui, H., et al. Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science. 374 (6565), 351-354 (2021).
- Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Vermot, J. Mechanical control of tissue shape: Cell-extrinsic and -intrinsic mechanisms join forces to regulate morphogenesis. Semin Cell Dev Biol. 130, 45-55 (2022).
- Juan, T., et al. Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat Commun. 14 (1), 214(2023).
- Juan, T., et al. Control of cardiac contractions using Cre-lox and degron strategies in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (3), e2309842121(2024).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J., Chow, R. Mechanotransduction in cardiovascular morphogenesis and tissue engineering. Curr Opin Genet Dev. 57, 106-116 (2019).
- Kalogirou, S., et al. Intracardiac flow dynamics regulate atrioventricular valve morphogenesis. Cardiovasc Res. 104 (1), 49-60 (2014).
- da Silva, A. R., et al. egr3 is a mechanosensitive transcription factor gene required for cardiac valve morphogenesis. Sci Adv. 10 (20), eadl0633(2024).
- Bartman, T., et al. Early myocardial function affects endocardial cushion development in zebrafish. PLoS Biol. 2 (5), E129(2004).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1760-1766 (2016).
- Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), e1000246(2009).
- Bäck, M., Gasser, T. C., Michel, J. B., Caligiuri, G. Biomechanical factors in the biology of aortic wall and aortic valve diseases. Cardiovasc Res. 99 (2), 232-241 (2013).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 53-62 (2009).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J. B., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. 144 (23), 4322-4327 (2017).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- JoVE Science Education database. Biology II: Mouse, zebrafish, and chick. Zebrafish breeding and embryo handling. JoVE. , (2023).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
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