Este protocolo describe un método para injertar una perla magnética en el corazón del pez cebra en desarrollo a través de la microcirugía, lo que permite la manipulación de fuerzas mecánicas in vivo y desencadena la afluencia de calcio dependiente del estímulo mecánico en las células endocárdicas.
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Artículo de método
Manipulación de fuerzas mecánicas en el corazón de pez cebra en desarrollo utilizando perlas magnéticas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las fuerzas mecánicas proporcionan continuamente retroalimentación a los programas morfogenéticos de las válvulas cardíacas. En el pez cebra, el desarrollo de la válvula cardíaca depende de la contracción del corazón y de los estímulos físicos generados por el corazón latiendo. La hemodinámica intracardíaca, impulsada por el flujo sanguíneo, emerge como información fundamental que da forma al desarrollo del corazón embrionario. Aquí, describimos un método efectivo para manipular fuerzas mecánicas in vivo mediante el injerto de una perla magnética de 30 μm a 60 μm de diámetro en el lumen cardíaco. La inserción de la cuenta se lleva a cabo mediante microcirugía en larvas anestesiadas sin perturbar la función cardíaca y permite la alteración artificial de las condiciones límite, modificando así las fuerzas de flujo en el sistema. Como resultado, la presencia de la perla amplifica las fuerzas mecánicas experimentadas por las células endocárdicas y puede desencadenar directamente la afluencia de calcio dependiente de estímulos mecánicos. Este enfoque facilita la investigación de las vías de mecanotransducción que gobiernan el desarrollo del corazón y puede proporcionar información sobre el papel de las fuerzas mecánicas en la morfogénesis de la válvula cardíaca.
Introducción
Desde su introducción a finales dela década de 1970, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un poderoso sistema modelo para estudiar las complejidades del desarrollo cardíaco y los trastornos cardíacos congénitos. A diferencia de la mayoría de los vertebrados, incluidos los embriones de ratón y pollo, que dependen de un sistema cardiovascular funcional y no pueden sobrevivir a los defectos cardíacos tempranos, el pez cebra proporciona una ventaja única al permitir la investigación de fenotipos cardíacos graves. Esto se debe a su pequeño tamaño, que facilita un suministro suficiente de oxígeno a....
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Protocolo
Los procedimientos para trabajar con embriones de pez cebra descritos en este protocolo se adhieren a la directiva europea 2010/63/UE y a las directrices del Ministerio del Interior en virtud de la licencia de proyecto PP6020928.
1. Obtención de embriones de pez cebra para injerto de cuentas
- Cruza la línea de pez cebra correspondiente y cultiva los embriones en el medio de Danieau a 28,5 °C. Para obtener instrucciones más detalladas sobre cómo cruzar líneas de pez cebra, consulte la Base de Datos de Educación Científica de JoVE27.
- Tratar los embr....
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Resultados
En la Figura 3, el Video 3 y el Video 4 se muestran ejemplos de injertos de cordón exitosos. La perla magnética se colocó correctamente dentro de la aurícula del corazón del pez cebra, lo que permitió un flujo sanguíneo sin obstrucciones y no se observó ninguna hemorragia. Además, las paredes del corazón mantuvieron su integridad estructural sin colapsar (Figura 3 y Video 3). Después de 24 h, el embrión no mostr.......
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Discusión
Pasos críticos en el protocolo y solución de problemas
Montaje de embriones de pez cebra
La cantidad de agarosa utilizada para montar los embriones es importante. La cúpula formada no debe ser excesivamente grande, ya que esto puede dificultar la manipulación de la cuenta desde la superficie hasta los embriones. Por el contrario, no debe ser demasiado pequeño; Tener múltiples perlas encima .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio Vermot por las discusiones y comentarios sobre el protocolo. Agradecemos a todos los miembros del personal de las instalaciones de pescado del Imperial College London. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea: GA N°682939, Additional Ventures (número de adjudicación 1019496), MRC (MR/X019837/1) y BBSRC (BB/Y00566X/1). El CV-P fue apoyado por una Beca Departamental de Bioingeniería (Imperial College London). HF contó con el apoyo de JSPS KAKENHI (23H04726 y 24K0220....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales | |||
| Equipo esencial para la cría, cría y recolección | |||
| Plato con fondo de vidrio (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
| Bloque de calor | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Pinzas de joyería | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont n.º 5, L 4 1/4 pulg., aleación de acero inoxidable |
| Tubos de microcentrífuga 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| Pasteur Pipeta | |||
| Placa | de Petri | ||
| Microscopio estereoscópico | |||
| Reactivos | |||
| 4 mg/mL solución | |||
| Medio de Danieau (solución madre 60x) | |||
| PureCube Glutatión MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU (1-fenil-2-tiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure agarosa de bajo punto de fusión | Invitrogen | 16520-050 | |
| Danieau's medium (60x stock solution) | |||
| 34.8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1.6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5.8 g CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9.78 g MgCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| Disuelva los ingredientes en H2O hasta un volumen final de 2 L. Ajuste el pH a 7,2 usando NaOH, luego autoclave. | |||
| 4 mg/mL de solución madre de tricaína | |||
| 400 mg de tricaína en polvo (sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97,9 mL de H2O | |||
| 2,1 mL 1 M Tris (pH 9) | |||
| Ajuste el pH a 7, luego alícuota y almacene a -20 °C. |
Referencias
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.....
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Reimpresiones y permisos
