Artículo de método

Evaluación de la señalización de la muerte celular por inmunofluorescencia en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico

1.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/67606

⸱

3 de enero de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los modelos in vivo de ratas son herramientas indispensables para investigar los mecanismos patológicos y las dianas terapéuticas del ictus isquémico. Este trabajo describirá la realización de tinciones de inmunofluorescencia en cortes de cerebro infartados después de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) en ratas.

Resumen

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo el mundo. La mayoría de los casos de accidente cerebrovascular son isquémicos y resultan de la oclusión de la arteria cerebral media (ACM). Los enfoques farmacológicos actuales para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico son limitados; Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevas terapias que proporcionen una neuroprotección eficaz contra la lesión isquémica después de un accidente cerebrovascular. En el tejido cerebral después de un accidente cerebrovascular isquémico, el área de la penumbra isquémica es salvable, pero corre el riesgo de progresar a un daño irreversible. El área penumbral que rodea el núcleo infartado es un objetivo conceptual para la neuroprotección. Dado que el flujo sanguíneo se mantiene parcialmente en el área penumbral, las células neuronales y no neuronales de esta área sobreviven transitoriamente después del accidente cerebrovascular, y estas células que aún son viables pueden ser rescatadas mediante intervenciones médicas adecuadas. La comprensión de la fisiopatología de la penumbra es importante en el desarrollo de terapias neuroprotectoras porque las vías de muerte celular activadas en la penumbra isquémica pueden indicar dianas terapéuticas, como RUNX1 y catepsinas. Estas dianas proteicas que funcionan como mediadoras de la muerte celular programada pueden explotarse aún más en la investigación traslacional. Con un tamaño moderado y similitud con el cerebro humano, el modelo in vivo de rata de oclusión de MCA (MCAO) imita el accidente cerebrovascular isquémico humano y ofrece una herramienta aplicable para investigar la patología penumbral, examinar la señalización de la muerte celular y evaluar los efectos de posibles objetivos en el contexto de MCAO. Aquí, describimos cómo inducir MCAO en ratas y cómo realizar la tinción de inmunofluorescencia para la detección de la señalización de muerte celular en el cerebro de rata después de MCAO.

Introducción

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo el mundo1. La elevada mortalidad y morbilidad del ictus supone una inmensa carga sanitaria pública y graves consecuencias socioeconómicas. Aunque la tasa de incidencia y mortalidad por accidente cerebrovascular se mantiene estable, el número de pacientes con accidente cerebrovascular y las muertes relacionadas con el accidente cerebrovascular están aumentando en las últimasdécadas 2,3. Los accidentes cerebrovasculares se pueden clasificar como isquémicos o hemorrágicos. La mayoría de los casos de ictus son ictus isquémicos causados por la oclusión de una arteria cerebral principal4. Hasta la fecha, el activador tisular del plasminógeno (tPA) es el único fármaco aprobado por la FDA para el accidente cerebrovascular isquémico, pero su aplicación está muy limitada por la estrecha ventana terapéutica, las complicaciones y las contraindicaciones 5,6,7. Por lo tanto, es urgente desarrollar nuevas opciones de tratamiento con una ventana terapéutica más amplia para mitigar los efectos del ictus.

Los modelos animales experimentales son herramientas útiles para estudiar la fisiopatología del ictus isquémico. En la mayoría de los pacientes humanos, el accidente cerebrovascular isquémico es causado por la obstrucción de la arteria cerebral media (ACM)8. Por lo tanto, se han desarrollado modelos de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) en roedores para parecerse al infarto cerebral humano. Si bien existen varios enfoques de MCAO que se utilizan en estudios con animales pequeños, el método más utilizado es el modelo de sutura intraluminal, que implica la inserción de un filamento de nailon en la arteria cerebral media desde las arterias carótidas externas o internas, lo que resulta en una oclusión transitoria o permanente del flujo sanguíneo 4,9. Este modelo conduce a un gran volumen de infarto cerebral y permite examinar la señalización de muerte celular en el tejido cerebral infartado con técnicas de inmunofluorescencia.

El área que rodea el núcleo infartado, denominada penumbra, es el objetivo de posibles terapias para el ictus10,11. Dado que el flujo sanguíneo en la penumbra se mantiene parcialmente, las neuronas lesionadas y las células no neuronales en esta área pueden salvarse mediante la inhibición de la activación de la señalización de muerte celular. Dirigirse a las vías de muerte celular puede ser una estrategia prometedora para la neuroprotección después del accidente cerebrovascular12. Por lo tanto, la evaluación de la señalización de la muerte celular es crucial para la investigación experimental del ictus. Recientemente, se ha demostrado que la catepsina-B, una proteasa lisosomal, desempeña un papel en la mediación de la muerte celular programada después de un accidente cerebrovascular, y ha ganado una atención sustancial en el campo neurológico13. La catepsina-B representa un objetivo potencial para la neuroprotección que amerita más investigación.

Este artículo demuestra cómo inducir MCAO utilizando el abordaje de sutura intraluminal en ratas. También mostramos cómo realizar la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazalio (TTC) para determinar el tamaño del infarto y detectar células apoptóticas mediante la tinción de marcaje de níquel (TUNEL) de desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Este protocolo y los experimentos reportados aquí fueron aprobados por el Comité de Ética Médica de la Universidad de Sichuan. El cuidado y uso de los animales se realizó de acuerdo con criterios éticos locales e internacionales.

NOTA: En este estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho adultas con un peso de 250-280 g. Las ratas se alojaron en una condición ambiental estándar (temperatura de 20-22 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 h), alimentadas con una dieta de fórmula estándar para ratas y agua de alta pureza. El procedimiento quirúrgico se realizó en condiciones estériles.

1. Modelo de rata de MCAO

  1. Inducir la anestesia inicial con isoflurano al 4% con oxígeno a 1 L/min. Controle la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el pie. Mientras se logra la anestesia, administre una pomada ocular para evitar la sequedad. Inyectar a la rata 1 mL de solución salina por vía subcutánea como reposición de volumen y 5 mg/kg de carprofeno y 0,1 mg/kg de buprenorfina para la analgesia preoperatoria. Reducir el isoflurano al 3,5% inicialmente y luego al 2% gradualmente a lo largo de la cirugía.
  2. Coloque a la rata en posición supina y mantenga la temperatura corporal entre 36,5 ± 0,1 °C sobre una estera térmica regulada con una sonda de control de temperatura rectal. Afeitar y desinfectar la piel del cuello con una solución desinfectante de yodóforo.
  3. Realice una incisión de 2 cm en la línea media del cuello y retraiga los tejidos blandos para exponer los vasos carotídeos. Use fórceps para aislar la arteria carótida común (CCA) derecha, la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ACI).
  4. Utilice suturas para ligar el CCA proximal derecho y pinzar el ACI y el ECA derechos con un microclip en su origen.
  5. Inserte un monofilamento de nailon recubierto con una punta redonda de silicona en el lumen del CCA a través de una pequeña incisión y haga un nudo en el CCA para evitar el sangrado y el desprendimiento del monofilamento de nailon.
  6. Abra el microclip ICA derecho e inserte el monofilamento de nailon en la arteria cerebral media derecha (MCA) a través del muñón ICA hasta que la punta de silicona ocluya el origen del MCA (~18-20 mm).
  7. Corta la parte expuesta del monofilamento de nailon y cierra la incisión de la línea media del cuello.
  8. Después de 2 h de oclusión de MCA, abra la incisión del cuello y desate el nudo en el CCA. A continuación, retire el monofilamento de nylon para volver a fundir el MCA. Lime el CCA distal derecho y cierre la incisión del cuello con suturas continuas o interrumpidas.
  9. En el postoperatorio, administrar buprenorfina por inyección subcutánea cada 8 h, a una dosis de 0,03 mg/kg. Observe a las ratas durante toda la recuperación de la anestesia en una jaula calentada con una estera calefactora con temperatura regulada. Para animar a comer, coloque una placa de Petri con puré de comida en la jaula. Aloje una rata por jaula después de la cirugía.
  10. Someta las ratas falsas al mismo procedimiento sin la inserción del monofilamento.
    NOTA: Se utilizan un total de 9 animales en cada grupo para la medición del tamaño del infarto (n = 3), el análisis de inmunofluorescencia (n = 3) y la detección de apoptosis (n = 3).
  11. Evaluar la función neurológica a las 2 h después de la MCAO y 22 h después de la reperfusión utilizando la escala de valoración conductual de Zea-Longa con una escala de 0 a 5 puntos14. Excluya las tarifas con una puntuación de 0 o 4.

2. Medición del tamaño del infarto (Figura 1)

  1. Sacrificar ratas bajo anestesia profunda (4% de isoflurano) mediante guillotina y aislar cuidadosamente todo el cerebro del cráneo.
  2. Congele el cerebro a -20 °C durante 20 minutos y corte el cerebro congelado en seis cortes coronales con una distancia de 2 mm entre cortes. Tiñe las rodajas de cerebro con TTC al 2% durante 15 minutos a 37 °C en la oscuridad.
  3. Fijar los trozos de cerebro con paraformaldehído al 4% durante 24 h a temperatura ambiente (RT). Fotografíe las rodajas manchadas con una cámara digital, con configuración de modo automático para objetos en primer plano.
  4. Transfiera las imágenes a una computadora y mida el tamaño del infarto con ImageJ. Presente el tamaño del infarto como la relación entre la suma del área del infarto en 6 cortes y la suma de toda el área del cerebro en los mismos cortes. Exprese los datos como media ± error estándar de la media (SEM).

3. Análisis de inmunofluorescencia en criosección cerebral (Figura 2)

  1. Inducir la anestesia con isoflurano al 4% y 1 L/min de oxígeno. Incidir la piel y el tejido subcutáneo para exponer el corazón.
  2. Retire el pericardio y haga una pequeña incisión en la aurícula derecha. Perfundir 200 mL de solución salina a través del ventrículo izquierdo, seguido de 200 mL de paraformaldehído al 4%.
  3. Abra el cráneo y extraiga el cerebro intacto.
  4. Fijar el cerebro en paraformaldehído al 4% en RT durante más de 24 h. Luego, deshidratarlo en una serie de gradientes de solución de sacarosa de concentraciones de 10%, 15% y 30% hasta que el tejido se hunda, aproximadamente 6-8 horas para cada concentración.
  5. Incruste el cerebro en el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) y elimine las burbujas de aire si las hay. A continuación, congela el cerebro en nitrógeno líquido y guárdalo en el congelador a -80 °C.
  6. Seccionar el cerebro con un criostato de 5 μm de grosor. Durante el seccionamiento, asegúrese de que la temperatura del gabinete permanezca entre -18 °C y -20 °C. Etiquete la ubicación de corte en función del sitio modelo y las condiciones experimentales. Guarde las secciones en un congelador.
  7. Deje que las secciones congeladas se equilibren en RT durante ~ 30 min para realizar la tinción de inmunofluorescencia. Luego, remoje las secciones con PBS estéril 3 veces durante 5 minutos cada una.
  8. Delinee el tejido con una pluma de inmunohistoquímica. Incubar con 20 μg/mL de proteinasa K (libre de ARNasa) y Triton X-100 al 0,3% a RT durante 10 min.
  9. Remoje las secciones con PBS estéril 3 veces durante 5 minutos cada una. Aplique BSA al 3% en el tejido delineado e incube en RT durante 1 h para el bloqueo.
  10. Después del bloqueo, retire la solución, agregue el anticuerpo primario apropiado (anticuerpo de catepsina monoclonal B recombinante de conejo, 1:200) e incube las secciones durante la noche en la oscuridad a 4 °C.
  11. Retire el anticuerpo primario y lave las secciones con PBS estéril que contenga 0.1% Tween-20 3x durante 5 minutos cada una.
  12. Añadir el anticuerpo secundario adecuado (IgG Anti-Rata de Cabra [H+L] [FITC conjugado], 1:200) con el fluoróforo requerido, e incubar las secciones en una cámara humidificada a RT durante 1 h, protegiéndolas de la luz.
  13. Después de la incubación secundaria de anticuerpos, lavar las secciones con PBS estéril que contenga 0,1% de Tween-20 3x durante 5 minutos cada una. Teñir las secciones con un medio de montaje que contenga DAPI y cubrirlas con un cubreobjetos.
  14. Capture imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia con los siguientes ajustes: longitud de onda de excitación de 488 nm, longitud de onda de emisión de 520 nm y tiempo de exposición de 500 ms. Guarde las secciones en la oscuridad a 4 °C para su conservación a largo plazo.

4. Detección de apoptosis por tinción TUNEL (Figura 3)

NOTA: Se utiliza un kit de ensayo TUNEL comercial para la tinción de TUNEL. Este kit TUNEL incluye una solución de trabajo de tampón de DNasa I, un tampón de equilibrio de desoxinucleotidil transferasa (TdT), una solución de trabajo de etiquetado y una solución de trabajo DAPI.

  1. Perfundir y aislar el cerebro utilizando el mismo procedimiento que el anterior (pasos 3.2-3.3). Sumerja el cerebro en paraformaldehído al 4% durante 3-4 h para la fijación.
  2. Cortar el cerebro en rodajas coronales de aproximadamente 2 mm de grosor, comenzando desde el extremo rostral hasta el extremo caudal, y sumergir en paraformaldehído al 4% durante 12 h adicionales. Después de la fijación, lavar las rodajas de cerebro con agua corriente durante 1 h.
  3. Sumerja los trozos de cerebro en soluciones de etanol de concentraciones de 50%, 70%, 80%, 90%, 95% y 100% secuencialmente durante 35-50 minutos cada una para la deshidratación.
  4. Trate las rodajas de cerebro con agente biológico transparente tipo TO I durante 35-50 minutos, seguido de agente aclarante II durante 35-50 minutos, hasta que el tejido esté completamente transparente.
  5. Sumerja los cortes de cerebro secuencialmente en el medio de inclusión I durante 60 minutos, el medio de inclusión II durante 60 minutos, el medio de inclusión III durante 60 minutos y el medio de inclusión IV durante 60 minutos.
  6. Coloque las rodajas de cerebro en un casete de inclusión. Selle el casete, etiquételo claramente y colóquelo en una cámara frigorífica para su solidificación.
  7. Ajuste el micrótomo a un grosor inicial de 10 μm para recortar el bloque de tejido. A continuación, ajuste el grosor a 5 μm para cortar.
  8. Caliente el baño de agua a 45 °C, haga flotar las secciones de tejido en la superficie del agua y recójalas en portaobjetos. Después de aproximadamente 30 s, retire los portaobjetos, séquelos en RT y guárdelos en una caja de secado.
  9. Desparafinar las secciones de cerebro almacenadas sumergiéndolas en un agente de limpieza durante 2 ciclos, de 10 minutos cada uno.
  10. Para rehidratar las secciones, sumérjalas en etanol anhidro durante 5 min, repitiendo 3 veces. Transfiera las secciones a etanol al 90% durante 3 min. Además, remoje las secciones en etanol al 80% durante 3 minutos. Finalmente, sumerja las secciones en etanol al 70% durante 3 min.
  11. Enjuague las muestras en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una. Elimine suavemente el exceso de humedad con papel de filtro.
  12. Administrar 100 μL de solución de trabajo de proteinasa K 1x a cada muestra e incubar a 37 °C durante 20 min. Después de la permeabilización, enjuague las muestras en PBS 3x durante 5 minutos cada una.
  13. Prepare las muestras para el control positivo.
    1. Añadir 100 μL de solución de trabajo tampón de DNasa I 1x (kit de ensayo TUNEL) a la muestra permeabilizada y dejar que se equilibre a RT durante 5 min. Retire con cuidado el exceso de líquido de la muestra con papel absorbente.
    2. Añadir 100 μL de solución de trabajo de DNasa I diluida (200 U/mL) a la muestra e incubar a 37 °C durante 10-30 min. Enjuague las muestras en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
  14. Prepare las muestras para el control negativo.
    1. Aplique 100 μL de solución de trabajo tampón de DNasa I 1x a la muestra permeabilizada y equilibre a RT durante 5 min. Incubar la muestra de control negativo con tampón de DNasa I a 37 °C durante 10-30 min, asegurándose de que no se añada ninguna enzima de DNasa I. Enjuague las muestras en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
  15. Aplique 100 μL de tampón de equilibrio de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (kit de ensayo TUNEL) a cada muestra e incube en una cámara humidificada a 37 °C durante 10-30 min. A continuación, retire el tampón de equilibrio TdT con papel absorbente.
  16. Añada 50 μl de solución de trabajo de etiquetado (kit de ensayo TUNEL) a cada muestra, luego incélelas a 37 °C en una cámara oscura humidificada durante 60 minutos. Si la intensidad de la señal es baja, considere extender el tiempo de reacción de marcado de ADN. Luego, enjuague las muestras en PBS 3x durante 5 minutos cada una.
  17. Después de secar el exceso de humedad, aplique la solución de trabajo DAPI (kit de ensayo TUNEL) e incube a RT en la oscuridad durante 5 min para contrateñir los núcleos. Luego, enjuague las muestras en PBS 4x durante 5 minutos cada una. Retire el exceso de líquido con papel absorbente y selle los portaobjetos con un medio de montaje antidecoloración.
  18. Escanee los portaobjetos teñidos con el sistema de imágenes multiespectrales Vectra Polaris y analice los datos con el software del sistema.

5. Análisis estadístico

  1. Presentar los resultados experimentales como medios ± SEM y analizar los datos con una prueba t de Student para dos comparaciones de grupos utilizando el software GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, San Diego, CA).
  2. Establezca un valor p inferior a 0,05 como diferencia estadística.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Las ratas se someten a una isquemia de 120 min durante la MCAO, seguida de una reperfusión de 22 h. La tasa de mortalidad fue mínima durante la cirugía de MCAO y se situó en torno al 25% en el periodo de reperfusión. Se observó daño cerebral significativo en el grupo MCAO, mientras que no se observó infarto en el cerebro del grupo Sham (24,87 ± 1,21% vs. 0% de la suma del área del infarto a toda el área cerebral; MCAO [n = 3] vs. Sham [n = 3], P < 0,001; Figura 1A,B).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La oclusión de una arteria cerebral conduce a la privación de oxígeno y nutrición, seguida de la activación de especies reactivas de oxígeno, sobrecarga de calcio intracelular, liberación de glutamato e inducción de respuestas inflamatorias15. Esta serie de eventos resulta en la muerte celular y daño irreversible del tejido en el cerebro infartado. La penumbra es potencialmente salvable a través de la intervención médica dentro de una ventana terapéutica apropiada...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Simiao Wu contó con el apoyo del Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan (2024YFHZ0330) y el Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan. Weihong He contó con el apoyo del Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan (2023YFS0297) y la Universidad de Sichuan. Agradecemos a Yi Zhang y Yue Li del Centro Central de Investigación del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan, por su apoyo técnico en imágenes y análisis de TUNEL.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris sistema de imágenes multiespectrales
Etanol anhidroChengdu Jinshan Chemical Reagent Co.N/A
BuprenorfinaHospital de China OccidentalN/A
CarprofenoHospital de China OccidentalN/A
Anticuerpo de catepsina-BAbcamAb214428
CriostatoLEICA LEICA CM 1950
Cámara digitalOLYMPUSTG-7
Cabra Anti-Rat IgG (H+L) (FITC conjugado)Elabscience  E-AB-1021
Suero de cabraSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 softwareN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
Pluma de inmunohistoquímicaBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
Software InForm Softwaredel sistema Akoya BiosciencesVersión 2.6.0para el sistema de imágenes multiespectrales
Solución desinfectante de yodóforoHuatian Technology Industry Co.N/A
IsofluranoRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Medio de montaje que contiene DAPISolarbioS2110
Monofilamento de nailonRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Compuesto de temperatura óptima de corte (OCT)EprediaN/A
ParaformaldehídoBiosharpN/A
Solución tampón de fosfato (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad Versión 10
Proteinasa KTiangenRT403-02
SalineKelun Co.N/A
Ratas Sprague-DawleyHuafukang Co.N/A
SacarosaBioFroxx1245GR500
Instrumentos quirúrgicosRWD Life Science Co.N/A
Agente biológico transparente tipo TO   Beijing Solarbio Ciencia & Tecnología Co., Ltd.http://www.solarbio.net/
cloruro de trifeniltetrazolio (TTC)SolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL kitElabscience  E-CK-A321
Solución de

Referencias

  1. Tsao, C. W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2023 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  3. Hankey, G. J. Stroke. Lancet. 389 (10069), 641-654 (2017).
  4. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  5. Barthels, D., Das, H. Current advances in ischemic stroke research and therapies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (4), 165260(2020).
  6. Frank, D., Zlotnik, A., Boyko, M., Gruenbaum, B. F. The development of novel drug treatments for stroke patients: A review. Int J Mol Sci. 23 (10), 5796(2022).
  7. Wang, S. -N., et al. Humanized cerebral organoids-based ischemic stroke model for discovering of potential anti-stroke agents. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (3), 513-523 (2023).
  8. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol Biochem Behav. 87 (1), 179-197 (2007).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Donnan, G. A., Baron, J. C., Ma, H., Davis, S. M. Penumbral selection of patients for trials of acute stroke therapy. Lancet Neurol. 8 (3), 261-269 (2009).
  11. Lo, E. H. A new penumbra: transitioning from injury into repair after stroke. Nat Med. 14 (5), 497-500 (2008).
  12. Datta, A., et al. Cell death pathways in ischemic stroke and targeted pharmacotherapy. Transl Stroke Res. 11 (6), 1185-1202 (2020).
  13. Gaire, B. P., Subedi, L., Teramoto, H., Hu, B. Cerebral Ischemia. , Exon Publications. Brisbane, Australia. (2021).
  14. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  15. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  16. Fisher, M. The ischemic penumbra: identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 1-6 (2004).
  17. Adams, H. P. Jr, et al. Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Circulation. 115 (20), e478-e534 (2007).
  18. Fonarow, G. C., et al. Timeliness of tissue-type plasminogen activator therapy in acute ischemic stroke: patient characteristics, hospital factors, and outcomes associated with door-to-needle times within 60 minutes. Circulation. 123 (7), 750-758 (2011).
  19. Yamori, Y., Horie, R., Handa, H., Sato, M., Fukase, M. Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke. 7 (1), 46-53 (1976).
  20. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne stroke registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  21. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
  22. Garcia, J. H., Liu, K. F., Ho, K. L. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex. Stroke. 26 (4), discussion 643 636-642 (1995).
  23. Türeyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56 (1 Suppl), discussion 196-200 196-200 (2005).
  24. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  25. Naqvi, S. A. R., et al. Biochemistry of Drug Metabolizing Enzymes. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  26. Yadati, T., Houben, T., Bitorina, A., Shiri-Sverdlov, R. The ins and outs of cathepsins: Physiological function and role in disease management. Cells. 9 (7), 1679(2020).
  27. Liu, C. L., et al. Cysteine protease cathepsins in cardiovascular disease: from basic research to clinical trials. Nat Rev Cardiol. 15 (6), 351-370 (2018).
  28. O'Toole, D., et al. Signalling pathways linking cysteine cathepsins to adverse cardiac remodelling. Cell Signal. 76, 109770(2020).
  29. Luke, C. J., et al. Lysoptosis is an evolutionarily conserved cell death pathway moderated by intracellular serpins. Commun Biol. 5 (1), 47(2022).
  30. Xie, Z., et al. Cathepsin B in programmed cell death machinery: mechanisms of execution and regulatory pathways. Cell Death Dis. 14 (4), 255(2023).
  31. Nagakannan, P., Islam, M. I., Conrad, M., Eftekharpour, E. Cathepsin B is an executioner of ferroptosis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (3), 118928(2021).
  32. Conus, S., Simon, H. U. Cathepsins: key modulators of cell death and inflammatory responses. Biochem Pharmacol. 76 (11), 1374-1382 (2008).
  33. Bhoopathi, P., et al. Cathepsin B facilitates autophagy-mediated apoptosis in SPARC overexpressed primitive neuroectodermal tumor cells. Cell Death Differ. 17 (10), 1529-1539 (2010).
  34. Ding, X., Zhang, C., Chen, H., Ren, M., Liu, X. Cathepsins trigger cell death and regulate radioresistance in glioblastoma. Cells. 11 (24), 4108(2022).
  35. He, W., et al. Inhibition of myocardial cathepsin-L release during reperfusion following myocardial infarction improves cardiac function and reduces infarct size. Cardiovasc Res. 118 (6), 1535-1547 (2022).
  36. McCarroll, C. S., et al. Runx1 deficiency protects against adverse cardiac remodeling after myocardial infarction. Circulation. 137 (1), 57-70 (2018).
  37. Song, J., et al. Age-related promoter-switch regulates Runx1 expression in adult rat hearts. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 541(2023).
  38. Riddell, A., et al. RUNX1: an emerging therapeutic target for cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 116 (8), 1410-1423 (2020).
  39. Chen, H., et al. Pharmacological inhibition of RUNX1 reduces infarct size after acute myocardial infarction in rats and underlying mechanism revealed by proteomics implicates repressed cathepsin levels. Funct Integr Genomics. 24 (3), 113(2024).
  40. Petanceska, S., Burke, S., Watson, S. J., Devi, L. Differential distribution of messenger RNAs for cathepsins B, L and S in adult rat brain: an in situ hybridization study. Neuroscience. 59 (3), 729-738 (1994).
  41. Chaitanya, G. V., Babu, P. P. Activation of calpain, cathepsin-b and caspase-3 during transient focal cerebral ischemia in rat model. Neurochem Res. 33 (11), 2178-2186 (2008).
  42. Yuan, D., Liu, C., Wu, J., Hu, B. Inactivation of NSF ATPase leads to cathepsin b release after transient cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 9 (3), 201-213 (2018).
  43. Hill, I. E., Preston, E., Monette, R., MacManus, J. P. A comparison of cathepsin B processing and distribution during neuronal death in rats following global ischemia or decapitation necrosis. Brain Res. 751 (2), 206-216 (1997).
  44. Kilinc, M., et al. Lysosomal rupture, necroapoptotic interactions and potential crosstalk between cysteine proteases in neurons shortly after focal ischemia. Neurobiol Dis. 40 (1), 293-302 (2010).
  45. Seyfried, D., et al. Cathepsin B and middle cerebral artery occlusion in the rat. J Neurosurg. 87 (5), 716-723 (1997).
  46. Saido, T. C., Yokota, M. Neurodegenerative diseases as proteolytic disorders: brain ischemia and Alzheimer's disease. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 42 (14 Suppl), 2408-2417 (1997).
  47. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsins b induces neuroprotection against secondary degeneration in ipsilateral substantia nigra after focal cortical infarction in adult male rats. Front Aging Neurosci. 10, 125(2018).
  48. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsin b alleviates secondary degeneration in ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in adult rats. J Neuropathol Exp Neurol. 75 (9), 816-826 (2016).
  49. Pluta, R., Salínska, E., Puka, M., Stafiej, A., Lazarewicz, J. W. Early changes in extracellular amino acids and calcium concentrations in rabbit hippocampus following complete 15-min cerebral ischemia. Resuscitation. 16 (3), 193-210 (1988).
  50. Hatsuta, H., et al. Tau and TDP-43 accumulation of the basal nucleus of Meynert in individuals with cerebral lobar infarcts or hemorrhage. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 49(2019).
  51. van Groen, T., Puurunen, K., Mäki, H. M., Sivenius, J., Jolkkonen, J. Transformation of diffuse beta-amyloid precursor protein and beta-amyloid deposits to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats. Stroke. 36 (7), 1551-1556 (2005).
  52. Gómez-Sintes, R., Ledesma, M. D., Boya, P. Lysosomal cell death mechanisms in aging. Ageing Res Rev. 32, 150-168 (2016).
  53. Heimer, S., Knoll, G., Schulze-Osthoff, K., Ehrenschwender, M. Raptinal bypasses BAX, BAK, and BOK for mitochondrial outer membrane permeabilization and intrinsic apoptosis. Cell Death Dis. 10 (8), 556(2019).
  54. Elena-Real, C. A., et al. Cytochrome c speeds up caspase cascade activation by blocking 14-3-3ε-dependent Apaf-1 inhibition. Cell Death Dis. 9 (3), 365(2018).
  55. Linfante, I., et al. Clinical and vascular outcome in internal carotid artery versus middle cerebral artery occlusions after intravenous tissue plasminogen activator. Stroke. 33 (8), 2066-2071 (2002).
  56. Farges, M. C., et al. Increased muscle proteolysis after local trauma mainly reflects macrophage-associated lysosomal proteolysis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282 (2), E326-E335 (2002).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Tinci n por inmunofluorescenciaModelo de accidente cerebrovascular en ratasOclusi n de la arteria cerebral mediaNeuroprotecci n de la penumbraExpresi n de la catepsina BTinci n TUNELDetecci n de apoptosisAn lisis de tejido cerebral

Artículos relacionados