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Imágenes de microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo de fenotipos heterogéneos de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus

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DOI:

10.3791/67617

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14 de febrero de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biophysics, UConn Health, 2School of Dental Medicine, UConn Health, 3Richard D. Berlin Center for Cell Analysis and Modeling, UConn Health

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este manuscrito, proporcionamos un protocolo completo para evaluar la supervivencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, transformando plásmidos en P. aeruginosa y S. aureus para crear cepas reporteras y visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, mediante microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo.

Resumen

La persistencia de antibióticos es un fenómeno en el que un pequeño número de células bacterianas de una población genéticamente susceptible sobreviven al tratamiento con antibióticos que mata a las otras células genéticamente idénticas. Los persistentes bacterianos pueden reanudar la replicación una vez que finaliza el tratamiento con antibióticos y se cree comúnmente que son la base del fracaso clínico del tratamiento. Trabajos recientes que aprovechan el poder de la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo, en la que las bacterias se marcan con reporteros transcripcionales fluorescentes, reporteros traslacionales y/o colorantes para una variedad de características celulares, ha avanzado nuestra comprensión de los persistentes de Escherichia coli más allá de lo que se podría aprender de los ensayos de supervivencia a antibióticos a nivel poblacional. Estos enfoques de una sola célula, en lugar de ensayos de poblaciones masivas, son esenciales para delinear los mecanismos de formación de persistentes, respuesta al daño y supervivencia. Sin embargo, los métodos para estudiar los persistentes en otras especies patógenas importantes a este nivel de detalle siguen siendo limitados.

Este estudio proporciona un enfoque adaptable para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de Pseudomonas aeruginosa (un bastón gramnegativo) y Staphylococcus aureus (un coco grampositivo) durante el tratamiento con antibióticos y la recuperación. Discutimos los enfoques de genética molecular para introducir reporteros fluorescentes en estas bacterias. Usando estos reporteros, así como tintes, podemos rastrear los cambios fenotípicos, las características morfológicas y los destinos de las células individuales en respuesta al tratamiento con antibióticos. Además, podemos observar los fenotipos de los persistentes individuales a medida que resucitan después del tratamiento. En general, este trabajo sirve como un recurso para aquellos interesados en rastrear la supervivencia y la expresión génica de células individuales tratadas con antibióticos, incluidas las persistentes, tanto durante como después del tratamiento, en patógenos clínicamente importantes.

Introducción

Los patógenos bacterianos pueden evadir los efectos de los antibióticos a través de dos mecanismos principales: la resistencia a los antibióticos, que implica cambios genéticos, y la tolerancia fenotípica, que implica cambios no genéticos. La resistencia a los antibióticos es un fenómeno codificado genéticamente que confiere a una célula bacteriana determinada la capacidad no solo de sobrevivir, sino también de replicarse en presencia de un antibiótico. La tolerancia fenotípica, que puede abarcar bacterias tolerantes a antibióticos o persistentes a antibióticos, ocurre cuando las células resisten el tratamiento con antibióticos bactericidas sin adquirir la capacidad de replicarse en presencia de una concentración inhibitoria del antibiótico 1,2. Lo que diferencia la tolerancia de la persistencia es que la tolerancia se refiere a la capacidad de toda la población para sobrevivir al tratamiento, mientras que la persistencia se refiere a un subconjunto de una población isogénica pero fenotípicamente heterogénea que sobrevive al tratamiento con antibióticos. Cuando un cultivo clonal se trata con antibióticos bactericidas y los supervivientes que permanecen en el cultivo se trazan en función del tiempo a escala lineal logarítmica, generalmente se detecta una curva bifásica cuando hay persistentes presentes. En estas curvas, la primera fase muestra que la mayoría de la población muere con relativa rapidez, y la segunda fase indica que una fracción persistente de antibióticos se mata a un ritmo más lento o no se mata en absoluto 1,2.

La persistencia de los antibióticos representa una carga importante para los sistemas de salud mundiales. Por ejemplo, se cree que los persistentes de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, que son el foco de este artículo, causan infecciones recalcitrantes con antibióticos, incluidas infecciones recurrentes de las vías respiratorias en pacientes con fibrosis quística e infecciones crónicas de heridas 3,4. Por lo tanto, es fundamental dilucidar aún más la biología celular persistente y los programas fenotípicos. Si bien se ha avanzado en la comprensión de cómo se forman y resucitan los persistentes, persisten brechas críticas de conocimiento relacionadas con la coordinación de la reprogramación metabólica y los eventos moleculares en las células individuales que subyacen a la persistencia 5,6,7,8.

El estudio efectivo de la persistencia ha demostrado ser un desafío técnico. Dado que la persistencia solo es observable en un pequeño subconjunto de una población bacteriana, las técnicas que muestrean poblaciones bacterianas a granel a menudo no logran capturar información biológica relevante 1,2,8,9,10. Además, dado que los cambios fenotípicos que subyacen a la persistencia son transitorios y no heredables, el seguimiento del destino de las células persistentes puede ser complejo 1,8,9,10,11. Una vez que las bacterias persistentes reanudan el crecimiento, pueden dividirse y dar lugar tanto a las persistentes como a las no persistentes, lo que hace imposible el enriquecimiento para las poblaciones persistentes puras mediante el cultivo. Estos desafíos ponen de relieve la necesidad de técnicas que puedan cumplir con los siguientes criterios: 1) la capacidad de capturar información biológica de células individuales vivas y 2) la capacidad de usarse en conjunto con tintes fluorescentes, sondas, sensores y reporteros que permitan interrogar los fenotipos de células individuales en poblaciones heterogéneas a lo largo del tiempo.

Los avances recientes en las tecnologías unicelulares han proporcionado una vía para investigar eficazmente la heterogeneidad bacteriana y superar estos obstáculos en el estudio de la persistencia12,13. Algunas de estas técnicas incluyen microscopía de fluorescencia, citometría de flujo/clasificación de células activadas por fluorescencia, microfluídica y secuenciación de ARN de una sola célula12,13. Aquí, describimos los protocolos para dilucidar la fisiología persistente de una sola célula utilizando microscopía de lapso de tiempo de epifluorescencia de cepas reporteras transcripcionales o traslacionales. La microscopía de fluorescencia es una técnica poderosa que cumple con los criterios para estudiar los fenotipos persistentes, es decir, la capacidad de identificar qué células individuales de una gran población se propagan después de la eliminación del antibiótico y, por lo tanto, pueden definirse como persistentes. Con la introducción de tecnologías de cámaras automatizadas y cámaras de incubación, la captura de células bacterianas vivas es ampliamente accesible en todo el campo de la microbiología. De manera crucial, la microscopía de lapso de tiempo ofrece la capacidad de visualizar células individuales en tiempo real, en el transcurso de horas e incluso días, lo que permite rastrear bacterias antes, durante y después del tratamiento con antibióticos 14,15,16. Los conocimientos de estas investigaciones que aprovechan la microscopía de lapso de tiempo tienen un inmenso potencial para generar información sobre los complejos mecanismos de la biología persistente.

Protocolo

1. Generación de cepas fluorescentes reporteras de  S. aureus por transformación y transducción

NOTA: Las cepas reporteras albergan una proteína fluorescente para indicar la expresión de un gen o proteína de interés. Los reporteros transcripcionales presentan una copia duplicada de la secuencia promotora nativa de un gen de interés aguas arriba de una proteína fluorescente, de modo que la fluorescencia aumenta a medida que aumenta la expresión de un gen de interés. Los reporteros traslacionales vinculan los marcos de lectura abiertos de una proteína fluorescente y una proteína de interés con un conector peptídico flexible. La visualización de cepas reporteras con microscopía de células vivas puede revelar si un determinado gen/proteína de interés está asociado con morfologías celulares específicas o destinos celulares (Figura 1, Video complementario 1 y Video complementario 2). Elija una proteína fluorescente que esté optimizada para codones para S. aureus. Si bien este estudio utiliza sGFP de pCM29 regalado por el Dr. Alexander Horswill, el Nebraska Transposon Mutant Library Genetic Toolkit contiene plásmidos que llevan sGFP, eYFP, eCFP, DsRed.T3 y eqFP650optimizados para codones 17,18.

  1. Transforma plásmidos reporteros en S. aureus RN4220.
    NOTA: La siguiente sección del protocolo fue adaptada del Taller de Fundamentos de la Genética y el Metabolismo Estafilocócico en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska19,20.
    1. Primero, prepare S. aureus electrocompetente RN4220. Prepare 200 mL de caldo B2 combinando 2 g de ácidos casamino, 5 g de extracto de levadura, 2 mL de K2HPO4 al 10%, pH 7,5, 2 mL de solución de glucosa al 50% y 5 g de NaCl. Lleve el volumen a 100 ml con agua ultrapura estéril. Mezclar brevemente a 37 °C para disolver los componentes y esterilizar con un filtro de tapa de botella (tamaño de poro de 0,22 μm).
    2. Inocular S. aureus RN4220 a partir de un caldo congelado almacenado a -80 °C en glicerol al 25% en 30 mL de caldo B2 en un matraz deflector de 250 mL e incubar durante 18 h a 30 °C, agitando a 125 rpm.
    3. Incubar dos matraces deflectores de 250 mL con 50 mL de caldo B2 cada uno a 37 °C durante la noche para precalentar el medio para el día siguiente.
    4. Al día siguiente, mida el OD600 del cultivo nocturno. Añada suficiente cultivo durante la noche a cada matraz que contenga 50 mL de caldo B2 para obtener una DEfinal de 600 de 0,25.
    5. Incubar a 37 °C, agitando a 250 rpm, hasta que el diámetro exteriorde 600 alcance 0,35-0,4.
      NOTA: Verifique el diámetro exterior600 unos 30 minutos después del subcultivo para asegurarse de que el cultivo no crezca más allá de 0,35-0,4. Si el OD600 no alcanza 0,35-0,4 dentro de 1 h después del subcultivo, abandone el procedimiento y vuelva a intentarlo al día siguiente. Lo más probable es que las bacterias crecieran demasiado de la noche a la mañana y estuvieran demasiado profundas en la fase estacionaria.
    6. Una vez que el cultivo alcance la fase de registro medio, vierta el cultivo de cada matraz en un tubo cónico estéril de 50 ml y células de pellets por centrifugación a 4.000 x g durante 10 min.
    7. Decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1 mL de agua estéril a temperatura ambiente (RT). Transfiera las células a un tubo de microcentrífuga.
    8. Centrifugar las células de nuevo a 21.000 x g durante 30 s, retirar el sobrenadante y volver a suspender en 1 mL de agua RT estéril. Repita la centrifugación, la eliminación del sobrenadante y la resuspensión en pasos de 1 ml de agua dos veces más para un total de tres lavados.
    9. Centrifugar las células, retirar el agua, luego volver a suspender las células en 1 mL de glicerol RT 10% estéril (en agua, filtrado estérilmente) y dejar en RT durante 15 min.
    10. Granular las células por centrifugación a 21.000 x g durante 30 s, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en otro 1 mL de glicerol RT 10% estéril. Estas celdas ahora son electrocompetentes.
    11. Aliquot 70 μL de celdas electrocompetentes en tubos de microcentrífuga con tapón a presión y almacenamiento a -80 °C para uso futuro.
    12. Para transformar el S. aureus RN4220 electrocompetente, descongele una alícuota de celdas en hielo. Agregue 1 μg de ADN plasmídico a las células, agite la muestra para mezclarla e incube en hielo durante 5 minutos. A continuación, electroporar las células y dejar que se recuperen en 390 μL de medio B2 durante 1-2 h a 37 °C, agitando a 225 rpm, y placar los transformantes en agar tríptico de soja selectivo.
      NOTA: La mayoría de los vectores lanzadera utilizados en este estudio cuentan con un casete de resistencia a la ampicilina para la selección en E. coli (100 μg/mL) y un casete de resistencia a cloranfenicol (10 μg/mL) o eritromicina (Erm, 10 μg/mL) para la selección en S. aureus. Muchas cepas de S. aureus que se utilizan habitualmente en el laboratorio son resistentes al Erm. Asegúrese de que una cepa de interés es compatible con el antibiótico selectivo antes de utilizar un vector lanzadera determinado. Es importante que el volumen de ADN añadido a las células se minimice (es decir, <5 μL) para evitar la formación de arcos, que se produce cuando la muestra es demasiado conductora durante la electroporación. La purificación de altas concentraciones (≥300 ng/μL) del ADN plasmídico de E. coli ayudará a mantener bajos los volúmenes.
  2. Propagar bacteriófagos en transformados S. aureus RN4220.
    NOTA: La siguiente sección de protocolo fue adaptada de los métodos de Krausz y Bose21y Olson22. Dos de los bacteriófagos más utilizados para S. aureus transducción son φ11 y 80α. El procedimiento para cosechar ambos es el mismo, excepto que obtenemos φ11 de S. aureus RN451 y 80α de S. aureus RN10359. φ11 se ha utilizado con éxito con las cepas comunes JE2 y HG003, entre otras, y se utiliza en este protocolo23,24. Sin embargo, es posible que estos fagos no transducan de manera eficiente los aislados clínicos que tienen diferentes resistencias a los fagos. Consulte las publicaciones de Krausz y Bose21 y Olson22 para un método para preparar φ11 y determinar el título de fagos.
    1. Para transducir el plásmido reportero, prepare seis placas de agar de soja tríptico (TSA) con 5 mM de CaCl2 y la concentración adecuada del antibiótico selectivo. La raya S. aureus RN4220 se transformó con el plásmido reportero en una placa TSA que contenía el antibiótico selectivo y no CaCl2 y se incubó durante la noche.
    2. Al día siguiente, encienda una incubadora o un baño de agua a 56 °C. Etiquete seis tubos de 5 mL con tapa a presión 1 x 104 a 1 x 109 y una alícuota de 40 μL de 500 mM de CaCl2 en cada tubo con tapa a presión.
    3. Derrita TSA suave (agar al 0,5%) en un microondas con la tapa aflojada para evitar la acumulación de presión y mantener la esterilidad. A continuación, alícuota 4 mL en cada uno de los tubos de tapón a presión. Invierta los tubos para mezclar, luego colóquelos en la incubadora a 56 °C para evitar que el agar blando se solidifique.
    4. Diluir el caldo de fagos a 1 x 1010 UFP/mL en caldo de soja tríptico (TSB) + 5 mM CaCl2. Añadir 100 μL de 1 x10 10 10 PFU/mL de fagos a un tubo de microcentrífuga que contenga 900 μL de TSB + 5 mM de CaCl2 para una concentración final de 1 x109 PFU/mL. A continuación, diluir en serie en tubos de microcentrífuga adicionales que contengan 900 μL de TSB + 5 mM de CaCl2 hasta una concentración de 1 x 104 PFU/mL. Etiquete cada una de las seis placas de agar antibiótico selectivo TSA + 5 mM CaCl2 + con una dilución en serie: 1 x104 a 1 x 109 PFU/mL.
    5. Resuspender el S. aureus RN4220 durante la noche que contiene el plásmido en 1 mL de TSB + 5 mM de CaCl2. Retire el tubo de tapón a presión 109 de la incubadora y agregue rápidamente 10 μL de RN4220 resuspendido que contiene el plásmido y 100 μL de dilución de fagos 1 x 109 PFU/mL, invierta para mezclar y vierta el contenido en la placa de agar TSA + 5 mM CaCl2 + antibiótico selectivo correspondiente.
    6. Realice este procedimiento para las diluciones de fagos restantes y sus respectivas placas. Deje que el agar blando se solidifique en las placas, luego incube con el agar blando boca arriba durante la noche a 37 ° C.
    7. Al día siguiente, asegúrese de que las placas (áreas de espacio libre en el césped bacteriano) sean visibles en las placas (Figura 2A). Las placas representan áreas de lisis donde los fagos han infectado con éxito RN4220, y algunos fagos habrán absorbido el plásmido de interés. Seleccione la placa con el stock de fagos menos diluido que tenga lisis casi confluente (ejemplo: 1 x 109 PFU/mL de fago), así como las placas que recibieron las dos diluciones por debajo de esta (en este caso, 1 x 108 PFU/mL y 1 x 107 PFU/mL, que deben tener lisis casi confluente).
    8. Agregue 3 mL de TSB + 5 mM CaCl2 a la menos diluida de estas placas (1 x 109 PFU/mL, para este ejemplo). Utilice un esparcidor de células estéril en forma de L para raspar suavemente la capa de agar blando del agar normal (Figura 2B). Utilice el esparcidor de células para interrumpir el agar tanto como sea posible para facilitar la liberación de fagos del agar blando.
    9. Una vez que el agar blando de la primera placa se haya interrumpido completamente, vierta suavemente el agar blando y la suspensión de caldo en la siguiente placa (en este caso, 1 x 108 PFU/mL). Raspe y rompa el agar blando en esta placa, luego vierta la suspensión resultante en la placa final y repita.
    10. Después de preparar la suspensión de agar blanda de las tres placas, vierta suavemente la suspensión en un tubo cónico de 50 ml. Pipetea suavemente para alterar aún más el agar blando, pero evita formar burbujas. No haga vórtices, ya que podría dañar el fago y disminuir el título.
    11. Centrifugar la suspensión de agar blando a 4.000 x g durante 10 min en RT. Vierta suavemente el sobrenadante en una jeringa conectada a un filtro de 0,45 μm.
      NOTA: Es fundamental verter suavemente y evitar que entren trozos de agar en el filtro. Estas piezas obstruirán el filtro y evitarán filtrar el sobrenadante restante, disminuyendo el título.
    12. Determine el título del lisado de fagos resultante utilizando RN422021 de tipo salvaje.
  3. Introducir plásmidos reporteros en cepas de interés de S. aureus por transducción.
    1. Prepare ocho placas de TSA que contengan 500 μg/mL de citrato de sodio y la concentración adecuada de antibiótico selectivo. Espolvorear densamente el recipiente deseado S. aureus colado en TSA simple e incubar durante la noche a 37 °C.
    2. Al día siguiente, frote la placa y vuelva a suspender la cepa receptora en 1 mL de TSB + 5 mM de CaCl2.
    3. Diluir el stock de fagos que transporta el plásmido reportero deseado a 1 x1010 UFP/mL.
    4. Mezclar 1,5 mL de TSB + 5 mM de CaCl2, 0,5 mL de cepa receptora resuspendida y 0,5 mL de caldo de fagos diluido en un tubo cónico de 50 mL. Incubar a 37 °C, agitando a 225 rpm, durante 20 min.
      NOTA: No se recomiendan tiempos de incubación más largos porque probablemente disminuirán la eficiencia de la transducción a medida que el fago comience a lisar las células receptoras.
    5. Inmediatamente después, añadir 1 mL de citrato sódico 0,02 M (en agua) helado y filtrado estéril al tubo cónico y centrifugar a 4.000 x g durante 10 min a 4 °C. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 1 mL de citrato de sodio 0,02 M helado.
    6. Extienda 100 μL de alícuotas en cada una de las seis placas de TSA que contengan 500 μg/mL de citrato de sodio y la concentración adecuada de antibiótico selectivo para seleccionar los transductores. Incubar durante la noche a 37 °C.
    7. Al día siguiente, raye las colonias individuales de las placas de transducción en las dos placas TSA restantes que contengan 500 μg/mL de citrato de sodio y la concentración adecuada de antibiótico selectivo. Incubar durante la noche a 37 °C.
      NOTA: Este paso de paso en placas adicionales de citrato de sodio ayuda a reducir el título de fago alrededor de las células transducidas, evitando la lisis22.
    8. Elija colonias individuales de la placa de rayas, cultive las células hasta la fase exponencial en TSB que contenga el antibiótico selectivo y almacene en glicerol al 25% a -80 °C para su uso futuro.

2. Generación de cepas fluorescentes reporteras de  P. aeruginosa por conjugación

NOTA: El traslado de un plásmido reportero a P. aeruginosa de una cepa clonada de E. coli se puede realizar mediante apareamiento triparental25. Se requiere una cepa donante de E. coli que porte el plásmido de interés (que debe contener un oriT para la transferencia conyugal), E. coli HB101 + pRK2013 - una cepa auxiliar para facilitar la conjugación (use 50 μg/mL de kanamicina para el mantenimiento del plásmido pRK2013), y la cepa receptora de P. aeruginosa que recibirá el plásmido. Para este ejemplo, el plásmido de interés tiene un marcador de resistencia a la tetraciclina (Tet), por lo que cualquier cultivo de E. coli con el plásmido necesitará 10 μg/mL de Tet, y P. aeruginosa con el plásmido necesitará 75 μg/mL de Tet para la selecciónde 26.

  1. Inocular las bacterias de las existencias congeladas almacenadas a -80 °C en glicerol al 25% en caldo de lisogénia (LB) con el antibiótico adecuado para el crecimiento durante la noche, agitando a 225 rpm a 37 °C.
  2. Al día siguiente, extienda 200 μL de cada cultivo líquido durante la noche en la placa de agar LB con el antibiótico selectivo adecuado. Dependiendo de la cantidad de apareamientos de transformación que se vayan a realizar, se esparcen más placas para las cepas auxiliares y donantes. Se recomienda una placa de ayudante/donante por transformación. Incubar las placas durante la noche a 37 °C para obtener céspedes densos de cada cepa.
  3. Al día siguiente, recoja el césped de crecimiento frotando cada superficie de la placa con un hisopo de algodón estéril y limpiándolo a lo largo del interior de un tubo de microcentrífuga. Centrifugar cada tubo brevemente (pulsar durante 5 s) para recoger las células hasta el fondo del tubo. Vuelva a suspender cada pellet de celda en 200 μL de LB.
    NOTA: Las resuspensiones deben verse muy espesas, opacas y sin grumos.
  4. En los nuevos tubos de microcentrífuga para cada apareamiento, combine 5 μL de la cepa receptora de P. aeruginosa , 160 μL de la cepa donante de E. coli que contiene el plásmido de interés y 160 μL de E. coli auxiliar HB101 + pRK2013. Mezcle suavemente, pipeteando hacia arriba y hacia abajo, luego coloque 50 μL de la mezcla en una placa de agar LB preseca. Además, coloque 20 μL de cada cepa individual en el agar LB para los controles. Deje que las manchas se sequen completamente en la placa, luego incube a 37 °C durante 3-6 h.
    NOTA: El presecado del agar LB evita que la mancha de 50 μL se extienda por la superficie y, por lo tanto, obliga a las células a interactuar dentro de un área más pequeña.
  5. Después de la incubación, deslice suavemente la punta de una pipeta por el punto de acoplamiento para transferir algunas células a un nuevo tubo de microcentrífuga. Centrifuga brevemente para recoger las células en el fondo del tubo. Vuelva a suspender en 200 μL de LB y coloque toda la resuspensión en una placa de agar LB + Irgasan (Igr; 25 μg/mL) + Tet (75 μg/mL).
    NOTA: P. aeruginosa es intrínsecamente resistente a Igrasan, y el plásmido de interés contiene el marcador de resistencia a Tet, por lo que solo P. aeruginosa transformada con éxito debería ser capaz de crecer en las placas LB + Irgasan + Tet. Dependiendo de la eficiencia de la transformación, volver a suspender y colocar todo el lugar de apareamiento puede resultar en un césped de transformadores al día siguiente. Para lograr colonias individuales, (i) resuspender todo el punto de apareamiento en un volumen mayor de LB y luego colocar una placa de 200 μL de la misma o (ii) transferir una pequeña porción del punto de acoplamiento a un tubo de microcentrífuga y luego volver a suspender en 200 μL y placa.
  6. Con los puntos de control de cada cepa individual, deslice suavemente parte de la mancha celular densa en la punta de una pipeta, transfiérala a un nuevo tubo de microcentrífuga, vuelva a suspender 200 μL de LB, luego coloque 50 μL en una placa de agar LB + Irgasan + Tet (se pueden colocar varios puntos de control en la misma placa de agar). Deja que las manchas se sequen por completo. Incubar todas las placas durante 16-20 h durante la noche a 37 °C.
    NOTA: Para los puntos de control, el objetivo es verificar que la placa antibiótica sea selectiva para los transformadores de P. aeruginosa . Si los puntos de control están demasiado concentrados cuando se detectan en las placas de agar LB + Irgasan + Tet, entonces será difícil determinar si la selección funcionó al día siguiente porque habrá un halo de células muertas que pueden confundirse con el crecimiento.
  7. Al día siguiente, confirme la selectividad antibiótica de las placas LB + Irgasan + Tet observando la falta de crecimiento celular para los puntos de control de cepas individuales.
    NOTA: Las colonias que aparecen en la placa de apareamiento triparental LB + Igrasan + Tet son transformantes de P. aeruginosa portadores del plásmido de interés.
  8. Opcional para recoger y rayar colonias en agar LB + Irgasan + Tet y crecer durante la noche para eliminar el exceso de E. coli muerta de la mezcla de apareamiento.
  9. Elija colonias individuales, crezca durante 3-6 h en líquido LB + Tet (75 μg / mL) hasta que esté visiblemente turbio, luego almacene las existencias congeladas en glicerol al 25% (500 μL de cultivo celular + 500 μL de glicerol al 50% en agua). Verifique que los clones se transformen correctamente mediante PCR de colonias seguida de secuenciación de Sanger o plásmido completo.

3. Determinación de las dosis de antibióticos para los ensayos persistentes

NOTA: Para seleccionar una dosis de un antibiótico determinado con la que tratar la población bacteriana para experimentos persistentes, primero mida la concentración inhibitoria mínima (CMI) del antibiótico frente a la cepa bacteriana de interés. Esto se puede lograr utilizando el método de microdilución de caldo, un enfoque que respalda el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), o la prueba Epsilometer (E-test), que se realiza utilizando tiras reactivas con un rango de dosis de antibióticos27. Una vez que se determine la MIC, elija al menos cinco concentraciones del antibiótico que oscilen entre 1 y 100 veces la CMI para el tratamiento celular.

  1. Inocular bacterias de existencias congeladas almacenadas a -80 °C en glicerol al 25% en 2 mL de MHB AJUSTADO POR CATIONES (CA-MHB) u otro medio rico en nutrientes. Cultive las células durante aproximadamente 4 h a 37 °C con agitación a 250 rpm antes de transferir 125 μL del cultivo a 25 mL de medio fresco químicamente definido en un matraz Erlenmeyer con deflector de 250 mL. Cultivar las bacterias durante 16 h (hasta la fase estacionaria) a 37 °C, agitando a 250 rpm.
    NOTA: Los medios de sal basal (BSM) con succinato como única fuente de carbono se utilizan normalmente para los experimentos de P. aeruginosa y los medios ricos químicamente definidos se utilizan normalmente para los experimentos de S. aureus 28,29,30,31.
  2. A la mañana siguiente, prepare 100 existencias de antibióticos (en los disolventes respectivos) para el rango deseado de concentraciones supra-MIC. Añadir 10 μL de cada dilución a los tubos de ensayo individuales.
  3. Mida el diámetro exterior600 del cultivo nocturno para confirmar la turbidez en fase estacionaria. Diluir en serie 10 μL de cultivo y colocar las diluciones en placas de agar nutritivas, como agar LB, agar CA-MHB o TSA, para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) antes del tratamiento con antibióticos.
  4. Para el tratamiento con antibióticos, dispense 1 mL de alícuotas del cultivo en los tubos de ensayo que contengan 10 μL de concentraciones de antibiótico 100x. Incubar las muestras a 37 °C, agitándolas a 250 rpm, durante un tiempo que sea suficiente para matar a los no persistentes de la población, dejando a los persistentes como las únicas células formadoras de colonias.
    NOTA: La duración del tratamiento puede variar en función del experimento y de la cepa bacteriana que se esté analizando. Por lo general, S. aureus se trata durante 5 h o 7 h y P. aeruginosa durante 7 h o 24 h. En general, se puede utilizar cualquier punto temporal de la segunda fase del ensayo de supervivencia dependiente del tiempo, ya que se espera que las células que quedan en la segunda fase sean persistentes.
  5. Después del tratamiento con antibióticos, transfiera 100 μL de células de los tubos de ensayo a tubos de microcentrífuga que contengan 900 μL de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Granular las células por centrifugación a RT a 21.000 x g durante 3 min. Retire 900 μL de sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 900 μL de PBS estéril. Repita el paso de lavado al menos una vez más para reducir los antibióticos residuales a niveles inferiores a los MIC.
  6. Diluir el cultivo en serie 10 veces (seis veces) y colocar 10 μL de cada dilución en placas de agar nutritivas. Incubar las placas a 37 °C durante la noche.
    NOTA: Utilice placas de 96 pocillos de fondo redondo sin tratar para la dilución en serie y celdas de placa en placas de agar cuadradas utilizando una pipeta multicanal.
  7. Al día siguiente, cuente las colonias en cada concentración de antibiótico. Grafique la fracción de supervivencia (UFC al final del tratamiento/UFC antes del tratamiento) frente a la concentración en una escala lineal logarítmica. Para elegir una concentración de fármaco para futuros ensayos persistentes, seleccione una concentración en la segunda fase de la curva bifásica (Figura 3).

4. Obtención de imágenes de células durante el tratamiento o la recuperación de antibióticos

  1. Prepare almohadillas de agarosa y muestras de células para la obtención de imágenes de lapso de tiempo
    NOTA: El siguiente protocolo de preparación de muestras se desarrolló como una alternativa rentable y fácil de usar a los métodos tradicionales de "sándwich" de agarosa14,16. El uso de un plato de cubreobjetos intercambiable evita la necesidad de grasa o esmalte de uñas desordenado para sellar la muestra, lo que podría limitar aún más la aireación de la muestra. La agarosa se coloca en el cubreobjetos intercambiable con el cubreobjetos ya colocado, creando superficies de agarosa planas y fiables en comparación con las preparaciones de almohadillas de agarosa a mano alzada. En general, este método ha permitido obtener imágenes de muestras con un enfoque mejorado en todo el campo de visión y durante períodos más largos debido a una humidificación estable. El método descrito aquí se utiliza para visualizar las bacterias durante el tratamiento con antibióticos (Figura 4, Video complementario 3y Video Complementario 4). Para visualizar a los pacientes persistentes a medida que resucitan y despiertan después del tratamiento con antibióticos (Figura 5, Video Complementario 5y Video Complementario 6), prepare las almohadillas de agarosa con medios de cultivo frescos en lugar de medios gastados y no agregue antibióticos a las almohadillas (excepto los agregados para el mantenimiento de plásmidos/selección de antibióticos).
    1. Coloque un cubreobjetos estéril de 30 mm (grosor #1,5) en el fondo de la base de acero inoxidable de un cubreobjetos intercambiable ("cámara"). Enrosque suavemente el inserto de policarbonato en la base de modo que el cubreobjetos de 30 mm forme la base de la cámara y séllelo en su lugar comprimiendo la junta tórica de silicona adjunta. Repita este paso para preparar un duplicado de la cámara.
      NOTA: Se recomienda que se preparen duplicados para cada experimento en caso de que la preparación de una de las cámaras no sea óptima. Se coloca un divisor personalizado impreso en 3D contra el cubreobjetos de 30 mm para evitar que las células móviles como P. aeruginosa se contaminen de forma cruzada y para proporcionar puntos de referencia para las ubicaciones de las muestras. El archivo STL para impresión 3D está disponible en el Archivo Complementario 1.
    2. Prepare agarosa al 1,5% en un tubo cónico de 50 mL utilizando el medio de su elección. Revuelva suavemente para mezclar.
      NOTA: Para la obtención de imágenes de células en fase estacionaria durante el tratamiento, se utilizan como medios base los medios gastados libres de células de un cultivo nocturno en fase estacionaria. Por lo general, el medio de agarosa se prepara como 0,105 g de agarosa en 7 mL de medio para preparar dos cámaras; cada cámara requiere 2 mL de medio de agarosa, y el exceso es útil para evitar burbujas de aire durante el pipeteo.
    3. Coloque la cónica de 50 ml en un vaso de precipitados de vidrio o en un soporte apto para microondas (asegúrese de que la tapa esté suelta). Cocine en el microondas a temperatura alta, deteniéndose cada 3-4 segundos para remover y mezclar. Haga una pausa y mezcle con frecuencia para evitar que la mezcla de agarosa burbujee.
      1. Después de ~ 1 minuto de tiempo total de calentamiento, verifique si queda algo de agarosa visible que no se haya derretido en la mezcla. Si la mezcla es uniformemente clara, deje que el medio de agarosa se enfríe brevemente a ~ 60 ° C antes de agregar cualquier medicamento o colorante adicional. Revuelva suavemente para mezclar y evitar la formación de burbujas de aire.
        NOTA: Se puede añadir yoduro de propidio (16 μM para P. aeruginosa o 1,6 μM para S. aureus) para visualizar cuándo las células pierden viabilidad.
    4. Moviéndose rápidamente para evitar que el medio de agarosa se solidifique, pipetee 2 mL del medio de agarosa en la cámara con el cubreobjetos de 30 mm. Coloque suavemente un cubreobjetos estéril de 25 mm (grosor #1,5) sobre el medio de agarosa en la abertura superior de la cámara; Esto ayuda a prevenir la deshidratación de la almohadilla de agarosa y garantiza una superficie superior plana de la agarosa para obtener imágenes óptimas de contraste de fase. Deje que la almohadilla se solidifique durante 1-2 h.
    5. Una vez que la almohadilla se haya solidificado, prepare las células que se van a obtener mediante la obtención de imágenes diluyéndolas hasta una densidad adecuada en PBS para visualizar células individuales. Aquí, las células se diluyen a OD600 0,01-0,05.
    6. En el cubreobjetos de 25 mm, utilice un rotulador permanente de punta fina para marcar las ubicaciones/identidades de cada muestra sembrada en la almohadilla. Invierta la cámara de modo que el anillo de la base de acero inoxidable quede hacia arriba y sujete con cuidado el inserto de policarbonato por debajo mientras desenrosca la base. Coloque la base de acero inoxidable a un lado. Deslice con cuidado el cubreobjetos de 30 mm fuera de la almohadilla y deséchelo.
      NOTA: Retire el cubreobjetos de 30 mm deslizándolo horizontalmente y tenga cuidado de no hacer mella en la superficie de agarosa. Además, evite trabajar sobre la superficie de agarosa expuesta: cualquier polvo que caiga sobre ella afectará la calidad de la imagen y puede contaminar potencialmente la almohadilla.
    7. Utilizando las marcas en el cubreobjetos de 25 mm como guía, localice 5 μL de las células diluidas en las ubicaciones respectivas de la almohadilla de agarosa. Agregue tres puntos de 5 μL (ajústelo según sea necesario, por ejemplo, puntos de 4 x 4 μL, etc.). Una vez que las manchas se hayan secado por completo, coloque ligeramente un nuevo cubreobjetos estéril de 30 mm centrado sobre la almohadilla.
    8. Sostenga el inserto de policarbonato con una mano y, con la otra, vuelva a enhebrar lentamente la base de acero inoxidable sobre el nuevo cubreobjetos. Enhebrar hasta que quede apretado con los dedos es suficiente para comprimir la junta tórica de silicona y sellar la cámara.
      NOTA: Tenga cuidado de no apretar demasiado: si la base de acero inoxidable comprime el cubreobjetos de 30 mm contra la superficie de la muestra y se retuerce repetidamente, las celdas pueden extenderse en un patrón radial, lo que puede causar contaminación cruzada de la muestra.
    9. Una vez sellada la cámara, observe si la agarosa está en contacto con la superficie del cubreobjetos de 30 mm; En este punto, suele haber algún contacto con la superficie, pero no completo. Utilice el extremo romo de un par de pinzas o un instrumento similar para presionar suavemente contra el cubreobjetos de 25 mm hasta que la agarosa toque el cubreobjetos de 30 mm de manera uniforme en toda la superficie.
      ATENCIÓN: Este paso podría provocar la rotura del cubreobjetos de 25 mm si se utiliza un exceso de fuerza.
    10. Una vez que la agarosa está bien presionada contra el cubreobjetos de 30 mm para que no queden grandes burbujas de aire, la almohadilla está lista para ser fotografiada.
  2. Configure el microscopio y la imagen.
    1. Preparar el microscopio y los controles ambientales de la cámara de imágenes. Ajuste la temperatura de la incubadora de etapa superior y de la incubadora de cámara grande a 37 °C y encienda el humidificador de cámara. Coloque una de las preparaciones de almohadillas de agarosa en la incubadora superior y cierre la cámara de incubación para permitir que la muestra se equilibre. La tapa humidificadora de la incubadora de la parte superior de la etapa se deja abierta en este punto para evitar la condensación en el cubreobjetos de 25 mm de la cámara.
      NOTA: La contracción/expansión de la almohadilla debido a los cambios de temperatura puede causar una desviación entre puntos de tiempo que va más allá del rango de escaneo del algoritmo de enfoque automático. Es crucial equilibrar la almohadilla de agarosa a una temperatura estable antes de la obtención de imágenes, que suele durar al menos 15 minutos. Un calentamiento suficiente también evita la condensación en el cubreobjetos superior cuando se coloca la tapa humidificadora. Los componentes de hardware del sistema de imagen fueron (Tabla de Materiales): cámara de incubación de células vivas, microscopio invertido con un objetivo Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27, motor de luz LED Spectra 7 y cámara sCMOS (tamaño de píxel de 6.5 μm). El control de los componentes motorizados del microscopio y la adquisición de imágenes se realiza mediante una aplicación de software de análisis de microscopía.
    2. Prepare el software para la adquisición de imágenes. Configure el algoritmo de enfoque automático integrado de MetaMorph (software de análisis de microscopía) para utilizar el canal de fase durante la adquisición multidimensional.
      1. En la pestaña Etapa , defina varias posiciones de etapa para cada muestra, con el objetivo de campos de visión en los que la densidad de células se distribuya uniformemente. En la pestaña Timelapse , establezca la duración y la frecuencia deseadas (intervalo de tiempo) de las imágenes que se van a tomar. En las pestañas Longitudes de onda , establezca los canales deseados para la adquisición y ajuste los tiempos de exposición para las intensidades de señal de las muestras.
        NOTA: Las imágenes de cada posición se toman cada 10 minutos durante un máximo de 24 h. Para la obtención de imágenes de fluorescencia de los colorantes/fluoróforos mencionados en este artículo, se utilizaron los siguientes ajustes de excitación del motor ligero: yoduro de propidio (Cy3; 555/15 nm) y GFP (GFP/FITC; 470/24 nm). El tiempo de exposición típico a la excitación por fluorescencia que se utiliza es de 100 ms. Se utilizan el juego de filtros 15 (Beamsplitter FT580, Emission LP590) para el yoduro de propidio y el juego de filtros 44 (Beamsplitter FT500, Emission BP 530/50) para GFP.
    3. Después de que la almohadilla de agarosa se haya calentado en la cámara, agregue la tapa humidificadora a la incubadora de escenario. Esto ayudará a evitar que la almohadilla se deshidrate y se desplace durante la toma de imágenes.
    4. Con la tapa humidificadora puesta, cambie de fase a contraste de interferencia diferencial (DIC) y ajuste el condensador y el diafragma de apertura del microscopio para una iluminación Köhler adecuada.
    5. Después de ajustar, vuelva a la fase. Desplácese a cada posición del escenario, ajuste el enfoque y restablezca la posición del escenario al nuevo plano focal. Los ajustes ya están en su lugar para comenzar a tomar imágenes.
      NOTA: Es importante volver a visitar la posición de cada etapa antes de comenzar la adquisición para asegurarse de que la almohadilla no se haya movido. Si las celdas están desenfocadas cuando se vuelven a visitar en una posición de etapa determinada, vuelva a enfocarlas y anule la posición de la etapa anterior. La configuración del algoritmo de enfoque automático utiliza la posición z focal desde el último punto de tiempo ± 3 μm como rango de búsqueda, por lo que si la almohadilla se desplaza más de 3 μm, el algoritmo no podrá enfocar correctamente.
    6. Inicie la adquisición multidimensional haciendo clic en el botón Adquirir .
    7. Una vez finalizado el experimento, compile las imágenes individuales de cada canal en una pila para verlas como vídeo o para otros análisis. Hazlo usando MetaMorph o ImageJ.
      1. Para compilar imágenes en MetaMorph (preferido), en la aplicación Review Multi Dimensional Data , seleccione los canales/longitudes de onda de interés y seleccione todos los puntos de tiempo para una posición de escenario determinada. Haga clic en Cargar imágenes. Aparecerán ventanas para cada canal/longitud de onda. Guarde cada compilación con su respectivo nombre de canal como un archivo .tiff.
      2. Para compilar en ImageJ, abra los archivos de todos los puntos de tiempo para una posición de etapa y un canal. Compilar usando imágenes para apilar.

5. Creación de videos de lapso de tiempo con Fiji/ImageJ

NOTA: Fiji (Fiji es simplemente ImageJ) es un software disponible gratuitamente para el procesamiento y análisis de imágenes que se puede descargar aquí: "https://imagej.net/software/fiji/downloads32"32. Se utilizó Fiji/ImageJ2 1.54f para los métodos de procesamiento de imágenes que se describen a continuación.

  1. Corrija el tono de la pila de imágenes del canal de fase mediante BaSiC33. Abra la pila de imágenes de fase deseada en Fiji y, a continuación, seleccione BaSiC en la pestaña Plugins . La pila corregida por sombra aparecerá en una ventana separada titulada Corrected:ImageName.
    NOTA: BaSiC.jar se puede descargar aquí: "https://github.com/marrlab/BaSiC33"33. Siga las instrucciones del desarrollador para instalar correctamente BaSiC en Fiji.
  2. Combine la pila de canales de fase con corrección de sombra con cualquier otro canal/longitud de onda utilizando Imagen > Color > Fusionar canales. Ajusta el fondo y las intensidades de la señal con Imagen > Ajusta > brillo/contraste para cada canal. Guarde el archivo combinado como un .tiff.
  3. A continuación, estabilice las imágenes utilizando Deriva 3D correcta. Con la pila corregida de sombra seleccionada, vaya a Plugins > Registros > Correct 3D Drift. En la ventana de diálogo que se abre, establezca el canal para el registro en el número de canal correspondiente a la pila de fases. La pila resultante después de la corrección se denominará puntos de tiempo registrados. Recorte al campo de visión deseado y, a continuación, guarde el archivo corregido como un .tiff.
    NOTA: Si se utilizó MetaMorph para crear la pila de imágenes compilada, entonces hay un paso de procesamiento adicional: vaya a Propiedades de la imagen > e intercambie los números en los campos Sectores (z) y Marcos (t). La corrección de deriva ahora puede interpretar correctamente cada fotograma como un punto de tiempo y no como una porción de una pila z. El archivo de .tiff con corrección de sombra y desviación se puede utilizar en análisis de imágenes posteriores. Hay muchos paquetes de software disponibles para medir las intensidades de las señales fluorescentes, cuantificar las características morfológicas, rastrear el destino de las células individuales y mucho más. Dos programas comúnmente utilizados son el plug-in MicrobeJ para Fiji y Oufti34,35.
  4. Agregue marcas de tiempo y etiquetas de texto a la pila mediante Imagen > Pilas > etiqueta.
  5. Para agregar una barra de escala, primero, conozca el tamaño de píxel de la cámara y la ampliación del objetivo del microscopio. Calcule la relación píxel:micras como el tamaño de píxel dividido por la ampliación. En el cuadro de diálogo Analizar > establecer escala , introduzca la relación píxel:micras en el campo de distancia conocida . A continuación, agregue una barra de escala a la pila con Herramientas de análisis > > barra de escala.
    NOTA: La escala precisa de un microscopio debe calibrarse utilizando un micrómetro de etapa. Sin embargo, el microscopio, el objetivo, la lente y la cámara utilizados pueden proporcionar una estimación aproximada de la escala. Por ejemplo, la cámara PCO sCMOS utilizada aquí tiene un tamaño de píxel de 6,5 x 6,5 μm2, y el objetivo de 63x se utilizó para la obtención de imágenes, por lo que el tamaño de píxel dividido por el aumento es 6,5/63 = 0,1032 μm por píxel. Introduzca 0,1032 en el campo de distancia conocida para el cuadro de diálogo Establecer escala .
  6. Para exportar la pila de imágenes terminada como un vídeo que se puede reproducir en QuickTime Player, Microsoft PowerPoint, etc., guárdelo como un archivo .avi.

Resultados

La introducción exitosa de plásmidos reporteros en P. aeruginosa y S. aureus está indicada por el crecimiento con los antibióticos selectivos correctos y puede confirmarse mediante PCR de colonias y/o secuenciación. Las cepas modificadas deben verificarse como reporteros fenotípicos sometiéndolas a condiciones en las que se sepa que el gen de interés está inducido, y la fluorescencia resultante puede medirse mediante citometría de flujo, espectrofotometría o microscopía de epifluorescencia (Figura 1).

Para facilitar la selección de una dosis o dosis de antibiótico que se utilizarán para experimentos posteriores, se deben realizar ensayos de persistencia de antibióticos dependientes de la concentración para las cepas de P. aeruginosa o S. aureus de interés. Los ensayos dependientes de la concentración suelen dar lugar a una curva bifásica con una pendiente inicial pronunciada a concentraciones de antibióticos más bajas y una meseta o pendiente menos pronunciada a concentraciones más altas. Sin embargo, para algunos pares de antibióticos-especies, es posible que no se produzca una curva bifásica distinta. Por ejemplo, la curva de elefloxacino de S. aureus des claramente bifásica (Figura 3A), pero la curva de levofloxacino de P. aeruginosa no lo es (Figura 3B)15. En este escenario, elegiríamos una concentración que sea al menos 10 veces la CMI (por ejemplo, 5 μg/mL, que es aproximadamente 15 veces la CMI para P. aeruginosa)15. Sin embargo, debido a que 15x levofloxacina MIC da como resultado solo ~0.001% en sobrevivientes de P. aeruginosa , usamos 1 μg / mL de levofloxacina si queremos ver persistencias al obtener imágenes de las células a medida que se recuperan en almohadillas de agarosa sin antibióticos (Video complementario 6); De lo contrario, el número de campos de visión necesarios para crear una imagen de varios persistentes se vuelve prohibitivo.

Al comienzo de la toma de imágenes, la preparación ideal de la muestra y la almohadilla de agarosa debe aparecer plana en todo el campo de visión, libre de grandes residuos, arrugas o burbujas de aire, y con células individuales distribuidas uniformemente. La obtención de células individuales bien distribuidas puede requerir la optimización de la dilución o resuspensión de la muestra. En el caso de S. aureus, las células tienden a formar pequeños grupos y necesitan ser sometidas a un vórtice minucioso antes de sembrarlas en la plataforma de agarosa (Figura 4 y Figura 5). En el caso de P. aeruginosa, las células pueden formar agregados encerrados en una matriz extracelular pegajosa en suspensión; Es necesario pipetear estas muestras a fondo y alterar los agregados para obtener imágenes de células individuales.

Después de la conclusión de un experimento de imagen, un lapso de tiempo exitoso de imágenes aparecerá enfocado, iluminado de manera estable y con una deriva mínima en el plano x-y durante todo el experimento. El vídeo suplementario 7 representa una adquisición óptima de la imagen: t es el canal de fase del vídeo suplementario 4 antes de la corrección de la sombra o la deriva. La pérdida de enfoque puede ocurrir si la condensación (por humidificación excesiva o calentamiento insuficiente de la muestra) hace que se formen gotas de agua en el cubreobjetos superior de 25 mm, distorsionando la luz y empujando el plano focal fuera del rango de búsqueda máximo del algoritmo de enfoque automático (Video complementario 8). La variación en la iluminación generalmente indica un aceite de inmersión insuficiente en el momento de la toma de imágenes. Si el escenario se mueve demasiado rápido, el aceite del objetivo puede arrastrarse y seguir poniéndose al día cuando se adquieren las imágenes. Esto se puede mitigar ajustando los controles de adquisición para ralentizar la velocidad del movimiento o añadiendo una pausa entre el movimiento a la siguiente posición y la adquisición de la imagen. La deriva principal de la muestra se verá como muchas células que atraviesan el campo de visión, mientras que algunas permanecen en su lugar (Video complementario 9). Esto suele ocurrir más tarde en los experimentos porque la almohadilla de agarosa se ha deshidratado debido a un control insuficiente de la humedad. La preparación de la almohadilla de agarosa presentada en este documento fue diseñada para facilitar la estabilidad de la muestra, pero es necesario calentar/humidificar adecuadamente la muestra y su entorno circundante para una adquisición óptima de la imagen.

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Figura 1: Cepas reporteras fluorescentes iluminan la expresión de un gen de interés. (A) S. aureus se transdució con un reportero transcripcional GFP para un gen de interés según el Protocolo 1. La cepa reportera se trató durante 24 h con antibiótico, se lavó con PBS y luego se sembró en una almohadilla de agarosa hecha de CA-MHB más yoduro de propidio (1,6 μM) y cloranfenicol (10 μg/mL para el mantenimiento del plásmido reportero) para obtener imágenes durante la recuperación (Video complementario 1). (B) P. aeruginosa se transformó con un plásmido portador de un reportero traduccional ligado a mScarlet para una proteína de interés26. La cepa reportera se trató durante 5 h con antibiótico, se lavó con PBS y luego se sembró en una almohadilla de agarosa hecha de BSM más Tet (75 μg/mL; para el mantenimiento del plásmido reportero) para obtener imágenes durante la recuperación (Video complementario 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Propagación y recolección de bacteriófagos. (A) Las seis placas muestran seis cantidades diferentes de stock de fagos diluidos en el césped de S. aureus RN4220. Los contornos rojos indican las tres placas que se cosecharían, desde la placa con mayor claridad (contorno rojo en negrita; 1 x109 PFU/mL) hasta las siguientes dos diluciones (1 x108 y 1 x 107 PFU/mL). Las flechas negras apuntan a placas individuales. (B) Para recolectar el fago de las placas, raspe la capa de agar blando (izquierda), transfiera la suspensión a la siguiente placa de dilución (centro) y, después de agrupar el agar blando de las tres placas, combínelo en un tubo cónico para la centrifugación (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ensayos representativos de persistencia dependientes de la concentración. Se evaluó la persistencia de fluoroquinolonas dependiente de la concentración en (A) S. aureus (frente a delafloxacino) y (B) P. aeruginosa (frente a levofloxacino) en fase estacionaria. En experimentos posteriores se utilizaron 5 μg/mL de delafloxacino (círculo rojo) porque la matanza de S. aureus se había estabilizado en esta concentración. Se utilizaría una dosis de al menos 1 μg/mL de levofloxacino (círculo rojo) para experimentos posteriores con P. aeruginosa. Nótese que la matanza bacteriana no se estabiliza para P. aeruginosa, pero todavía hay una "segunda fase" menos pronunciada de la curva bifásica que indica una subpoblación persistente. El panel 3B ha sido adaptado con permiso de Hare et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imagen de los fenotipos bacterianos durante el tratamiento con antibióticos. Las células de S. aureus y (B) P. aeruginosa en fase estacionaria se sembraron en almohadillas de agarosa que contenían antibióticos fluoroquinolonas y se monitorearon durante el tratamiento: 5 μg/mL de delafloxacino para S. aureus (Video suplementario 3) y 5 μg/mL de levofloxacino para P. aeruginosa (Video suplementario 4)15. Se añadió yoduro de propidio (PI; 16 μM para P. aeruginosa, 1,6 μM para S. aureus) a las almohadillas para marcar las células muertas o moribundas. Las células de S. aureus permanecen en gran medida intactas y vivas en presencia del FQ, mientras que la mayoría de las células de P. aeruginosa sufren cambios morfológicos drásticos, incluida la formación de esferoplastos redondos, antes de lisarse y morir. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Seguimiento de los persistentes durante la recuperación. (A) Las poblaciones de S. aureus y (B) P. aeruginosa se sembraron en almohadillas de agarosa que contenían medios frescos después de haber sido tratadas con fluoroquinolonas (5 μg/mL de delafloxacina para S. aureus y 1 μg/mL de levofloxacino para P. aeruginosa) y monitoreadas durante su recuperación posterior al tratamiento (Video Suplementario 5 y Video Suplementario 6). Las perihermanas observadas están señalizadas con flechas verdes en los dos primeros fotogramas de cada panel, y permanecieron intactas y viables durante el tratamiento antibiótico. Después de un período de retraso inicial, los persistentes comenzaron a dividirse y dieron lugar a una nueva progenie (indicada con círculos verdes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Preparación de la muestra al microscopio. (A) Esquema del flujo de trabajo de preparación de muestras utilizando un plato de cubreobjetos intercambiable ("cámara"). (B) Imagen de la cámara desmontada y sus componentes individuales. (C) Imagen de la cámara completamente ensamblada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video complementario 1: S. aureus persister. Archivo de vídeo que contiene las imágenes de la Figura 1A. En resumen, S. aureus portador de un indicador transcripcional GFP para un gen de interés fue tratado durante 24 h con antibiótico, lavado con PBS, luego sembrado en una almohadilla de agarosa hecha con CA-MHB más yoduro de propidio (1,6 μM) y cloranfenicol (10 μg/mL) para la obtención de imágenes durante la recuperación. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 2: P. aeruginosa persister. Archivo de video que contiene imágenes en la Figura 1B. En resumen, P. aeruginosa portadora de un reportero traslacional ligado a mScarlet para una proteína de interés fue tratada durante 5 h con antibiótico, lavada con PBS y luego sembrada en una almohadilla de agarosa hecha con BSM más Tet (75 μg/mL) para la obtención de imágenes durante la recuperación26. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 3: S. aureus durante el tratamiento con antibióticos. Un cultivo en fase estacionaria de S. aureus cultivado en un medio rico químicamente definido se sembró en almohadillas de agarosa hechas con los medios acondicionados libres de células del cultivo con yoduro de propidio (1,6 μM) y delafloxacino (5 μg/mL). Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 4: P. aeruginosa durante el tratamiento con antibióticos. Un cultivo en fase estacionaria de P. aeruginosa cultivado en BSM se sembró en almohadillas de agarosa hechas a partir de medios acondicionados libres de células de un cultivo de P. aeruginosa cultivado en BSM en paralelo; la almohadilla de agarosa también contenía yoduro de propidio (16 μM) y levofloxacino (5 μg/mL). Este video ha sido adaptado con permiso de Hare et al.15. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 5: S. aureus durante la recuperación post-antibiótica. S. aureus se cultivó hasta la fase estacionaria en medios ricos químicamente definidos. Los cultivos en fase estacionaria se trataron con 5 μg/mL de delafloxacino en tubos de ensayo durante 24 h, se lavaron con PBS y luego se sembraron en almohadillas de agarosa CA-MHB libres de antibióticos que contenían yoduro de propidio (1,6 μM) para la obtención de imágenes. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 6: P. aeruginosa durante la recuperación post-antibiótica. Un cultivo en fase estacionaria de P. aeruginosa cultivado en BSM se trató con 1 μg/mL de levofloxacina en tubos de ensayo durante 7 h, se lavó con PBS y luego se sembró en almohadillas de agarosa BSM libres de antibióticos que contenían yoduro de propidio (16 μM) para la obtención de imágenes. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 7: Ejemplo de adquisición óptima de imágenes. Este vídeo es el canal de fase del vídeo complementario 4 antes del procesamiento de imágenes como ejemplo de una adquisición óptima de time-lapse. Obsérvese la deriva mínima, la iluminación estable y el mantenimiento del enfoque durante todo el experimento. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo complementario 8: Ejemplo de adquisición de imágenes subóptimas debido a la condensación. Este video muestra parte de un experimento en el que la adquisición de imágenes se vio afectada por un enfoque deficiente, probablemente debido a la condensación en la cámara debido a un calentamiento inadecuado de la muestra y/o a la humidificación excesiva del entorno de imágenes. La muestra que se está analizando fue P . aeruginosa tratada con levofloxacino durante la recuperación posterior al antibiótico en una almohadilla de agarosa BSM. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario 9: Ejemplo de adquisición de imágenes subóptimas debido a la deriva. Este video muestra parte de un experimento en el que la adquisición de imágenes se vio afectada por la deriva de la muestra, probablemente debido a la deshidratación y al encogimiento/levantamiento de la almohadilla de agarosa del cubreobjetos. La muestra fotografiada fue P. aeruginosa en una almohadilla de agarosa que contenía levofloxacino y yoduro de propidio. Haga clic aquí para descargar este video.

Archivo complementario 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Hemos descubierto que el éxito de un experimento de microscopía de lapso de tiempo depende de la calidad de las almohadillas de agarosa y su estabilidad a lo largo del curso de la imagen. Las almohadillas de agarosa encerradas en una cámara de acero inoxidable son relativamente fáciles de preparar, lo que da como resultado muestras planas consistentes que se pueden obtener imágenes de manera estable durante docenas de horas. Esto permite obtener imágenes de decenas de miles de células en un solo experimento y aumenta la probabilidad de detectar variantes fenotípicas raras, como las células persistentes, en una población.

Este método de preparación de la almohadilla de agarosa presenta una alternativa fácilmente implementable a los métodos publicados anteriormente. Nuestro protocolo no requiere la precisión técnica de la fabricación de dispositivos microfluídicos ni las manipulaciones hábiles de los métodos "sándwich" de agarosa, lo que facilita el logro de preparaciones consistentes de una corrida a otra 14,16,36. Además, el sistema es rentable. La cámara de acero inoxidable es esterilizable y reutilizable (a diferencia de las cámaras de plástico de un solo uso) y la instalación no requiere equipo especializado16,37. La cámara se adapta fácilmente a diferentes sistemas de microscopía utilizando insertos de platina disponibles en el mercado. Además, debido a que las bacterias están inmovilizadas en la interfaz entre la agarosa y el vidrio de cubierta, hemos tenido éxito con el seguimiento de bacterias altamente móviles como P. aeruginosa mientras aún permitimos cambios morfológicos (Figura 4, Video complementario 4). Otras técnicas de imagen de una sola célula, como la "máquina madre", confinan las células a canales que impiden la observación de cambios morfológicos distintos de la filamentación36.

Para tener éxito con este protocolo, hay que tener en cuenta algunos pasos y parámetros críticos. Para la preparación de la almohadilla, es importante calentar y derretir completamente la agarosa, ya que los cristales de agarosa restantes causarán difracción de la luz y afectarán la calidad de la imagen. Del mismo modo, hay que tener cuidado de pipetear la agarosa en la cámara sin introducir burbujas de aire. Para garantizar que el grosor de las almohadillas de agarosa permanezca constante y limitar la deriva de la muestra, es importante permitir que la almohadilla se equilibre, generalmente durante 15 minutos, en el recinto humidificado y con temperatura controlada antes de que comiencen las imágenes. Otro factor que puede causar una mala calidad de imagen es el control de la humedad: una humedad baja hará que la almohadilla de agarosa se deshidrate y se encoja, mientras que la alta humedad (o el calentamiento inadecuado de la muestra en la cámara) podría hacer que el aire caliente se condense en la muestra y distorsione las imágenes. Un ejemplo de imágenes de lapso de tiempo subóptimas debido a la condensación se puede encontrar en el Video Suplementario 8.

Una limitación de la configuración actual es que los medios de cultivo no se pueden intercambiar, lo que impide el seguimiento continuo de las bacterias individuales antes, durante y después del tratamiento con antibióticos. Anticipamos que el acoplamiento de la almohadilla de agarosa con celdas de flujo o dispositivos microfluídicos que permitan el intercambio de medios de cultivo podría permitir el seguimiento de las poblaciones durante el cambio nutricional o ambiental. Otro parámetro del diseño actual que podría mejorarse es la aireación de la muestra. El sello de junta tórica, el diseño de tapa de rosca del plato de cubreobjetos intercambiable permite una mejor aireación de la muestra en comparación con las configuraciones que requieren el uso de sellador a base de cera o grasa para sellar las almohadillas16. Sin embargo, la aireación en la cámara sellada aún puede ser limitada y puede no soportar el crecimiento de aerobios obligados, aunque esto aún no se ha probado.

El protocolo de preparación de muestras de imágenes de lapso de tiempo que presentamos en este artículo permite rastrear miles de bacterias a medida que responden o se recuperan del tratamiento con antibióticos. Este método también es altamente generalizable y tiene una variedad de aplicaciones potenciales más allá de la biología persistente. Por ejemplo, la configuración de la almohadilla y el divisor de agarosa permite la siembra de muestras de células separadas espacialmente, pero permite la comunicación célula-célula a través de la difusión a través de la almohadilla de agarosa. Actualmente estamos explorando el potencial de esta configuración para probar cómo el intercambio de productos secretados afecta el crecimiento celular en comunidades multiespecie. Anticipamos que este protocolo proporcionará una barrera de entrada baja a la microscopía de lapso de tiempo para el nuevo investigador y variaciones ilimitadas para que el microbiólogo experimentado explore.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Sra. Susan Staurovsky del Centro de Análisis y Modelado de Células de UConn Health por su ayuda con los experimentos de microscopía. Agradecemos a la Dra. Mona Wu Orr y al Taller de Fundamentos de Genética y Metabolismo Estafilocócico por sus protocolos y consejos sobre la clonación en P. aeruginosa y S. aureus, respectivamente. Este trabajo contó con el apoyo financiero de los Institutos Nacionales de Salud (NIH; DP2GM146456-01 y 1R01AI167886-01A1 a W.W.K.M., 1F30DE032598-01A1 a P.J.H., y 1F31DK136259-01A1 a T.J.L.). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño de nuestros experimentos ni en la preparación de este manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BaSiCGitHubhttps://github.com/marrlab/BaSiC
Biología Molecular Certificada AgaroseBiorad1613101
Fiji-ImageJNIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Plato de cubreobjetos intercambiablesBioptechs190310-35ICD de 35 mm para preparar almohadillas de agarosa; viene con cubreobjetos
de 30 mm (#1.5)Motor de luz LED Lumencor Spectra 7 Motor de luz LEDLumencorhttps://lumencor.com/products/spectra-light-engineSpectra 7
MetaMorphMolecular DevicesPremier versión 7.10.5
4.2 bi Cámara sCMOSExcelitashttps://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-cameracámara sCMOS
PeCon cámara de incubación de células vivaspeConhttps://www.pecon.biz/
Thomas Scientific Cubreobjetos redondos, #1.5 de grosor, 25 mm, paquete de 100Fisher ScientificNC127277025 mm (#1.5)
Microscopio Zeiss Axiovert 200MZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.htmlMicroscopio invertido con objetivo Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27, motor de luz LED Lumencor Spectra 7 y cámara pco.edge 4.2 bi sCMOS (tamaño de píxel de 6,5 mm)
pco.edge cubreobjetos

Referencias

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