Artículo de método

Enfoques de biología estructural y química analítica para caracterizar las enzimas metabólicas de glucósidos C en la microbiota intestinal humana

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DOI:

10.3791/67629

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23 de mayo de 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Estudios recientes ponen de relieve el papel de las enzimas de la microbiota intestinal humana en el metabolismo de los glucósidos C. Aquí, presentamos una metodología integral que integra técnicas de química analítica (LC-MS/MS y RMN) con enfoques de biología estructural para caracterizar sistemáticamente las cadenas de reacción estructurales y enzimáticas de estas enzimas metabolizadoras de glucósidos C.

Resumen

La microbiota intestinal se ha convertido en un modulador clave de la salud del huésped, en particular debido a su capacidad para metabolizar los glucósidos de la dieta. Si bien los glucósidos C demuestran una estabilidad química superior y resistencia a la escisión enzimática en comparación con los glucósidos O, las bacterias intestinales especializadas pueden metabolizarlos selectivamente, mejorando su biodisponibilidad. Desde la identificación de las enzimas microbianas C-glicosidasa, los mecanismos precisos de reacción siguen sin comprenderse completamente, y las metodologías estandarizadas para estudiar estos procesos aún no están bien establecidas. Para abordar esta brecha, introdujimos un enfoque multidisciplinario integrado que combina biología estructural, enzimología y técnicas analíticas, incluida la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) y la resonancia magnética nuclear (RMN), para caracterizar sistemáticamente estas actividades enzimáticas. Este enfoque integral permite una caracterización precisa del metabolismo de los glucósidos C a nivel molecular, enzimático y metabólico.

Introducción

Recientemente, la microbiota intestinal humana ha ganado una atención considerable por su papel crucial en el apoyo a la salud del huésped 1,2. Estas comunidades microbianas metabolizan los compuestos derivados del huésped, produciendo metabolitos biológicamente activos 1,2,3. Por ejemplo, los flavonoides, entre los compuestos naturales más abundantes en nuestra dieta diaria, existen principalmente como glucósidos O o C, que a su vez se absorben mal en el intestinohumano. Sin embargo, la microbiota intestinal puede transformar estos glucósidos en derivados más bioactivos, como glucósidos secundarios o agliconas, reduciendo su solubilidad y mejorando su absorción, mejorando así sus bioactividades en comparación con sus formas nativas 5,6.

Históricamente, los mecanismos de hidrólisis de los O-glucósidos han sido ampliamente estudiados 7,8. Los C-glucósidos, caracterizados por sus enlaces glucosídicos C-C, presentan mayor estabilidad química y resistencia a la escisión 9,10. A pesar de esto, ciertas bacterias intestinales han desarrollado la capacidad de desglicosilar los C-glucósidos11,12. En 1988, Hattori et al. demostraron por primera vez que algunas bacterias intestinales podían eliminar los grupos glicosil de los glucósidos C 13. Estudios posteriores aislaron la primera cepa bacteriana capaz de esta actividad, lo que permitió una mayor exploración de los mecanismos de escisión de los glucósidos C 14. Hasta la fecha, sin embargo, solo se ha identificado y caracterizado un número limitado de cepas bacterianas intestinales y enzimas metabolizadoras de glucósidos C 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Estudios recientes han demostrado que las enzimas de desglicosilación de puerarina (daidzeína-8-C-glucósido) (DgpA/B/C) en la cepa PUE son capaces de escindir la puerarina en daidzeína y glucosa a través de un proceso de dos pasos: DgpA, una oxidorreductasa de la familia Gfo/Idh/MocA, oxida la puerarina a 3''-oxo-puerarina, que luego se somete a una reacción de eliminación β mediada por el complejo DgpB/C para producir la aglicona y la glucosa 10, Artículo 26. Sin embargo, las características estructurales y funcionales de las enzimas metabolizadoras de glucósidos C, en particular el sistema DgpA/B/C, siguen sin comprenderse completamente, y se necesitan metodologías más avanzadas, en particular la integración de estrategias biológicas y químicas, para avanzar en la investigación en este campo24.

Para abordar esta brecha, empleamos enfoques multidisciplinarios integrados para investigar la reacción metabólica catalizada por C-glucósidos DgpA/B/C de la microbiota intestinal humana. En esta reacción, DgpA cataliza la oxidación glicosil de los glucósidos C, posteriormente, DgpB y DgpC forman un complejo DgpB/C que escinde específicamente los productos de C-glucósidos oxidados 10,26,27. Primero realizamos la expresión recombinante y la purificación de DgpA y DgpB/C por separado. A continuación, se cristalizaron las proteínas DgpA y DgpB/C purificadas, y sus estructuras tridimensionales se determinaron mediante cristalografía de rayos X. Finalmente, reconstituimos la función de escisión de los glucósidos C utilizando el sistema enzimático completo DgpA/B/C, con un análisis exhaustivo del producto metabólico realizado mediante espectroscopía acoplada de LC-MS/MS y RMN27. Sobre la base de estos enfoques, hemos estudiado el metabolismo de los glucósidos C catalizado por el sistema enzimático DgpA/B/C.

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Protocolo

1. Producción y purificación de proteínas

  1. Construcción de vector de expresión
    NOTA: En este estudio, los genes DgpA, DgpB y DgpC de la microbiota intestinal humana, cepa PUE , sirven como sistema modelo. El primer paso consiste en utilizar plásmidos de expresión para producir las proteínas recombinantes correspondientes.
    1. Obtenga la secuencia del grupo de genes DgpA/B/C (GenBank: LC422372.1) del NCBI. A continuación, sintetizar comercialmente el ADN DgpA/B/C y clonar individualmente los genes DgpA, DgpB y DgpC en un vector pET-28a modificado, que producirá la proteína diana con la etiqueta N-terminal SUMO y 6×His (etiqueta His-SUMO)28.
    2. Transforma cada uno de los plásmidos DgpA, DgpB o DgpC en células competentes para E. coli BL21 (DE3). Posteriormente, se cultivaron bacterias en medio LB con 50 μg/mL de kanamicina a 37 °C.
    3. Añadir 0,2 mM de IPTG al medio cuando la densidad bacteriana (OD600) alcance 0,6. Cultivar las bacterias a 16 °C durante 16 h.
    4. Centrifugar cada uno de los cultivos bacterianos que expresan DgpA, DgpB y DgpC a 4.000 x g durante 20 min a 4 °C. Vuelva a suspender el pellet celular en 20 mL de tampón A (Tabla 1) por cada 1 L de cultivo bacteriano.
  2. Purificación de proteínas
    NOTA: Las cantidades suficientes y de alta pureza de enzimas recombinantes son esenciales para la caracterización funcional y los estudios de biología estructural. DgpB y DgpC forman un complejo proteico estable (forman espontáneamente el complejo DgpB/C durante el procedimiento de lisis) para su funcionalidad10,26. A continuación, se realiza la purificación de la proteína DgpA y el complejo DgpB/C.
    1. Añadir 1 mM de PMSF a la resuspensión bacteriana. Mezcle la suspensión bacteriana DgpB y DgpC del paso 1.1.4 y luego lise la suspensión bacteriana DgpA o la mezcla DgpB y DgpC (para formar un complejo funcional DgpB/C) utilizando un disruptor celular ultrasónico.
    2. Centrifugar el lisado bacteriano a 48.000 x g durante 40 min a 4 °C. Conserve el sobrenadante que contiene la proteína y deseche el gránulo bacteriano.
    3. Purifique el complejo DgpA o DgpB/C del sobrenadante utilizando una columna de cromatografía de afinidad de níquel (Ni-NTA). Eluir las proteínas unidas aplicando un gradiente de concentración de imidazol de 0 a 50% con tampón A y tampón B (Tabla 1) en el purificador ÄKTA.
    4. Tome 10 μL de muestras eluidas y mézclelas con 2 μL de colorante proteico de 5 ×, luego realice la electroforesis SDS-PAGE a 220 V durante 45 min utilizando un sistema de electroforesis vertical, seguido de la tinción con azul de Coomassie para visualizar las bandas de proteínas. Recoja fracciones que contengan DgpA o el complejo DgpB/C en función del análisis SDS-PAGE para su uso futuro.
      NOTA: La banda DgpA (44 kDa) con una etiqueta His-SUMO (17 kDa) migra alrededor de 61 kDa (Figura 2D), mientras que DgpC (33 kDa) con una etiqueta His-SUMO (17 kDa) migra alrededor de 50 kDa, y DgpB (15 kDa) con una etiqueta His-SUMO (17 kDa) migra alrededor de 33 kDa (Figura 2J).
    5. Diálisis las muestras del complejo DgpA o DgpB/C del paso 1.2.3 utilizando una membrana de diálisis de corte de peso molecular de 10 kDa contra el tampón C para eliminar el imidazol y con proteasa similar a la ubiquitina 1 (ULP1; Tabla de Materiales) enzima para eliminar la etiqueta His-SUMO29.
    6. Cargue la muestra de proteína dializada en el tampón C (Tabla 1) a través de la columna de cromatografía de intercambio iónico (columna Q). A continuación, eluir la proteína unida de la columna utilizando un gradiente de concentración de cloruro de sodio que oscila entre 100 mM y 600 mM, preparado con tampón C y tampón D (Tabla 1) en el purificador ÄKTA.
    7. Realice el análisis SDS-PAGE del complejo DgpA y DgpB/C eluido de la columna Q como el paso 1.2.3, anotando los pesos moleculares: etiqueta His-SUMO (17 kDa), DgpA (44 kDa), bandas oligoméricas de DgpA (por encima de 95 kDa) (Figura 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), bandas oligoméricas de DgpB y DgpC (entre 53 kDa y 95 kDa) (Figura 2K).
    8. Purifique la proteína utilizando una columna de exclusión de tamaño (SEC) con tampón E (Tabla 1). Realice el análisis SDS-PAGE utilizando proteínas de la fracción de elución, seguido de la tinción con azul de Coomassie para visualizar las bandas de proteínas. Recoger las fracciones que contienen la proteína diana DgpA o el complejo DgpB/C después del análisis por SDS-PAGE.
      NOTA: La banda de DgpA se observa en torno a los 44 kDa con la banda de DgpA oligomerizada por encima de 95 kDa (Figura 2F), mientras que la DgpC se encuentra en torno a los 33 kDa, y la DgpB se sitúa en torno a los 15 kDa con DgpB y DgpC oligomerizados (entre 53 kDa y 95 kDa) (Figura 2L).
    9. Mida la concentración de proteínas del complejo DgpA o DgpB/C utilizando una nanogota a 280 nm. A continuación, concentre el complejo DgpA o DgpB/C a unos 20 mg/mL con tubos de ultrafiltración, alículos y congélelos rápidamente con nitrógeno líquido. Almacene el complejo DgpA o DgpB/C a -80 °C para su uso futuro.
  3. Recopilación de datos de espectro de dicroísmo circular (CD)
    NOTA: Dado que la oxidación de glicosilo catalizada por DgpA sirve como el paso de iniciación crucial en la ruta metabólica, la espectroscopia CD se empleó específicamente para verificar tanto el estado de plegamiento adecuado como la integridad estructural secundaria de DgpA. Estos parámetros estructurales son de vital importancia tanto para la actividad enzimática como para el éxito de la cristalización de proteínas.
    1. Diluir la proteína DgpA a 0,2 mg/mL con 1 x tampón PBS (pH 7,4) (Tabla 1).
    2. Cargue 1x tampón PBS (pH 7,4) en una cubeta de cuarzo y registre el espectro de CD de referencia a más de 200 - 260 nm utilizando un espectrómetro de CD para detectar con sensibilidad la estructura secundaria y las diferencias de estado de plegamiento27.
    3. Reemplace la cubeta tampón con muestras de proteínas de 1.3.1, registre el espectro CD en 200 - 260 nm y reste la línea de base del tampón para obtener el espectro CD para la muestra de proteína.
    4. Recopile tres escaneos para verificar la precisión y analice los datos de las características de la estructura secundaria y el estado de plegamiento de las proteínas (Figura 3G, 3H).

2. Cristalografía de proteínas y determinación de la estructura

NOTA: Después de confirmar que DgpA mantuvo un plegamiento adecuado y una integridad estructural, se emplearon enfoques de biología estructural para determinar las estructuras tridimensionales de ambas DgpA. Dado que la competencia catalítica del complejo DgpB/C había sido confirmada bioquímicamente a través de ensayos funcionales previos 10,26,27, se omitió el paso de verificación espectral CD.

  1. Crecimiento y optimización de cristales de proteínas
    1. Mezcle 0,5 μL de DgpA purificado (20 mg/mL) o complejo DgpB/C (20 mg/mL) con un volumen igual (0,5 μL) de solución de depósito de kits de cristalización en placas de cristal de 48 pocillos en un método de gota sentada30. Transfiera las placas de cristal a 16 °C para el crecimiento de cristales.
      NOTA: Observe estas gotas sentadas con un microscopio para identificar las condiciones (incluida la concentración de proteínas y precipitantes, como PEG 3350, formiato de magnesio, etc.) para el crecimiento de cristales complejos DgpA o DgpB/C.
    2. Realice la optimización de la cristalización tanto para DgpA como para el complejo DgpB/C utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante30.
    3. Para DgpA, comience con la condición identificada en el paso 2.1.1 (20 mM de formiato de magnesio, 20% PEG3350) y aplique un enfoque de optimización ortogonal probando seis gradientes de concentración de PEG3350 (17%, 18%, 19%, 20%, 21% y 22%) contra cuatro gradientes de concentración de formiato de magnesio (16 mM, 18 mM, 20 mM y 22 mM)30.
    4. Prepare las gotas de cristalización mezclando 0,8 μL de solución de proteína DgpA (10 o 20 mg/mL) con 0,8 μL de solución de depósito en cubreobjetos de vidrio silanizado. A continuación, invierta los cubreobjetos sobre placas de cristalización de 24 pocillos e incube a 16 °C para el crecimiento de cristales.
    5. Para la optimización del complejo DgpB/C, siga el mismo enfoque: mezcle 0,8 μL de complejo proteico (10 o 20 mg/mL) con 0,8 μL de solución de depósito que contenga acetato de magnesio (16, 18, 20 o 22 mM) y PEG 8000 (8%, 9%, 10%, 11%, 12% o 13%). Del mismo modo, coloque gotas colgantes en cubreobjetos silanizados sobre placas de 24 pocillos e incube a 16 ° C.
    6. Deje que los cristales de proteínas del complejo DgpA y DgpB/C crezcan hasta alcanzar su tamaño completo hasta que dejen de crecer, y luego transfiera los cristales a una solución de remojo que contenga tampón de depósito y 5 mM de los compuestos sustrato (glucosa y puerarina) del complejo DgpA y DgpB/C a 16 °C durante 30 min.
    7. Transfiera los cristales, incluidos los DgpA (sin glucosa o sin sustrato) y el complejo DgpB/C (sin sustrato), a una solución crioprotectora que contenga la condición de tampón de remojo suplementada con un 25% de glicerol y almacene inmediatamente en nitrógeno líquido para la recopilación de datos.
      NOTA: Aunque tanto los cristales de DgpA como los del complejo DgpB/C se empaparon con sustratos (glucosa y puerarina), solo la glucosa se incorporó con éxito al centro catalítico de DgpA. En consecuencia, se obtuvieron tres formas cristalinas distintas para el análisis estructural: DgpA con glucosa (Figura 3E); DgpA sin sustrato (Figura 3B-C); y complejo DgpB/C sin sustrato (Figura 3D). La solución crioprotectora protege los cristales de proteínas al evitar la formación de hielo durante el enfriamiento instantáneo en nitrógeno líquido, preservando así su integridad estructural y minimizando el daño inducido por la radiación. Por lo general, formulada utilizando el licor madre como base, la solución se complementa con concentraciones optimizadas de crioprotectores (por ejemplo, glicerol o etilenglicol).
  2. Recopilación de datos y determinación de la estructura
    1. Recopile los datos de difracción de rayos X del cristal para DgpA con glucosa o en formas libres de sustrato, y el complejo DgpB/C en forma libre de sustrato en la Instalación de Radiación Sincrotrón de Shanghái (SSRF) de la Instalación Nacional de Ciencia de Proteínas de Shanghái (NFPS) con una longitud de onda incidente de 0,978 Å.
    2. Procesar los tres conjuntos de datos de difracción de rayos X, incluidos el complejo DgpA y el complejo DgpB/C, utilizando un software de procesamiento de datos cristalográficos31. Primero, cargue los datos sin procesar y, a continuación, ejecute secuencialmente las funciones de indexación, integración y escala haciendo clic en los botones correspondientes del software. Genere un archivo de salida procesado (output.sca) adecuado para la determinación posterior de la estructura.
    3. Determine las estructuras de DgpA con glucosa o en formas libres de sustrato (Figura 3B-C, 3E), y del complejo DgpB/C en libre de sustrato (Figura 3D) utilizando el método de reemplazo molecular (Tabla de Materiales). Y luego refinar las estructuras y los mapas electrónicos incorporando ligandos relevantes (como glucosa, Mn2+, H2O, etc.)Artículo 31.

3. Monitorización de la actividad de reacción y determinación de los parámetros cinéticos

NOTA: El sistema DgpA/B/C media las transformaciones de los glucósidos C a través de una cascada definida de dos pasos: DgpA inicia la catálisis oxidando la fracción de azúcar, generando un intermediario que el complejo DgpB/C posteriormente escinde o isomeriza 10,26,27. En este estudio, DgpA/B/C se refiere a las enzimas responsables de esta cascada de reacción, mientras que cabe destacar que no se produce una interacción directa entre DgpA y el complejo DgpB/C. Esta actividad acoplada puede cuantificarse rigurosamente utilizando tres enfoques complementarios: análisis de productos por HPLC, ensayos espectrofotométricos acoplados a DCPIP que monitorean la transferencia de electrones o caracterización cinética detallada de los parámetros de reacción27,32. En concreto, se analizaron los productos de escisión de glucósidos C (daidzeína) generados por catálisis DgpA/B/C mediante HPLC (detección UV a 265 nm). La formación del producto se cuantificó utilizando una curva de calibración estándar (el método para establecer la curva estándar se describe en detalle en la nota del Paso 3.3.2.), y los parámetros cinéticos se determinaron ajustando las tasas de formación del producto al modelo de Michaelis-Menten mediante un análisis de regresión no lineal27,32. El ensayo de inhibición que midió el efecto de la glucosa sobre la ruptura del enlace puerarina C-glicosídico proporcionó evidencia corroboradora de que los sacáridos pueden servir como sustratos para la DgpA. Posteriormente, el ensayo DCPIP monitorea las reacciones de oxidación del azúcar midiendo la reducción del 2,6-diclorofenolidofenol de color azul (DCPIP) a leuco-DCPIP incoloro, ya que acepta electrones de azúcares oxidados33, reflejando así la actividad catalítica de DgpA.

  1. Monitorización de la actividad de DgpA/B/C por HPLC
    1. Llevar a cabo la reacción de escisión o isomerización de C-glucósido catalizada por DgpA/B/C en 500 μL de tampón F (Tabla 1) que contiene 20 μM de DgpA y complejo DgpB/C (del paso 1.2.7), y 0,1 mM de: puerarina o genisteína-8-C-glucósido para las reacciones de escisión, o daidzina o genistina para las reacciones de isomerización27. Llevar a cabo las reacciones a 37 °C durante 8 h y finalizarlas añadiendo 1,5 mL de metanol a la mezcla de reacción.
    2. Centrifugar la solución de reacción a 16.000 × g durante 15 minutos para eliminar el precipitado de proteína formado debido a la desnaturalización enzimática inducida por el metanol. Filtre el sobrenadante con una membrana filtrante de 0,22 μm.
    3. Realice análisis de HPLC con elución en gradiente, a un caudal de 1 mL/min con un volumen de inyección de 10 μL y una longitud de onda de detección de UV 265 nm.
      NOTA: Las fases móviles fueron acetonitrilo (Fase Móvil A) y ácido acético acuoso al 0,1% (Fase Móvil B), con elución en gradiente. El gradiente de la elución de la fase móvil es el siguiente: 5%-20% A a 0-5 min, 20%-45% A a 5-15 min, 45%-52% A a 15-18 min, 52%-55% A a 18-19 min, 55%-5% A a 19-21 min y 5% A a 21-23 min. El sistema enzimático DgpA/B/C exhibe eficiencias catalíticas marcadamente diferentes hacia sustratos como la daidzina y la genistina, lo que resulta en variaciones sustanciales en sus respectivas tasas de formación de productos. Para evaluar cuantitativamente la cinética de conversión del sustrato y la dinámica de acumulación del producto, se realizó un análisis exhaustivo del curso del tiempo utilizando HPLC a intervalos de 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 y 48 h.
  2. Monitorización de la actividad de DgpA con ensayo de 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP)
    NOTA: El ensayo DCPIP monitorea la oxidación del azúcar midiendo la reducción del DCPIP azul a leuco-DCPIP incoloro, ya que acepta electrones de azúcares oxidados33. Aquí, se utilizó el ensayo indicador DCIPIP para registrar la actividad de oxidación de DgpA hacia diferentes compuestos glicosilados, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos. Se utilizaron DgpA de tipo salvaje y sus mutantes defectuosos de unión a azúcares, incluidos D182A, Δ(308-316) y Δ(311-316)27.
    1. Incubar 0,8 mM de DCPIP, 50 μM de proteína, incluyendo DgpA de tipo salvaje y sus tres mutantes defectuosos de unión a azúcares (DgpA D182A, DgpA Δ(308-316) o DgpA Δ(311-316)), con sustratos de 10 mM que incluyen puerarina, vitexina, genistina, almidón soluble, maltotriosa, lactosa, sacarosa, glucosa o maltosa en 1x tampón PBS (pH 7,4).
    2. Después de 20 h de reacción, registre el cambio de absorbancia de DCPIP a 600 nm utilizando un lector de microplacas33.
  3. Determinación de la tasa de inhibición de la glucosa en la reacción de ruptura del enlace C-glicosídico de la puerarina
    NOTA: La DgpA pertenece a la familia de las enzimas oxidorreductasas de azúcar, capaces de oxidar la fracción de azúcar de los glucósidos C. La Figura 3E demuestra que la glucosa está unida al centro catalítico de DgpA, y el protocolo para determinar la estructura de DgpA se detalla en el paso 2.2.3. Para examinar la unión competitiva de DgpA entre la glucosa y el glucósido C puerarina, se llevaron a cabo los siguientes experimentos.
    1. Llevar a cabo la reacción en 1 × tampón PBS (pH 7,4). Agregue diferentes concentraciones de glucosa (1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM y 100 mM) al sistema de reacción de escisión de C-glucósido (puerarina) como se describe en el paso 3.1. Realice la reacción a 37 °C durante 12 h.
    2. Realizar un análisis cuantitativo del producto (daidzeína) utilizando la curva de calibración de HPLC para el compuesto de referencia (daidzeína estándar). Calcule la tasa de inhibición determinando primero la diferencia en el rendimiento del producto entre las reacciones que contienen concentraciones variables de glucosa y las reacciones de escisión de C-glucósidos no inhibidos (sin glucosa), y luego dividiendo esta diferencia por el rendimiento del producto de la reacción no inhibida.
      NOTA: Para generar una curva de calibración para el análisis cuantitativo de HPLC, prepare una dilución en serie de un patrón de referencia (por ejemplo, puerarina o daidzeína) en un rango de concentración (por ejemplo, 0,1-1 mM, en incrementos de 0,1 mM). Analice cada concentración por HPLC, registre las áreas de los picos y compárelas con las concentraciones estándar correspondientes. Realice un análisis de regresión lineal (y = mx + b, donde y = área de pico, x = concentración) para establecer la curva estándar. La ecuación de regresión se puede utilizar para interpolar concentraciones de muestras desconocidas de sus áreas de pico medidas.
  4. Determinación de parámetros cinéticos
    NOTA: Los parámetros cinéticos son ampliamente reconocidos como estándares de oro críticos para evaluar cuantitativamente la eficiencia catalítica enzimática. Para evaluar cuantitativamente las reacciones catalizadas por DgpA/B/C, se determinaron los parámetros cinéticos de las reacciones de escisión de puerarina de glucósidos C catalizadas por DgpA/B/C.
    1. Prepare gradientes de concentración de glucósidos C (puerarina) del sustrato (que van de 0,01 a 4 mM en incrementos de 2 veces) para la reacción de escisión de glucósidos C catalizados por DgpA/B/C.
    2. Llevar a cabo la reacción a 37 °C durante 8 h según el método descrito en el paso 3.1. Realizar un análisis cuantitativo del producto (daidzeína) utilizando la curva de calibración de HPLC de la daidzeína estándar. A continuación, calcule la velocidad de reacción (tasa de formación del producto) dividiendo la cantidad cuantificada por el tiempo de reacción.
    3. Determine los parámetros cinéticos Km y kcat ajustando la velocidad de reacción calculada y la concentración de sustrato al modelo de Michaelis-Menten utilizando software estadístico (Tabla de Materiales).

4. Preparación y detección del producto intermedio de reacción

NOTA: Más allá de la actividad de escisión de los glucósidos C, DgpA/B/C también cataliza la isomerización de los O-glucósidos a los glucósidos C. Por lo tanto , cuando se utilizan O-glucósidos como sustratos para DgpA/B/C, los productos intermedios se producirán como los C-glucósidos isomerizados. Para caracterizar el producto intermedio (puerarina), el compuesto intermedio se purificó y posteriormente se analizó utilizando herramientas de química analítica, incluyendo espectroscopía LC-MS/MS y RMN.

  1. Preparación del producto intermedio de reacción en la reacción de isomerización de C-glucósido catalizada por DgpA/B/C 27
    1. Prepare la reacción de isomerización de O- a C-glucósido catalizada por DgpA/B/C utilizando 0,2 mM de O-glucósido (daidzina) como sustratos y 20 μM de complejo DgpA y DgpB/C en un volumen de reacción de 90 mL, siguiendo el protocolo descrito en el paso 3.1 anterior.
    2. Purifique el producto intermedio C-glucósido (puerarina) utilizando una HPLC preparatoria en la estrategia de elución en gradiente (NOTA).
      NOTA: Las fases móviles fueron acetonitrilo (Fase Móvil A) y ácido acético acuoso al 0,1% (Fase Móvil B), con elución en gradiente. El gradiente de la elución de la fase móvil es el siguiente: 5%-20% A a 0-5 min, 20%-45% A a 5-15 min, 45%-52% A a 15-18 min, 52%-55% A a 18-19 min, 55%-5% A a 19-21 min y 5% A a 21-23 min.
    3. Calcule la concentración del producto intermedio purificado utilizando la curva de HPLC de calibración estándar en el paso 3.3.2, obtenga aproximadamente 6 mg de puerarin el sistema de reacción de 90 mL en el paso 4.1.1 y luego seque los productos intermedios purificados con un concentrador centrífugo al vacío para uso futuro.
  2. Caracterización del producto intermedio de reacción con LC-MS/MS
    1. Recoja los productos intermedios secos del paso 4.1.3. Pesar 100 μg de los intermedios derivados de la daidzina, luego disolverlo en 2 mL de metanol para lograr una concentración final de 50 μg/mL. Centrifugar a 13.500 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante para el análisis LC-MS/MS.
    2. Utilice el mismo programa de elución en gradiente de HPLC en el paso 4.1.2 para el análisis LC-MS/MS con un volumen de inyección de 5 μL.
  3. Caracterización del producto intermedio de reacción con RMN
    1. Disuelva 4 mg de los productos intermedios purificados de la reacción de daidzina en 340 μL de dimetilsulfóxido-d 6 para espectroscopia de RMN de 1H y 13C. Ajuste los parámetros del instrumento de la siguiente manera: temperatura a 298 K, calza 3 veces, ancho de pulso 18 μs, retardo de relajación 1,5 s, 48 escaneos, con otros parámetros en la configuración predeterminada27.
    2. Recoja los espectros de RMN 1H y 13C utilizando un instrumento de RMN de 600 MHz.

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Resultados

Siguiendo los procedimientos descritos en Figura 1, primero expresamos los genes DgpA, DgpB y DgpC en E. coli Celdas BL21(DE3). Dado que DgpB y DgpC forman un complejo enzimático estable (complejo DgpB/C)10,26,27,34, las células que expresan estas dos proteínas se combinaron para la copurificación. Después de la lisis celul...

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Discusión

En la actualidad, las características estructurales y funcionales de las enzimas del metabolismo de los glucósidos C en el campo siguen sin estar claras y faltan métodos de investigación apropiados 10,24,26. Al aprovechar las ventajas significativas de la química y la biotecnología combinadas 40,41,42,43,44,45, el estudio propone una metodología de investigación que utiliza la...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este estudio está financiado con el programa de fondos de inicio de la Universidad de Medicina China de Beijing (BUCM) (90011451310011) para W.M., el programa de fondos de emergencia contra COVID-19 en BUCM (1000061223476) para W.M., el equipo de innovación y el programa de cultivo de talentos de la administración nacional de medicina tradicional china (ZYYCXTD-C-202006) para W.M. y el proyecto de investigación independiente para estudiantes de posgrado en BUCM (ZJKT2023012) para H.P. Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Wenfu Ma por su útil discusión.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2,6-dicloroinndofenol (DCPIP)Solarbio Ciencia y TecnologíaD6350
2-Mercaptoetanol(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 × Tinte de carga de proteínasSangon BiotechC508320
Ácido acéticoShanghai MACKLINA111247
AcetonitriloThermo Fisher Scientific™? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz Espectrómetro de RMNBrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
Centrífuga 5424REppendorf022620601
Chirascan™ plus CD espectrómetroFotofísica AplicadaChirascan™  
DaidzeinShanghái Yuanye BiotecnologíaB20227
DaidzinShanghái Yuanye BiotecnologíaB20226
Dithiothreitol (DTT)Solarbio Ciencia y TecnologíaD8220
E. coli BL21 (DE3) células competentesThermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
Genisteínade Shanghái Yuanye BiotecnologíaS31565
Genisteína-8-C-glucósidode Shanghái Yuanye BiotecnologíaBP2095
GenistinShanghái Yuanye BiotecnologíaS31591
GlucosaSigma-AldrichG8270
GraphPad Prisma 9SoftwareGraphPad¿Versión? Prisma 9Calcule los parámetros cinéticos Km y kcat
HiLoad Superdex 200 pg columnas SEC preparativasCytiva28989335
HisTrap HP Su etiqueta columnas de purificación de proteínasCytiva17524802
HiTrap Q FF columna de cromatografía de intercambio aniónicoCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  versión 723
Columna de HPLC TC-C18(2), 170Å, 5 µ m, 4,6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LactosaSigma-Aldrich17814
LC-20AT, cromatografía líquida de alta resoluciónShimadzuLC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713 Cloruro
de manganeso ShanghaiYuanye Bio-TechnologyS31112
MetanolThermo Fisher Scientific™? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Ciencia y TecnologíaN8110
Microscopio estereoscópico Olympus SZX12OLYMPUS SZX7
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)Sigma-AldrichP7626 
PhenixEl equipo de desarrollo de Phenix1.21.2Phenix es un paquete de software completo para la determinación de la estructura cristalina de proteínas, que incorpora los métodos SAD (dispersión anómala de longitud de onda única) y MR (reemplazo molecular) con el software Phaser.
Cromatógrafo líquido preparativo de alto rendimientoWaters2545/2998
Kit de cribado de cristal de proteínasHampton ResearchHR2-110 / HR2-112 / HR2-144 / HR2-126 / HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
Incubadora de agitaciónShanghai Zhichu Instrument Co., Ltd  ZQZY-AF8
Piel de serpiente&comercio; Membrana de diálisis, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
Almidón solubleSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Centrífuga SuperspeedThermo Fisher Scientific™
Lector de microplacas multimodo SpectraMax i3xDISPOSITIVOS MOLECULARESSpectraMax i3x 
Espectrofotómetro de microvolumen SpectraMax QuickDrop EspecificacionesDISPOSITIVOS MOLECULARESQuickDrop
SacarosaSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Columna de preparaciónAguas 186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Proteasa similar a la ubiquitina 1Thermo Fisher Scientific™? Invitrogen12588018
congelador de ultra baja temperaturaThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Concentrador centrífugo al vacíoBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
75006590

Referencias

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