Preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico

Samantha Siska; Cara Sake; Keith B. Neeves; Nanette Boyle

doi:10.3791/67639

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico

1.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/67639

⸱

10 de enero de 2025

Samantha Siska¹ , Cara Sake¹ , Keith B. Neeves²^,³ , Nanette Boyle¹^,⁴

¹Depeartment of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, ²Department of Bioengineering, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, ³Department of Pediatrics, Section of Hematology, Oncology, and Bone Marrow Transplant, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, ⁴Quantitative Biosciences and Engineering, Colorado School of Mines

En este artículo

Resumen

El metabolismo de las plaquetas es de interés, particularmente en lo que se refiere al papel de la hiperactividad e hipoactividad plaquetaria en el sangrado y los trastornos trombóticos. El aislamiento de las plaquetas del plasma es necesario para algunos ensayos metabólicos; Aquí se presenta un método para aislar metabolitos intracelulares de plaquetas lavadas.

Resumen

Las plaquetas son células sanguíneas que desempeñan un papel integral en la hemostasia y la respuesta inmunitaria innata. La hiperactividad e hipoactividad plaquetaria se han implicado en trastornos metabólicos, aumentando el riesgo de trombosis y hemorragia. La activación de las plaquetas y el metabolismo están estrechamente vinculados, con numerosos métodos para medir el primero, pero relativamente pocos para el segundo. Para estudiar el metabolismo de las plaquetas sin la interferencia de otras células sanguíneas y componentes del plasma, las plaquetas deben aislarse, un proceso que no es trivial debido a la sensibilidad al cizallamiento de las plaquetas y su capacidad de activarse irreversiblemente. Se presenta aquí un protocolo para el aislamiento de plaquetas (lavado) que produce plaquetas quiescentes que son sensibles a la estimulación por agonistas plaquetarios. Se utilizan pasos sucesivos de centrifugación con la adición de inhibidores de plaquetas para aislar las plaquetas de la sangre total y resuspenderlas en un tampón isosmótico controlado. Este método produce de forma reproducible una recuperación del 30%-40% de las plaquetas de la sangre total con baja activación, medida por los marcadores de secreción de gránulos y actividad de integrinas. El recuento de plaquetas y la concentración de combustible se pueden controlar con precisión para permitir al usuario sondear una variedad de situaciones metabólicas.

Introducción

Las plaquetas son células anucleadas pequeñas (2-4 μm de diámetro) que desempeñan un papel importante en la hemostasia, el proceso estrechamente regulado^{de formación de} coágulos. Si bien son vitales para la integridad vascular, las plaquetas también están implicadas en eventos adversos para la salud. Las plaquetas están involucradas en la trombosis venosa profunda (TVP) y la trombosis arterial (TA), que son coágulos que ocluyen los vasos sanguíneos, lo que provoca una disminución del suministro de sangre a nivel local o, si partes del coágulo se desprenden (embolizan), pueden bloquear el suministro de sangre a ....