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Artículo de método

Evaluación de la fagocitosis microglial de restos de mielina in vitro bajo estimulación magnética repetida

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DOI:

10.3791/67642

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17 de junio de 2025

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1Department of Rehabilitation Medicine, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, 2Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Children's Rehabilitation, Linyi People's Hospital, 4Department of Endocrinology, People's Hospital of Dongxihu District, 5Department of Rehabilitation, Hengyang Medical School, The First Affiliated Hospital, University of South China

En este artículo

Resumen

El presente protocolo ha sido diseñado para evaluar el efecto de la estimulación magnética repetitiva sobre la capacidad de la microglía para fagocitar los restos de mielina. Para ello, se ha establecido un sistema de cocultivo in vitro de microglía y restos de mielina.

Resumen

La microglía, los fagocitos residentes del sistema nervioso central (SNC), desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad y la homeostasis del SNC al eliminar las células dañadas, los desechos celulares y los restos de mielina. La acumulación de restos de mielina está implicada en una serie de trastornos del SNC, como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer, las lesiones cerebrales traumáticas y las lesiones de la médula espinal. La presencia de restos de mielina no solo exacerba la neuroinflamación, sino que también obstaculiza el potencial regenerativo de la mielina. Por lo tanto, mejorar la capacidad de la microglía para eliminar los restos de mielina a través de la fagocitosis representa una estrategia terapéutica prometedora. La estimulación magnética se ha convertido en una modalidad de tratamiento innovadora para las enfermedades del SNC, con cada vez más pruebas que sugieren su potencial para promover la fagocitosis microglial y apoyar la recuperación del SNC. Para dilucidar aún más los efectos de la estimulación magnética en la eliminación microglial de los restos de mielina, diseñamos un experimento in vitro que involucró el cocultivo de restos de microglía y mielina. El cocultivo se sometió a estimulación magnética repetitiva para evaluar su impacto sobre la actividad fagocítica microglial en el contexto de la patología del SNC.

Introducción

La mielina es una estructura de membrana tubular estable que rodea los axones producida por los oligodendrocitos en el sistema nervioso central (SNC). Esta vaina de mielina desempeña un papel fundamental en la facilitación de la propagación rápida y eficiente de los potenciales de acción1. Sin embargo, varios trastornos neurológicos, como la esclerosis múltiple (EM), los accidentes cerebrovasculares y las lesiones traumáticas, como las lesiones de la médula espinal (SCI) y las lesiones cerebrales traumáticas (TBI), pueden provocar la pérdida de la integridad de la mielina. Esto da lugar a la generación de residuos de mielina debido a la ruptura de la vaina de mielina y al daño directo a las estructuras de mielina 2,3,4. La acumulación de restos de mielina no solo impide la remielinización y la recuperación funcional, sino que también exacerba la neuroinflamación 5,6. Por lo tanto, la eliminación efectiva de los restos de mielina es esencial para resolver la neuroinflamación, promover la regeneración axonal y restaurar la homeostasis en el sistema nervioso después de enfermedades neurológicas.

Los restos de mielina son eliminados principalmente por los fagocitos, como los macrófagos y la microglía en el sistema nervioso central (SNC). La microglía, las células inmunitarias residentes del SNC, examinan constantemente su entorno en busca de posibles amenazas y protegen el SNC eliminando la mielina dañada y los restos de mielina. Además, la fagocitosis microglial desempeña un papel crucial en la promoción de la neurogénesis a través de la eliminación de residuos 7,8. Cada vez hay más pruebas que sugieren que el aumento de la fagocitosis microglial de los restos de mielina puede mitigar los efectos nocivos de la inflamación, reducir el daño del SNC y promover la regeneración axonal después de una lesión nerviosa. 4,9,10.

La terapia de estimulación magnética, una técnica de neuromodulación no invasiva, ha ganado un uso generalizado en el tratamiento de diversos trastornos neurológicos11. En particular, la estimulación magnética transcraneal repetida (EMTr) se ha mostrado prometedora como enfoque terapéutico para la enfermedad de Alzheimer (EA), la lesión cerebral y el accidente cerebrovascular 12,13,14. Un estudio reciente ha demostrado que la EMTr puede mejorar la fagocitosis microglial de la beta amiloide (Aβ) y la apolipoproteína E (ApoE), inhibiendo así la progresión patológica de la EA en modelos animales15. De manera similar, nuestro trabajo reciente encontró que la estimulación magnética transespinal repetida (rTSMS) promueve la fagocitosis microglial de los restos de mielina después de una lesión de la médula espinal en ratas16.

Sin embargo, el impacto de la estimulación magnética repetitiva sobre la microglía ha sido corroborado predominantemente a través de modelos experimentales en animales 17,18,19. De hecho, se ha demostrado que la estimulación magnética modula la excitabilidad neuronal a través de la inducción de corrientes20. En consecuencia, no se puede descartar que la interacción entre las neuronas y la microglía puede influir en la función de la microglía. En consecuencia, es necesaria la experimentación in vitro para determinar si el impacto de la estimulación magnética sobre la microglía es independiente de la alteración de la excitabilidad neuronal. Estudios recientes han identificado un efecto modulador de la estimulación magnética repetitiva sobre la microglía en modelos experimentales. Algunos estudios demostraron que la estimulación magnética repetitiva podría promover la polarización de la microglía hacia M219,21. Sin embargo, aún no se ha podido dilucidar la exploración de su función microglía. En particular, Amelie Eichler et al. intervinieron en cortes de tejido cerebral in vitro utilizando estimulación magnética de 10 Hz y encontraron que la estimulación magnética de 10 Hz era capaz de promover la liberación de citocinas de la microglía para influir en la excitabilidad y plasticidad neuronal22. Si bien este estudio amplió la comprensión de los efectos de la estimulación magnética en la microglía, se necesita más investigación a nivel celular para dilucidar completamente sus mecanismos.

Así, establecimos un protocolo para comprobar si la estimulación magnética puede promover la fagocitosis de los restos de mielina in vitro. A diferencia de los restos de mielina después de una enfermedad o daño tisular, que es producto de una lesión, los restos de mielina utilizados en este experimento tienen la forma de la vaina de mielina después de que se descompone. Además, el concepto de restos de mielina es un producto de la desintegración de la mielina. Como las principales células fagocíticas del cerebro, la microglía desempeña un papel fundamental en la eliminación de las células dañadas y los restos de mielina23, que se asocia con enfermedades como la esclerosis múltiple y el Alzheimer24,25. Se ha demostrado que la acumulación de restos de mielina exacerba la neuroinflamación y dificulta la regeneración26. El objetivo del estudio es investigar el potencial de la estimulación magnética para mejorar la fagocitosis microglial de los restos de mielina, reduciendo así la neuroinflamación y apoyando la recuperación del SNC en enfermedades neurodegenerativas y traumáticas. En resumen, el estudio emplea un enfoque de cocultivo, en el que las microglías se cocultivan con restos de mielina y se realiza una estimulación magnética repetida para verificar el efecto de la estimulación magnética repetitiva en la capacidad fagocítica de la microglía.

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Protocolo

Aquí, se utilizaron tres ratas hembras SD (de 2-3 semanas de edad) para extraer los restos de mielina mediante centrifugación en gradiente de sacarosa. Todas las ratas se compraron en el Animal Core Facility de la Universidad Médica de Nanjing, Nanjing, China (Licencia de animales: SYXK (Su) 2021-0023). Todas las ratas se criaron en condiciones de control (temperatura de 22 ± 2 °C, un período de luz/oscuridad de 12 h/12 h, 55% ± 5% de humedad relativa). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Nanjing (No. IACUC-1903031 y No. IACUC-2005001) y tenían como objetivo minimizar el sufrimiento y el número de animales utilizados.

1. Aislamiento de mielina

NOTA: Los restos de mielina se extrajeron como se describió anteriormente, y se realizaron algunas modificaciones27. Asegúrese de que todos los pasos se hayan realizado a 4 °C y en condiciones estériles.

  1. Aislamiento de mielina bruta
    1. Extracción de tejido cerebral
      1. Después de la anestesia con pentobarbital (50 mg/kg, inyección intraperitoneal), evaluar la profundidad de la anestesia mediante la respuesta de pinzamiento de los dedos del pie. Decapita a las ratas hembras. Diseccionar toda la cabeza en hielo y dividir el cráneo con unas tijeras para exponer completamente el cerebro y facilitar la extracción del cerebro completo.
      2. Extirpe las membranas, el cerebelo y el hipocampo con tijeras y fórceps de manera meticulosa y aséptica para evitar la contaminación de la mezcla de sacarosa del tejido cerebral. Limpie el cerebro 3 veces con PBS para eliminar cualquier residuo de sangre o tejido.
      3. Transfiera los cerebros limpios a 10 mL de solución estéril de sacarosa 0,32 M y corte el tejido cerebral con las tijeras microquirúrgicas entrozos de 5 mm 3 para obtener una mezcla de sacarosa de tejido cerebral.
    2. Homogeneización del tejido cerebral
      1. Transfiera la mezcla de sacarosa del tejido cerebral a un homogeneizador estéril de 50 mL y agregue 30 mL de solución estéril de sacarosa 0,32 M. Utilice un homogeneizador de vidrio de 50 mL para homogeneizar durante 2 min para obtener un homogeneizado de tejido cerebral liso.
      2. Diluir el homogeneizado de tejido cerebral a 90 mL con una solución estéril de sacarosa 0,32 M, mezclar y dispensar lentamente en la parte superior de seis tubos ultracentrífugos estériles de polipropileno de pared delgada de 38,5 mL que contienen 20 mL de solución estéril de sacarosa 0,83 M. Añadir 15 mL de homogeneizado a cada tubo de centrífuga y nivelar con una solución estéril de sacarosa 0,32 M.
    3. Recolección de restos de mielina cruda
      1. Enfriar previamente un rotor de ultracentrífuga a 4 °C y centrifugar la muestra a 75.000 x g durante 45 min. Después del proceso de centrifugación, recoja los restos de mielina de la interfaz entre las dos densidades de sacarosa utilizando un tubo de Pasteur estéril.
        NOTA: Es imperativo durante el proceso de recolección tener precaución y evitar recolectar inadvertidamente otros componentes de la muestra contaminada.
  2. Primera separación y purificación isotónica
    1. Transfiera la solución de residuos de mielina recolectada a un tubo de centrífuga de 50 mL y ajuste el volumen a 35 mL con tampón salino estéril tamponado con fosfato (PBS) preenfriado. Transfiera la solución a un nuevo homogeneizador estéril de 50 mL y homogeneice durante 2 min para obtener un homogeneizado.
    2. Distribuya el homogeneizado de los restos de mielina de manera uniforme en seis tubos de ultracentrífuga de polipropileno estéril de pared delgada de 38,5 mL, agregando tampón PBS estéril. Someter los tubos a centrifugación a 75.000 x g durante 45 min a 4 °C.
  3. Segunda separación y purificación isotónica
    1. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet blanco sólido en 10 mL de tampón PBS estéril preenfriado para obtener una suspensión de restos de mielina. Distribuya la suspensión uniformemente en dos tubos ultracentrífugos estériles de polipropileno de pared delgada de 38,5 mL, con el volumen equilibrado mediante la adición de tampón PBS estéril.
    2. Centrifugar las muestras a 4 °C a 75.000 x g durante 45 min.
  4. Colección de mielina purificada
    1. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo blanco sólido en 6 ml de tampón PBS estéril. Divida la suspensión de restos de mielina en seis tubos de centrífuga de 1,5 mL y luego sométala a centrifugación a 4 °C y 12.000 x g durante 10 min.
    2. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la pelletización blanca sólida en 100 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) preenfriada.
  5. Cuantificación de residuos de mielina
    1. Tome 3 μL de la suspensión de restos de mielina para cuantificar el contenido de proteínas utilizando un kit de cuantificación de proteínas BCA. Almacene la suspensión de restos de mielina restante a -80 °C.

2. Marcaje fluorescente de restos de mielina

  1. Incubación del éster N-succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína
    1. Descongele los restos de mielina necesarios a 4 °C o agua helada y centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los restos de mielina en 200 μL de solución de éster de N-succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE; 50 μM).
    2. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. Después del período de incubación, centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    3. Deseche el sobrenadante y lave las muestras 3 veces con 500 μL de tampón PBS estéril. Después del proceso de lavado, vuelva a suspender los restos de mielina en 100 μL de tampón PBS estéril preenfriado para obtener una suspensión de residuos de mielina marcados con fluorescencia, que se puede almacenar a -80 °C.

3. Cultivo de microglía

  1. Cultivo de células BV-2 en CO2 humidificado al 5% a 37 °C en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con FBS al 10% (v/v), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 U/mL). Siembre casi el 50 % de las células Bv-2 en la placa de 12 pocillos y la placa de 24 pocillos para realizar más pruebas.

4. Estimulación magnética repetida in vitro

  1. Realizar la intervención de estimulación magnética repetida in vitro con el siguiente ajuste: frecuencia de tratamiento de 20 Hz, intensidad de tratamiento del 1% de la intensidad máxima de salida (es decir, 0,035 Tesla), tiempo de estimulación de 5 s, período de descanso de 20 s. Administrar 600 pulsos con un tiempo de tratamiento único de 2,5 min.
  2. Durante la estimulación magnética, coloque el centro de la bobina alineado con el centro de la placa de cultivo y asegúrese de que la bobina encaje perfectamente en la parte inferior de la placa de cultivo.
    1. Predetermine los parámetros de estimulación magnética y fije la dirección de la bobina de estimulación magnética para que sea perpendicular al suelo y esté orientada hacia arriba. Esterilice la bobina de estimulación magnética con alcohol para evitar la contaminación de las células.
    2. A continuación, recupere la placa de cultivo celular de la incubadora y colóquela sobre la bobina de estimulación magnética para la estimulación magnética. Esterilice la placa rociándola con alcohol y luego devuélvala a la incubadora. Mantenga el plato cubierto durante todo el proceso.

5. Pruebas de fagocitosis microglial de restos de mielina

  1. Tratamiento de estimulación magnética repetida para el grupo LPS+rMS
    1. Utilice CFSE (50 μM) para marcar los restos de mielina y evaluar la fagocitosis. Placa 1 x 104 celdas BV-2 en placas de 24 pocillos durante la noche. Cambie el medio a medio sin suero y trate las células con lipopolisacárido (LPS; 1 μg/mL) durante 12 h. Aspire suavemente el medio antiguo con una pipeta y, a continuación, añada el nuevo medio sin suero inmediatamente con la pipeta.
    2. Después de un período de 12 h de intervención con LPS, agregue los restos de mielina (100 μg / mL) al medio para el cocultivo en condiciones de oscuridad. Someta las células a intervenciones repetidas de estimulación magnética como se describe en el paso 4.2.
  2. Inmunofluorescencia e imagen
    1. Lave suavemente los restos de mielina no adsorbida con PBS y fije las células con PFA al 4% durante 15 min. Bloquear las células con PBS que contengan un 10% de albúmina sérica de burro y un 0,3% de Triton X-100 durante 1 h a temperatura ambiente, luego lavar con PBS e incubar con anticuerpo primario (IBA-1, 1:200) a 4 °C durante la noche.
    2. Incubar las células con anticuerpos secundarios (1:300, ratón) durante 2 h a temperatura ambiente. Capture imágenes con un microscopio confocal a 40x y 20x.

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Resultados

En este estudio, inicialmente alimentamos células de microglía BV-2 in vitro extrayendo restos de mielina derivados del cerebro y utilizando estimulación magnética repetitiva para mejorar su capacidad fagocítica. Posteriormente, las células de microglía BV-2 se cultivaron y se sometieron a una intervención de LPS antes de la estimulación magnética, emulando así el estado in vivo de la microglía bajo una rigurosa validación neurológica. Posteriormente, se aplicó la intervención de rMS tras la estimulació...

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Discusión

La estimulación magnética repetitiva (EMr) es una técnica de neuroestimulación no invasiva que se ha aplicado ampliamente en el tratamiento de diversos trastornos neurológicos y psiquiátricos, como las deficiencias cognitivas, la enfermedad de Alzheimer (EA), el accidente cerebrovascular, las lesiones cerebrales y las lesiones de la médula espinal (LME). La esclerosis múltiple utiliza un campo magnético pulsado para modular el potencial de membrana de las neuronas, influyendo selectivame...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82302877, 82172541), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Hunan (2023JJ30549).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio de montaje antidecoloración con DAPIBeyotime, ChinaP0131
BCA KitThermoFisher Scientific, América23227
Bv-2 célulaATCCCBP60922
Placas de cultivo celular de 12 pocillosBiofil, China
Cultivo celular Placas de 24 pocillosBiofil, China
Escaneo láser confocal MicroscopioZeiss, Alemania800
Incubadora de temperatura constanteThermoFisher Scientific, América
CFSEMedChemExpress, AméricaHY-158820
DMEM-Medio de cultivoKeyGen, ChinaKGL1202-500
FBSGibco, América16250078
Iba1Abcam, Américaab48004
Aparato de estimulación magnéticaYiruide, ChinaCCY-IA
Bobina de estimulación magnéticaYiruide, China
ParaformaldehídoBioSharp, China
PBSKeyGen, ChinaKGL2210-500
Penicilina-EstreptomicinaGibco, América15140-122
SacarosaMedChemExpress, AméricaHY-B1779
TripsinaKeyGen, ChinaKGL2107-100
UltracentrífugaBeckman, AméricaL-100XP

Referencias

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