Este estudio describe un protocolo para generar monocapas 2D de organoides porcinos derivados del intestino delgado y grueso. El crecimiento de estas monocapas se caracteriza por el aumento de los valores de TEER, lo que indica una sólida integridad epitelial. Además, estas monocapas exhiben respuestas secretoras fisiológicas en experimentos en cámara de Ussing después de la aplicación de forskolina.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo
En este artículo
Resumen
Resumen
El tracto gastrointestinal (TGI) sirve tanto en la digestión de los alimentos como en la absorción de nutrientes, pero también como barrera protectora contra los patógenos. Tradicionalmente, la investigación en esta área se ha basado en experimentos con animales, pero existe una creciente demanda de métodos alternativos que se adhieran a los principios de las 3R: reemplazar, reducir y refinar. Los organoides porcinos se han convertido en una herramienta prometedora, ya que ofrecen una replicación in vitro más precisa de las condiciones in vivo que los modelos celulares tradicionales. Uno de los principales desafíos con los organoides intestinales es su superficie apical orientada hacia adentro y su superficie basolateral orientada hacia afuera. Esta limitación se puede superar mediante la creación de capas de organoides bidimensionales (2D) en insertos transpocillos (en adelante, denominados insertos), proporcionando acceso a ambas superficies. En este estudio, desarrollamos con éxito cultivos bidimensionales de yeyuno porcino y organoides de colon. El proceso de cultivo implica dos fases clave: en primer lugar, la formación de una monocapa celular, seguida de la diferenciación de las células mediante medios personalizados. El crecimiento celular se rastrea midiendo la resistencia eléctrica transepitelial, que se estabiliza en el día 8 para los organoides del colon y en el día 16 para los organoides del yeyuno. Después de una fase de diferenciación de 2 días, el epitelio está listo para el análisis. Para cuantificar y rastrear los procesos activos de transporte electrogénico, como la secreción de cloruro, empleamos la técnica de la cámara de Ussing. Este método permite la medición en tiempo real y la caracterización detallada de los procesos de transporte epitelial. Este innovador modelo in vitro , combinado con técnicas establecidas como la cámara de Ussing, proporciona una plataforma robusta para caracterizar fisiológicamente el TGI porcino dentro del marco de las 3R. También abre oportunidades para investigar los mecanismos fisiopatológicos y desarrollar posibles estrategias terapéuticas.
Introducción
El TGI desempeña un papel central en la digestión, la absorción de nutrientes y la excreción de desechos a través de las heces1. Además, funciona como una barrera contra los patógenos, un papel respaldado por una composición celular diversa, que incluye células madre, células caliciformes productoras de moco, células enteroendocrinas y enterocitos absorbentes2. La homeostasis intestinal puede verse alterada por diversos factores, como infecciones bacterianas3 o procesos inflamatorios4, lo que conlleva graves consecuencias para el organismo,....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Para este protocolo, se sacrificaron dos cerdos sanos (cerdo Bentheim Blacked Pied; 1 macho, 1 hembra; 4,5 meses de edad; aproximadamente 65 kg) por tiro de perno cautivo y sangrado. De acuerdo con la Ley de Protección Animal, esto (sacrificio y extracción de tejidos) no se clasifica como un experimento con animales, sino que debe ser anunciado al oficial de bienestar animal (registro no. TiHo-T-2023-15) de la Fundación de la Universidad de Medicina Veterinaria de Hannover.
1. Recubrimiento de insertos
NOTA: Todos los pasos se llevan a cabo con materiales estériles bajo un gabinete de seguridad. To....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo facilita la generación fiable de monocapas 2D porcinas mediante la disgregación de organoides 3D derivados del yeyuno y el colon de cerdos. Durante un período de cultivo de 16 días para los organoides de yeyuno y de 9 días para los organoides de colon, se forman monocapas intactas. Estas monocapas se pueden utilizar posteriormente para evaluar las propiedades de transporte electrogénico y fisiológico mediante la técnica de la cámara de Ussing.
Después de desintegrar los organoid.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo describe un método para convertir organoides 3D porcinos establecidos en células individuales, que luego se siembran en membranas transpocillas para formar una monocapa intacta. Esta configuración permite el acceso al lado apical de las células, lo que facilita el uso de las cámaras de Ussing para monitorizar los procesos de absorción y secreción.
El paso inicial y crucial en este proceso de varios pasos es la desintegración precisa de los organ.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No tenemos ningún conflicto de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos al Ministerio Federal de Alimentación y Agricultura (BLE# 28N-2-071-00) por su financiación.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 24 pocillos | SARSTEDT AG & Co. KG | 8,33,922 | |
| A83-01 | MedChemExpress, Nueva Jersey, EE. UU | HY-10432 | Almacén a -20 °C. Descongele cuando sea necesario |
| accujet S | Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Alemania | 26351 | |
| Advanced DMEM/F12 | Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | 12634010 | Tienda a 4 ° Suplemento de C |
| B27 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU | 17504044 | Almacenar a -20 °C. Descongelar cuando sea necesario |
| CaCl2.2 H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | C3306 | Almacenar a temperatura ambiente |
| D(+)-Glucosa (wasserfrei) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.08337 | Almacenar a temperatura ambiente |
| DAPT | MedChemExpress, Nueva Jersey, EE. UU | HY-13027 | Almacene a -20 °C Descongele cuando sea necesario |
| D-Mannitol | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | M4125 | Almacene a temperatura ambiente |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania | 154938 | Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Juego de electrodos (AgCl/PtIr/Std.) | Instrumentos científicos, Simmerath, Alemania | #1316 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf SE, Hamburgo, Alemania | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf SE, Hamburgo, Alemania | 3123000047 | |
| EVOM3 Voltímetro epitelial manual de ohmios Instrumentos | precisión mundiales, Sarasota, EE. UU | EVM-MT-03-01 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania | F7524 | Almacén a -20 °C. Descongelar cuando sea necesario |
| Forskolin | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania | F6886 | Almacenar a -20 °C. Descongelar cuando sea necesario |
| gasprofi 1 SCS micro | WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Alemania | 60,04,000 | |
| Gastrin 1 | MedChemExpress, Nueva Jersey, EE. UU | HY-P1097 | Tienda a -20 °C. Descongele cuando sea necesario |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU | 35050061 | Tienda a 4 °C. |
| HCl | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania | 1090571000 | Almacenamiento a temperatura ambiente |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania | H0887 | Almacén a 4 & grados; C |
| Herasafe 2025 Cabina de seguridad biológica de clase II | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | ||
| ICO105 | Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Alemania | 62,20,143 | |
| Indometacina | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | I7378 | Almacenamiento a temperatura ambiente |
| KCl | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.04936 | Almacenamiento a temperatura ambiente |
| L-Glutamin | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania | G7513 | Tienda a -20 °C. Descongele cuando sea necesario |
| LWRN Supernadante | hecho a sí mismo | Almacene a -20 ° C. Descongele cuando sea necesario. El suplemento LWRN se produce de acuerdo con Miyoshi et al. (2012) | |
| Matrigel Matriz de membrana basal, libre de LDEV, 10 mL | Corning Incorporated - Ciencias de la Vida | 354234 | Almacene a -20 & C. Descongele cuidadosamente en hielo cuando sea necesario |
| Megafuge 1.OR | Heraeus Instruments, Osterode, Alemania | 75003060 | |
| MgCl2.6 H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.05833 | Almacenar a temperatura ambiente |
| Na2HPO4.2H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.06580 | Almacenar a temperatura ambiente |
| N-acetil-L-cisteína | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania | A7250 | Almacenar a -20 °C. Descongelar cuando sea necesario |
| NaCl | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.06404 | Almacenar a temperatura ambiente |
| NaH2PO4. H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.06346 | Almacenamiento a temperatura ambiente |
| NaHCO3 | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.06329 | Almacenamiento a temperatura ambiente |
| Cámara mejorada Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhö n, Alemania | 40442712 | |
| Microscopio ivertido Olympus IX70 | Olympus Corporation, Hamburgo, Alemania | ||
| Pluma/Estreptococo | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU | 15140122 | Almacene a -20 °C. Descongele cuando sea necesario |
| PolymyxinB | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania | P4932-1MU | Almacene a -20 °C. Descongele cuando sea necesario |
| Soporte de microscopio Primovert con fototubo binocular | Zeiss | 415510-1101-000 | |
| rm EGF | Prepotech, Nueva Jersey, EE. UU | 315-09 | Almacene a -20 °C. Descongele cuando sea necesario |
| SB202190 | MedChemExpress, Nueva Jersey, EE. UU | HY-10295 | Almacene a -20 °C. Descongele cuando sea necesario |
| Snapwell 3801 | Corning Incorporated - Ciencias de la Vida | 3801 | |
| Tripsina/EDTA | Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU. | 25300054 | |
| Uso de instrumentos científicos del sistema de base | , Simmerath, Alemania# | 1317 | |
| Uso de instrumentos científicos de cámara de difusión | , Simmerath, Alemania | SKU 1307 | |
| Pinza amperimétrica/corriente VCC6 | Instrumentos científicos, Simmerath, Alemania | SKU 1310 | |
| Y27632 | MedChemExpress, Nueva Jersey, USA | HY-10583 | Almacene a -20 °C. Descongele cuando sea necesario |
Referencias
- Hornbuckle, W. E., Tennant, B. C. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. , Academic Press. 367-406 (1997).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Pham, T. A.,....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
