Las conmociones cerebrales pediátricas pueden provocar secuelas a largo plazo con perturbaciones fisiológicas y psicológicas. Este modelo de ratón de conmoción cerebral pediátrica produce neuroinflamación a largo plazo, alteraciones de la materia blanca y modificaciones neuronales con disfunción conductual. El modelo se puede adaptar a ubicaciones de impacto diferenciales o conmociones cerebrales repetidas para evaluar los cambios de vida útil.
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Artículo de método
Un modelo pediátrico de conmoción cerebral en ratones: traumatismo craneoencefálico cerrado con trastornos a largo plazo (CHILD)
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Resumen
Resumen
Las conmociones cerebrales y las lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI, por sus siglas en inglés) durante la infancia representan un peligro significativo para la salud, y muchos pacientes más adelante en la vida muestran resultados fisiológicos, neurológicos y psicosociales debilitantes. Los mecanismos fisiopatológicos celulares y moleculares son relativamente desconocidos, y esta brecha significativa impide efectivamente la investigación de estrategias terapéuticas específicas para mitigar las secuelas crónicas. Ningún modelo de conmoción cerebral animal por sí solo recapitula todas las características reportadas en sujetos humanos, y los modelos actuales están diseñados para responder preguntas de investigación específicas. Nos propusimos desarrollar una conmoción cerebral juvenil que recapitule la sintomatología clínica temprana y a largo plazo encontrada, denominada Traumatismo Craneal Cerrado con Trastorno a Largo Plazo (CHILD). En este modelo, se administra una fuerza de conmoción a través de un impactador electromagnético a la cabeza de un ratón postnatal (P17) ligeramente anestesiado y sin restricciones, lo que permite la rotación libre de la cabeza. Los ratones se colocan sobre una lámina de estaño fuertemente estirada a través de un dispositivo estereotáctico, y el impactador se alinea cuidadosamente con la región cortical objetivo. El impactador electromagnético facilita la selección de la profundidad, la permanencia y la duración del impacto para determinar la gravedad de la lesión. Uno de los puntos fuertes de este modelo es que permite la rotación de la cabeza, una característica clínica importante. Después del impacto, los ratones son monitoreados inmediatamente para enderezarse y tiempo para explorar su entorno, seguido de su regreso a su madre. El aumento de la gravedad de la conmoción cerebral provoca hemorragias intracraneales en un subconjunto de ratones. Los ratones pueden ser monitoreados rutinariamente para determinar el comportamiento y las neuroimágenes durante su vida, según se desee. Varias lesiones de gravedad imitan la naturaleza heterogénea de las conmociones cerebrales juveniles. El modelo estándar actual de CHILD no presenta fractura de cráneo, ni cambios observables en la neuroimagen convencional (similares a los clínicos), pero conduce a una muerte neuronal progresiva y persistente, una resonancia magnética de difusión alterada, una actividad y plasticidad neuronal modificadas, un aumento de la gliosis y perturbaciones conductuales progresivas con la edad. En resumen, este modelo CHILD imita las características tempranas y a largo plazo observadas en muchos pacientes clínicos con conmoción cerebral.
Introducción
La lesión cerebral traumática pediátrica (TBI) es un problema de salud importante, ya que representa la principal causa de visitas de atención médica de emergencia pediátrica y se asocia con resultados de salud debilitantes más adelante en la vida. Incluso un traumatismo craneoencefálico leve (mTBI), que representa el 75% de todos los casos de TBI1, conduce a anomalías a largo plazo, que incluyen disfunciones fisiológicas, psicológicas, neurológicas y cognitivas2. A pesar de la alta incidencia de mTBI pediátrico y sus importantes riesgos para la salud asociados, los mecanismos patológicos, celulares y moleculares que preceden a los déficits crónicos aún están poco explorados. Esta laguna en el conocimiento impide el desarrollo de tratamientos y métodos de diagnóstico eficaces para el TCE leve pediátrico.
Los modelos de LCT en roedores adultos incluyen pérdida de peso, impacto cortical controlado y lesión por percusión de fluidos, y se pueden ajustar para provocar lesiones moderadas a graves (dependiendo de las medidas de resultado)3,4. Muchos de estos modelos de adultos han sido adaptados para el TCE pediátrico 5,6. Durante la última década, se han desarrollado modelos de mTBI en roedores con traumatismo craneal cerrado, así como con modelos rotacionales7. Sin embargo, la implementación de estos modelos en roedores en desarrollo es escasa en comparación con la literatura sobre TCE en adultos8. Para abordar la relevancia clínica, que abarca una amplia gama de gravedades que modelan la heterogeneidad clínica pediátrica, este estudio desarrolló el modelo de TCE por Traumatismo Craneal Cerrado con Trastorno a Largo Plazo (CHILD). CHILD es un modelo de conmoción cerebral no quirúrgico y sin restricciones que utiliza ratones P17, una edad de desarrollo que corresponde al pico de mielinización observado en niños de 2-3 años de edad9. Se administra una fuerza de conmoción cerebral utilizando un impactador electromagnético sobre la corteza somatosensorial de un ratón ligeramente anestesiado con isoflurano. El impacto en la cabeza sin restricciones da lugar a fuerzas de rotación en el cerebro10, como se informa en muchos informes clínicos de conmociones cerebrales. De acuerdo con el mTBI clínico, el modelo CHILD no conduce a fractura de cráneo ni a anomalías visibles en las neuroimágenes convencionales.
El modelo CHILD tiene varias ventajas. En primer lugar, se han observado características patológicas tempranas y a largo plazo en el CHILD, que imitan las características clínicas patológicas observadas en pacientes juveniles con conmoción cerebral. Se ha observado en puntos temporales tardíos gliosis, resonancia magnética con tensor de difusión alterado y alteraciones conductuales progresivas con la edad10,11, actividad neuronal modificada y plasticidad11,12. Curiosamente, también se encontraron consecuencias periféricas insospechadas con anormalidades cardíacas a largo plazo después de una sola lesión pediátrica13. En segundo lugar, este modelo es replicable y mostró resultados comparables entre investigadores y entre laboratorios13. En tercer lugar, el modelo CHILD es flexible y puede ampliarse para encapsular la naturaleza heterogénea de las LCT. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que diferentes velocidades y profundidades de impacto dan como resultado diferentes gravedades 10,11. Finalmente, una fortaleza adicional de este modelo es que CHILD se puede administrar repetidamente y se puede aplicar fácilmente a ubicaciones diferenciales para sondear las respuestas a lesiones repetidas e identificar regiones cerebrales vulnerables.
En general, el modelo CHILD replica el TCE leve y la conmoción cerebral pediátricas clínicas, y sirve como herramienta de investigación para facilitar la comprensión de las características fisiopatológicas del TCEm pediátrico. Si bien ningún modelo encapsula todos los aspectos de las características descritas en los casos de LCT de la vida real, este modelo puede abordar muchas de las preguntas de investigación pendientes que permanecen sin respuesta.
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Protocolo
Los experimentos se reprodujeron en 2 sitios, la Universidad de Burdeos (Francia) y la Universidad de California Riverside (CA, EE. UU.).
En Burdeos, todos los experimentos se realizaron con ratones machos y hembras P17 C57Bl6J criados en el animalario de la Universidad. Las reproductoras iniciales se obtuvieron de una fuente comercial y se criaron en condiciones estándar con un ciclo de luz y oscuridad de 12/12 horas, una temperatura de 21 °C ± 1 °C, y una humedad de 55% ± 10%, y alimento y agua proporcionados ad libitum. Los procedimientos experimentales están de acuerdo con las regulaciones del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Burdeos, las leyes francesas que rigen el uso de animales de laboratorio (autorización #29324-2021012118549817 v3), las directivas del Consejo Europeo (86/609/CEE) y las directrices ARRIVE. Este protocolo, al ser un modelo leve de traumatismo craneoencefálico, no produce dolor ni angustia. Como tal, no requiere ningún tratamiento específico del dolor fuera del tratamiento regular del dolor. El destete de las crías (TBI, Shams) fue efectivo a P25.
En Riverside, se obtuvieron comercialmente ratones hembra C57Bl6J preñados E13, y todos los experimentos se realizaron en las camadas resultantes en cachorros machos y hembras de P17. Los animales se criaron con un ciclo automatizado de luz/oscuridad de 12/12 h y una temperatura de 21 °C. Las madres y los cachorros tenían acceso ad libitum a la comida y al agua. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Riverside, y cumplieron con la Ley de Bienestar Animal y la política del Servicio de Salud Pública. Todos los cachorros (TBI, Sham) en esa instalación fueron destetados en P21.
Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Pasos preliminares
- Para evitar la hipotermia, caliente la cámara para la inducción de la anestesia y las jaulas de recuperación con anticipación con almohadillas térmicas.
- Coloque el aparato estereotáxico con el impactador montado en un ángulo de 90°.
- Verifique que todas las piezas estén correctamente apretadas y aseguradas y que el pistón esté firmemente atornillado al impactador.
- Corta una lámina de aluminio que se ajuste al aparato estereotáxico (en este caso, 18 cm x 30 cm). El aluminio utilizado aquí es de calidad de aluminio estándar. Envuelva el marco estereotáxico con el papel de aluminio para formar una almohadilla sobre la que se acostará el animal. Asegure la posición y la tensión del papel de aluminio con cinta de laboratorio normal para soportar el peso del animal.
- Encienda el controlador del impactador y, en función de la gravedad de la lesión, establezca la velocidad del impacto en 2 m.s-1 para el grado 1 (G1) o 3 m.s-1 para el grado 2 (G2) para un impacto más severo (modificar este parámetro afectará la gravedad de la conmoción cerebral).
- Pesa a los animales. En P17, el peso de los animales debe ser superior a 5,9 g para los ratones C57Bl6. Quedan excluidos los animales que estén por debajo de ese peso.
NOTA: Para algunos estudios, se utilizaron ratones CD1, y para P17, el umbral se fijó en más de 6,5 g (datos personales).
2. Procedimiento de lesión cerebral traumática leve juvenil
- Anestesiar al ratón con una exposición de 5 minutos al isoflurano. Ajuste la composición del gas a una mezcla del 2,5% (en este caso, el portador es una mezcla de aire sintético con un 21% de oxígeno) con un caudal de 1,5 L/min.
NOTA: A partir de este paso, todas las acciones deben realizarse rápidamente, ya que los animales no impactados se despertarán en 5 minutos. - Coloque la cabeza del ratón debajo del impactador. El cachorro debe estar extendido a todas las longitudes. La punta tiene 3 mm de diámetro y está cubierta de goma para minimizar el efecto del metal en el cráneo.
- Baje el impactador cambiando la perilla a la posición Extender .
- Baje aproximadamente el impactador y coloque el mouse de modo que el impactador quede justo entre las orejas. Luego, deslice el ratón de modo que la punta del pistón se mueva hacia adelante hasta el equivalente a una punta de pistón y una punta de pistón a la izquierda del animal (consulte la Figura 1).
NOTA: Los animales simulados se colocan ligeramente lejos del pistón (no se debe impactar ninguna parte del animal). - Baje el impactador para que haga contacto con la cabeza del animal (Figura 1E2).
- Coloque el impactador en Retraer (Figura 1E3).
- Para determinar la gravedad de la lesión, mueva el pistón 1 mm hacia abajo para el grado 1 (G1). Para impactos más severos de grado 2 (G2), mueva el pistón 3 mm hacia abajo (Figura 1E4).
- Establezca el tiempo de permanencia en 0,1 s, independientemente de la gravedad (la modificación de este parámetro no afectará a la gravedad de la conmoción cerebral).
- Presione Impact en la perilla derecha (Figura 1E5).
- Coloque rápidamente la perilla izquierda en la posición de apagado para que el sistema no se sobrecaliente. Consulte el diagrama de flujo para obtener más información (Figura 2).
Figura 1: Posición de la punta del impactador. (A) La punta del impactador se coloca primero en la línea media entre las orejas. (B) A continuación, la punta se desplaza 3 mm hacia delante (el equivalente al diámetro de una punta). (C) Finalmente, la punta del pistón se mueve 3 mm en el lado izquierdo del mouse. (D,E) Posibles posiciones de la punta del impactador con respecto al cañón magnético. (D) El impactador tiene 3 posiciones en relación con el cuerpo del pistón (neutro, retraído o extendido/impacto) con un alcance de 5 mm entre ellas. (E) Posiciones de la punta del impactador en relación con la superficie del cráneo en las diferentes etapas del procedimiento. (1) Posición del impactador en la posición neutra; (2) el pistón se mueve para tocar suavemente el cráneo del animal (paso 2.5); (3) a continuación, el impactador se ajusta para retraerse (paso 3.6); (4) Todo el cuerpo del impactador se desplaza x mm hacia abajo (paso 2.7). Para el grado G1, una velocidad de impacto (y) de 2 m.s-1 con 1 mm de profundidad (x) para G1 o una velocidad de impacto (y) de 3 m.s-1 con 3 mm (x) de profundidad para G2. (5) Una vez que se presiona el impacto de la palanca, la punta del impactador se mueve x mm por debajo de la superficie del cráneo a una velocidad y durante el tiempo de permanencia al volver a la posición neutral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de CHILD. Diagrama de flujo que detalla los pasos para inducir la CHILD en ratones PND17 codificados por colores para denotar las diferentes fases de la inducción de la conmoción cerebral. Las fotografías de la instalación incluyen (A) toda la configuración de inducción del NIÑO (el dispositivo de anestesia no es visible), incluido el controlador de impacto, el dispositivo estereotáctico con el impactador y la punta colocados sobre papel de aluminio tenso, y la caja de recuperación ubicada encima de una almohadilla térmica. (B) Punta de impacto de goma (3 mm) con escala. (C) El dispositivo estereotáctico con papel de estaño estirado a través del marco estereotáctico y el solenoide del impactador con la punta de impacto colocada sobre el lámina. (D) Cámara de recuperación asentada sobre la almohadilla térmica. (E) El controlador de impacto con dos interruptores de control, resaltados como en el diagrama de flujo (cuadro rojo = extender/retraer/apagar; cuadro púrpura = interruptor de impacto). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Seguimiento postraumático
NOTA: Los siguientes pasos se pueden grabar en video para el análisis fuera de línea, lo que permite al experimentador realizar CHILD en varios animales seguidos. No obstante, se deben realizar evaluaciones periódicas y repetidas del bienestar animal.
- Anote la duración de la apnea, si está presente (inmediatamente después del impacto) y si hubo una rotación de la cabeza durante el impacto.
- Coloque el ratón en su flanco derecho en una jaula de recuperación.
- Nótese el tiempo de enderezamiento del ratón (encabritado sobre 4 patas) y el tiempo de reanudación de un comportamiento exploratorio. Por lo general, los ratones simulados se despiertan dentro de los 3-4 minutos y reanudan un comportamiento exploratorio 3-4 minutos más tarde (Figura 3). Los ratones CHILD se despiertan dentro de los 7-12 minutos después del impacto (Figura 3A) y reanudan la exploración dentro de los 12-18 minutos después del impacto (Figura 3B), de acuerdo con el sexo y la gravedad del impacto (Figura 3A, B).
NOTA: Si el animal impactado no reanuda su comportamiento exploratorio dentro de los 30 minutos, el animal queda excluido. - Una vez que estén completamente recuperados, regrese a los animales a su jaula de origen. En este punto, el comportamiento de los ratones simulados y NIÑOS (gravedad G1 o G2) debería ser exactamente similar, y los grupos de animales no deberían distinguirse dentro de la camada.
NOTA: Los animales pueden ser mantenidos hasta 18 meses después de la lesión14 en las condiciones indicadas al inicio de los métodos. Las evaluaciones de los resultados conductuales se pueden realizar utilizando una batería de pruebas en asociación con mediciones de resonancia magnética, imágenes con miniscopio, histología e inmunohistoquímica12. La inmunohistoquímica para GFAP y NeuN se puede utilizar en puntos de tiempo tempranos para validar el modelo y la presencia de cambios en el tejido.
4. Inmunohistoquímica
NOTA: Un día después de la lesión, los animales de los grupos G2 y simulado (n = 4 ratones para G2 y n = 4 para Sham) fueron anestesiados y perfundidos transcárdicamente con paraformaldehído (PFA) al 4% preparado en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M, pH 7,4 a 4 °C. Los cerebros se extrajeron10 del cráneo y se sumergieron en la misma solución de PFA durante la noche, y luego se transfirieron a PBS con azida de sodio (0,1%) antes del corte. A continuación, se prepararon secciones coronales de 50 μm de espesor utilizando un vibrátomo. Para un almacenamiento prolongado, las secciones se colocaron en medio crioprotector (30% de etilenglicol y 20% de glicerol en PBS) a -20 °C hasta su uso. Para caracterizar el impacto de la conmoción cerebral en la gliosis cerebral y la pérdida neuronal, se realizó una inmunohistoquímica dirigida a GFAP y NeuN como se describe a continuación.
- Lave las secciones del cerebro 4 veces durante 10 minutos en PBS.
- Transfiera las secciones en solución de bloqueo (1% BSA, 0,3% Triton X-100 en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Incubar secciones durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en solución bloqueante: anti-GFAP de pollo (1:3000) y anti-NeuN de conejo (1:500).
- Lave las rodajas 4 veces durante 10 min en PBS bajo agitación.
- A continuación, transfiera las secciones a una solución de bloqueo que contenga los anticuerpos fluorescentes secundarios diluidos 1:1000 durante 1 h a RT, Alexa-Fluor-488-nm goatat anti-rabbit y Alexa-Fluor-568-nm goat anti-chicken.
- Lavar luego las secciones 4 veces durante 10 min en PBS bajo agitación.
- Monte las secciones en guías con un medio de montaje y agregue un cubreobjetos. Mantenga las diapositivas a 4 °C hasta la adquisición de la imagen.
- Adquiera inmunofluorescencia utilizando un microscopio de epifluorescencia y un software micromanager. Utilice un complemento de unión con una lente de 10x para obtener imágenes en mosaico de los hemisferios ipsilateral y contralateral.
NOTA: La tinción de control negativo en la que se omitió el anticuerpo primario o el anticuerpo secundario no mostró ningún marcaje detectable. Para un análisis de imágenes más detallado, se puede utilizar el software Fiji15 para cuantificar los parámetros de inmunotinción en varias regiones de interés16.
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Resultados
El modelo CHILD es un modelo relativamente rápido y reproducible de mTBI en ratones pediátricos, que también permite variaciones en la gravedad y la ubicación. Los ratones CHILD, como se esperaba, exhibieron tiempos de recuperación significativamente más largos de una lesión cerrada en la cabeza (Figura 3). Cuando se agregaron las cohortes (n = 36 mujeres falsas, n = 140 hombres falsos, n = 30 mujeres G1, n = 55 hombres G1, n = 32 mujeres G2, n = 141 hombres G2), se observó un retraso en el ...
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Discusión
Pasos críticos en el protocolo
El protocolo CHILD descrito aquí requiere el uso de un impactador electromagnético (Figura 2A) que (1) estandariza los parámetros de impacto (velocidad, profundidad, duración), (2) garantiza la reproducibilidad dentro y entre laboratorios, y (3) está fácilmente disponible comercialmente. Otro componente crítico es la punta del impactador que golpea la cabeza del roedor. Se puede utilizar una variedad de posi...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este artículo de método fue financiado por Eranet Neuron Neuvasc (Badaut), Agence Nationale de la Recherche Nanospace (Badaut), CNRS IRP IINOVAtion (Badaut) y NIH NINDS Grant No. 1R01NS19605 (Obenaus, Badaut) y 1RF1NS138032 (Obenaus, Territo). La figura 1 se crea con BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France | A7030 | |
| C57Bl6J mice | Laboratorio Charles River Francia CRLF 9 Todos. Moulin Berger, 69130 y Eacute; Cully, Francia | Burdeos | |
| Impactador electromagnético | Leica Biosystems, Richmond, Illinois, EE. UU. | Impactador | |
| Microscopio de epifluorescencia | Olympus, BX41, Center Valley, PA | ||
| Etilenglicol | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex Francia | 102466 | |
| anticuerpo primario GFAP | Millipore, Billerica, MA | AB5541 | pollo anti-GFAP |
| anticuerpo secundario GFAP | Sondas moleculares, Invitrogen | A11034 | cabra anti-conejo AlexaFluor 488 |
| Glycerol | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France | G5516 | |
| Papel de aluminio de alta resistencia | Kirkland | RK611 | obtenido en Cosco |
| Micromanager software | (NIH, EE. UU. | ||
| Anticuerpo primario NeuN | AbCam, Discovery Drive, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, CB2 0AX, Reino Unido | AB128886 | conejo anti-NeuN |
| anticuerpo secundario NeuN | Sondas moleculares, Invitrogen | A11041 | cabra anti-pollo AlexaFluor 568 |
| PBS | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France | P5493 | |
| PFA | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France | 1.04003 | |
| Azida sódica | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France | 26628-22-8 | |
| Marco estereotáxico - base | KOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, É tats-Unis | 900-C | |
| Marco estereotáxico - manipulador de electrodos | KOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, É tats-Unis | 960 | |
| Marco estereotáxico - bastidor en U | KOPF instruments 7324 Elmo St, Tujunga, CA 91042, É tats-Unis | 900-U | |
| Triton x-100 | Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 Saint-Quentin-Fallavier Cedex France | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000-10 Medio de | montaje |
| Vibratome | Leica Biosystems, Richmond, IL USA VTS1000 | ||
| Laboratorio Jackson El Laboratorio Jackson 600 Main Street Bar Harbor, ME USA 04609 | UCR |
Referencias
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