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Artículo de método

Detección de la susceptibilidad a los medicamentos y las interacciones farmacológicas en Mycobacterium tuberculosis mediante el microtítulo de resazurina y el ensayo de tablero de ajedrez

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DOI:

10.3791/67672

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24 de octubre de 2025

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar y estandarizar el ensayo de microtitulación de resazurina (REMA) y su variación de tablero de ajedrez para evaluar la susceptibilidad a los medicamentos y los perfiles de interacción de Mycobacterium tuberculosis. Este método proporciona información, in vitro, para optimizar las combinaciones de fármacos que se utilizarán en los regímenes de tratamiento y combatir la tuberculosis multirresistente.

Resumen

La aparición de la tuberculosis multirresistente (MDR-TB) requiere métodos rápidos y precisos de pruebas de susceptibilidad a los medicamentos (DST) para guiar un tratamiento efectivo. Este estudio presenta una metodología que combina el ensayo de microtitulación de resazurina (REMA) y el ensayo de tablero de ajedrez para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) y evaluar las interacciones farmacológicas de los medicamentos antituberculosos contra Mycobacterium tuberculosis. El REMA, adaptado a un formato de 96 pocillos, aprovecha la reducción del colorante de resazurina por M. tuberculosis metabólicamente activa como un indicador visual de la susceptibilidad a los medicamentos. Se prueban concentraciones variables de medicamentos antituberculosos contra aislados de M. tuberculosis y se observan cambios de color para determinar la CIM. Posteriormente, se emplea un ensayo de tablero de ajedrez para evaluar los posibles efectos sinérgicos, aditivos o antagónicos entre combinaciones de fármacos. Este método simple y económico produce resultados en siete días, lo que ofrece una ventaja significativa sobre los métodos tradicionales de DST. Este método proporciona información valiosa sobre el DST de los aislados de M. tuberculosis y facilita la identificación de combinaciones de fármacos prometedoras para mejorar los resultados del tratamiento contra la MDR-TB.

Introducción

La tuberculosis (TB), causada por Mycobacterium tuberculosis, sigue siendo un formidable desafío para la salud mundial, exacerbado por la aparición de cepas resistentes a los medicamentos. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), en 2023 se estimaron 10,6 millones de nuevos casos de tuberculosis y 1,3 millones de muertes, lo que pone de manifiesto la necesidad urgente de estrategias diagnósticas y terapéuticas más eficaces1. La tuberculosis multirresistente (MDR-TB) y la tuberculosis extremadamente resistente a los medicamentos (XDR-TB) plantean grandes desafíos para el control de la enfermedad debido a la complejidad, toxicidad y duración prolongada de los regímenes de tratamiento actuales 2,3.

La reciente introducción de nuevos agentes antituberculosos, como la bedaquilina y la delamanida, dirigidos a vías bioquímicas únicas en M. tuberculosis, representa un gran avance en el tratamiento de la tuberculosis 4,5. Estos medicamentos han sido aprobados principalmente para su uso en casos de tuberculosis resistente a fluoroquinolonas y rifampicinas como parte de regímenes de tuberculosis multirresistente más largos y más cortos respaldados por la OMS 6,7. Sin embargo, la determinación de combinaciones óptimas de medicamentos y regímenes de dosificación, particularmente cuando estos agentes se usan junto con terapias establecidas, sigue siendo un área crítica de investigación 8,9. Los métodos actuales para las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos (DST), aunque confiables, a menudo requieren mucho tiempo, recursos y poco son prácticos para evaluar combinaciones complejas de medicamentos en un entorno clínico o de investigación10. Esto subraya la necesidad de ensayos fenotípicos simples y escalables que puedan evaluar tanto la eficacia de los fármacos como los perfiles de interacción en M. tuberculosis.

Entre estos enfoques fenotípicos, el ensayo de microtitulación de resazurina (REMA) se ha convertido en un método convencional y ampliamente aceptado para evaluar la susceptibilidad a los medicamentos. El ensayo se basa en la reducción del colorante azul resazurina a resarufina rosa por bacterias metabólicamente activas, que sirven como indicador visual de la viabilidad celular. Aunque popularizado por Palomino et al. en 200211, el principio de uso de resazurina para evaluar el crecimiento bacteriano se remonta al trabajo de Pital et al.12. Durante las últimas dos décadas, el método REMA ha sido ampliamente validado e incorporado a los procedimientos operativos estándar para la investigación de micobacterias y las pruebas de diagnóstico 13,14,15.

Complementando el REMA, el ensayo de tablero de ajedrez, introducido por Caleffi-Ferracioli et al., amplía la utilidad de REMA al permitir estudios de interacción de dos fármacos en un formato de microdilución utilizando la misma lectura basada en resazurina16. Si bien es prometedor en principio, este método sigue siendo principalmente una herramienta de investigación útil para detectar posibles combinaciones sinérgicas o antagónicas de fármacos durante la evaluación preclínica temprana en lugar de un ensayo de diagnóstico de rutina.

Este manuscrito no presenta REMA o su variante de tablero de ajedrez como métodos novedosos. Más bien, el objetivo de este estudio es proporcionar una representación visual de una metodología útil y validada para la determinación de la CMI y las pruebas de interacción farmacológica, que se ha descrito y aplicado con éxito en estudios anteriores. Proporcionamos un protocolo paso a paso con orientación detallada sobre la preparación del inóculo, la titulación de fármacos, el diseño de la placa, la interpretación de la CMI y el análisis de la interacción del tablero de ajedrez. Este manuscrito tiene como objetivo apoyar un uso más amplio y consistente de REMA y ensayos de tablero de ajedrez en el desarrollo de medicamentos contra la tuberculosis y la farmacología experimental.

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Protocolo

NOTA: Los productos químicos y materiales utilizados en los experimentos de ejemplo están disponibles en el archivo Tabla de materiales.

1. Preparación de los medios 7H9-S

  1. Para 100 ml de medio 7H9-S, pesar 0,47 g de polvo 7H9 y 0,1 g de casitone, luego disolver en 90 ml de agua destilada; revuelva hasta que se disuelva por completo.
  2. Esterilizar el caldo en un matraz de 250 ml utilizando un autoclave a 121 °C durante 15 min.
  3. Una vez esterilizado en autoclave y enfriado, agregue 10 ml de suplemento de albúmina dextrosa catalasa oleica (OADC) y 0,5 ml de glicerol.
  4. Incubar durante la noche a 37 °C para comprobar la esterilidad.
    NOTA: La esterilidad del medio 7H9-S preparado se verifica incubándolo durante la noche a 37 °C. El medio debe permanecer limpio al día siguiente, sin que se observe turbidez.
  5. Guarde el medio 7H9-S a 4 °C, lejos de la luz directa.

2. Preparación de inóculo de M.tuberculosis

  1. Preparación de inóculo a partir de cultivo de M. tuberculosis cultivado en medio sólido Lowenstein Jensen (LJ)
    1. Usando un asa de inoculación estéril, recolecte un asa completa de cultivo de M. tuberculosis de un medio LJ recién crecido (21-28 días de edad).
      NOTA: Evite cuidadosamente raspar demasiado profundo en el medio, lo que puede molestar a las colonias más viejas.
    2. Coloque las bacterias recolectadas en una botella de bijou estéril que contenga perlas de vidrio estériles y 2,5 ml de caldo 7H9-S. Asegúrese de que las perlas de vidrio ayuden en la interrupción mecánica de los grumos durante el vórtice.
      NOTA: Los cultivos frescos entre 21 y 28 días son esenciales para garantizar resultados confiables de las pruebas de susceptibilidad. Evite el uso de culturas más antiguas, ya que pueden conducir a resultados inconsistentes.
    3. Asegure la botella de bisutería y haga un vórtice vigoroso durante al menos 1 min. Asegúrese de mezclar continuamente para romper los grumos bacterianos, lo que da como resultado una suspensión relativamente turbia. El objetivo es una distribución homogénea de las bacterias dentro del medio.
    4. Transfiera la suspensión de cultivo a una botella de bisutería nueva y déjela reposar sin tocarla durante 15 minutos. Este paso permite que los grupos bacterianos más grandes se asienten en el fondo.
    5. Utilizando como referencia el estándar McFarland 1.0, verifique la turbidez de la suspensión de cultivo y ajuste con caldo 7H9-S hasta lograr la turbidez deseada.
      NOTA: Se utiliza un estándar de McFarland, típicamente 1.0, como referencia para una turbidez equivalente a aproximadamente 1.97 × 106 UFC/ml17. El estándar se prepara combinando 0,1 ml de cloruro de bario al 1% y 9,9 1 ml de ácido sulfúrico al 1%, lo que da como resultado un precipitado fino de sulfato de bario, que proporciona la turbidez. La suspensión bacteriana se compara visualmente con el estándar McFarland sosteniendo ambos tubos sobre un fondo blanco con líneas negras. La turbidez de la suspensión bacteriana se ajusta para que coincida con el estándar.
  2. Preparación de inóculo a partir de cultivo de M. tuberculosis cultivado en medio líquido 7H9
    1. Con una pipeta estéril, transfiera 2,5 ml de cultivo de M. tuberculosis (2-3 semanas de edad) a un frasco de bisutería nuevo con perlas de vidrio.
    2. Agite la mezcla durante al menos 1 min para asegurar una suspensión homogénea. La acción de vórtice ayuda a romper cualquier grumo.
    3. Transfiera los 2,5 ml de suspensión de cultivo a una botella de bisutería nueva y déjela durante 15 minutos para permitir que los grumos se asienten en el fondo.
    4. Compare la turbidez con la estándar McFarland 1.0 y ajuste con caldo 7H9-S para lograr la concentración requerida.
  3. Dilución del inóculo
    1. Preparar una dilución 1:10: Para diluir el inóculo, añadir 1 mL de la suspensión bacteriana a 9 mL de caldo 7H9-S en un recipiente estéril (Esto dará aproximadamente 1,97 × 105 UFC/mL).

3. Preparación de antibióticos y almacenamiento.

  1. Preparación de soluciones madre y de trabajo: Prepare los medicamentos utilizados en el experimento de ejemplo, junto con sus métodos de preparación de soluciones madre y de trabajo, como se resume en la Tabla 1.
    1. Isoniazida (INH o I): Para preparar una solución madre de 1 mg/ml de isoniazida, disuelva 2 mg de isoniazida en polvo en 2,0 ml de agua destilada. Esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
    2. Moxifloxacina (MOX o M): Para preparar una solución madre de 1 mg/ml de moxifloxacina, disuelva 2 mg de moxifloxacina en polvo en 2.0 ml de agua destilada. Esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
    3. Bedaquilina (BDQ o J): La bedaquilina es poco soluble en agua. Para preparar una solución madre de 1 mg/ml, disuelva 2 mg de polvo de bedaquilina en 2,0 ml de DMSO. Esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
    4. Delamanida (DEL o D): Similar a la bedaquilina, la delamanida tiene poca solubilidad en agua. Para preparar una solución madre de 1 mg/ml, disuelva 2 mg de polvo de delamanida en 2,0 ml de DMSO. Esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
  2. Almacenamiento: Alícuota de 100 μL de cada solución madre de fármaco en crioviales estériles y guárdelos a -20 °C durante un máximo de 3 meses. Una vez descongelado, deseche cualquier solución restante. No vuelva a congelar.

4. Preparación de la solución de resazurina y almacenamiento

  1. Disuelva la resazurina a una concentración final de 0,01% o 0,02% en agua destilada. Filtre la solución a través de un filtro de 0,2 μm para esterilización.
  2. Almacene la solución de resazurina esterilizada a 4 °C durante un máximo de 1-2 semanas, protegida de la luz para evitar la degradación.

5. Preparación de la placa REMA

NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener una guía visual sobre la configuración de la placa de microtitulación REMA de 96 pocillos. La placa de 96 pocillos proporciona espacio suficiente para realizar ensayos de fármacos por duplicado para cada fármaco en seis diluciones dobles.

  1. Añadir caldo 7H9-S: Con una pipeta multicanal, añadir 100 μl de caldo 7H9-S a las columnas 2-11, filas B-G. Asegúrese de que la distribución sea uniforme en todos los pozos.
  2. Agregue soluciones farmacológicas: Agregue 100 μL de la solución INH de trabajo a los pocillos B2 y B6. Del mismo modo, agregue las soluciones de trabajo MOX, DEL y BDQ a sus respectivos pozos (B3 y B7, B4 y B8, B5 y B9).
  3. Diluir las concentraciones del fármaco: Con una pipeta multicanal, realice diluciones en serie dobles de las filas B a G (columnas 2-9), asegurándose de descartar los 100 μl finales después de mezclar en la fila G.
  4. Pocillos de control de crecimiento: Agregue 100 μL de caldo 7H9-S a los pocillos B10 y C10 para el control del crecimiento.
  5. Controles negativos y de esterilidad: Agregue 200 μL de caldo 7H9-S a los pocillos B11 y C11 para que sirvan como controles negativos y de esterilidad.
  6. Evite la evaporación: agregue 200 μL de agua destilada estéril a todos los pocillos exteriores para minimizar la evaporación durante la incubación.
  7. Placas de inoculación: Inocular cada pocillo con 100 μL de la suspensión de cultivo diluido 1:10, excepto el pocillo de control negativo. Asegurar una inoculación uniforme en todos los pocillos.
  8. Sellar e incubar: Sellar las placas en bolsas de plástico para mantener la esterilidad e incubar a 37 °C durante 7 días.

6. Ensayo de valoración de tablero de ajedrez REMA

NOTA: Consulte la Figura 2A, B para obtener una guía visual sobre la plantilla de ensayo de titulación de tablero de ajedrez REMA para combinaciones de fármacos (p. ej., BDQ y DEL).

  1. Diluir medicamentos vertical y horizontalmente: Diluya el primer medicamento (BDQ) verticalmente (filas B-H) y el segundo medicamento (DEL) horizontalmente (columnas 2-8) para generar varias combinaciones de dos medicamentos.
    NOTA: Prepare la solución de trabajo diluida en serie en un vial estéril (de 4 μg/ml a 0,06 μg/ml) para un fármaco que se diluya horizontalmente.
  2. Agregue solución de trabajo BDQ para dilución vertical: Agregue 100 μL de la solución BDQ de trabajo a los pocillos B2 y B8.
  3. Añadir caldo 7H9-S: Con una pipeta multicanal, añadir 50 μl de caldo 7H9-S a las columnas C2-H8. Asegúrese de que la distribución sea uniforme en todos los pozos.
  4. Diluir las concentraciones del fármaco: Con una pipeta multicanal, realice diluciones dobles de las filas BH (columnas 2-8), asegurándose de descartar los 50 μl finales después de mezclar en la fila H.
  5. Agregue solución de trabajo DEL para dilución horizontal: Agregue soluciones de trabajo diluidas en serie de los medicamentos de 4 μg/ml a 0,06 μg/ml a los pocillos correspondientes.
  6. Pocillos de control de crecimiento: Agregue 100 μL de caldo 7H9-S a los pocillos B9 y C9 para el control del crecimiento.
  7. Controles negativos y de esterilidad: Agregue 200 μL de caldo 7H9-S a los pocillos B10 y C10 para que sirvan como controles negativos y de esterilidad.
  8. Placas de inoculación: Inocular cada pocillo con 100 μL de la suspensión de cultivo diluido 1:10, excepto el pocillo de control negativo. Asegurar una inoculación uniforme en todos los pocillos.
  9. Sellar e incubar: Sellar las placas en bolsas de plástico para mantener la esterilidad e incubar a 37 °C durante 7 días.

7. Incubación e interpretación de los resultados

  1. Tinción con resazurina: Después de 7 días de incubación, agregue 30 μL de resazurina (0,01%-0,02%) a cada pocillo. Selle e incube la placa durante la noche para que desarrolle el color.
  2. Interpretar el cambio de color.
    1. Examine los pozos visualmente bajo luz blanca constante o iluminación equilibrada con luz diurna.
      NOTA: El control del crecimiento (sin fármaco) debe volverse azul a rosa, lo que indica un metabolismo bacteriano activo. Un color azul indica una inhibición completa del crecimiento. El rosa denota crecimiento activo, mientras que el púrpura (un tono mixto) representa una inhibición parcial.
    2. Compare la intensidad del color con el control negativo (solo medios) y el control positivo (crecimiento bacteriano sin fármaco) para una interpretación precisa. Para minimizar el sesgo del observador, utilice lecturas independientes duales o fotografía de placa.
      NOTA: El juicio visual puede variar según las condiciones de iluminación ambiental, por lo que es esencial una iluminación constante.
  3. Concentración inhibitoria mínima (CIM)
    1. Defina la CMI como la concentración más baja de fármaco en la que el pocillo permanece completamente azul, lo que indica una inhibición del ≥99% de la actividad metabólica. Considere los pozos que muestran un color púrpura o rosa indicativo de crecimiento parcial o completo.
      NOTA: La determinación de la CMI por REMA se aproxima a los principios del método clásico de proporción, en el que la CMI se considera la concentración más baja que inhibe el ≥99% del inóculo en relación con el control libre de fármacos. Si bien REMA no utiliza recuentos de UFC, el punto final visual representa un correlato fenotípico de este umbral basado en proporción. Esta interpretación se alinea con los protocolos colorimétricos previamente establecidos11,14.

8. Cálculo del índice de concentración inhibitoria fraccional (FIC)

NOTA: El índice de concentración inhibitoria fraccional (FIC) ayuda a determinar la interacción entre dos fármacos (sinergia, antagonismo o indiferencia). Se calcula en base a los valores de MIC obtenidos del ensayo de tablero de ajedrez.

  1. Identifique la CMI para cada fármaco solo: A partir del ensayo REMA, determine la CMI para cada fármaco cuando se usa individualmente.
  2. Identifique la CMI para cada fármaco en combinación: A partir del ensayo de titulación de tablero de ajedrez, identifique la CMI de cada fármaco cuando se usa en combinación con el segundo fármaco.
  3. Calcule el FIC para cada medicamento.
    NOTA: Consulte la Tabla 2 para ver las fórmulas utilizadas para calcular el FIC y el índice FIC. La Tabla 3 muestra la CMI consolidada basada en el ensayo REMA. En el Cuadro 4 se muestran los valores representativos de los índices MIC y FIC.
    1. Interprete el índice FIC de la siguiente manera:
      FIC ≤ 0.5: Indica sinergia: los medicamentos trabajan juntos para inhibir el crecimiento de manera más efectiva que cualquiera de los medicamentos solos.
      FIC > 0,5 a < 4,0: Indique la aditividad: el efecto combinado es igual a la suma de los efectos individuales.
      FIC ≥ 4.0: Indica antagonismo: las drogas interfieren con la actividad de las demás.
  4. Ejemplo: Calcular el índice FIC para BDQ y DEL en H37Rv
    1. Determinar la CMI de BDQ para H37Rv (por ejemplo, 0,125 μg/ml). En combinación con DEL, registre la CMI de BDQ como 0,03 μg/ml.
    2. Determine la CMI de DEL para H37Rv (p. ej., 0,063 μg/ml). En combinación con BDQ, registre la CMI de DEL como 0,125 μg/ml.
    3. Calcular FIC para BDQ:
      FIC(BDQ) = CMI de BDQ en combinación/CMI de BDQ solo = 0,03 / 0,125 = 0,24
    4. Calcule FIC para DEL: FIC (DEL) = MIC de DEL en combinación / MIC de DEL solo = 0.125 / 0.063 = 1.98
    5. Sume ambos FICs para obtener el Índice FIC:Índice FIC = FIC(BDQ) + FIC(DEL) = 0.24 + 1.98 = 2.26
    6. Interpreta el resultado.
      NOTA: Un índice FIC de 2,26 se encuentra dentro del rango de interacción aditiva (>0,5 a <4,0), lo que indica que la combinación de BDQ y DEL tiene un efecto aditivo sobre la inhibición del crecimiento de M. tuberculosis.

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Resultados

Determinación de la CMI de los fármacos antituberculosos mediante el ensayo REMA
Las actividades de bedaquilina, delamanida, moxifloxacina e isoniazida se evaluaron utilizando REMA contra H37RV sensible a los medicamentos y aislado clínico resistente a los medicamentos de M. tuberculosis. La bedaquilina, la delamanida y la isoniazida se usaron en el rango de concentración de (1 μg/ml a 0,03 μg/ml) y la moxifloxacina estuvo en el intervalo de (2 μg/ml a 0,06 μg/ml). Las suspensiones bacteriana...

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Discusión

La amenaza mundial que representa la tuberculosis resistente a los medicamentos (TB-DR) se ha convertido en un problema apremiante 1,19. Esto ha creado una necesidad urgente de desarrollar métodos mejorados y rápidos para las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos (DST), particularmente para los medicamentos antituberculosos de segunda línea y más nuevos. Dichos métodos son esenciales para mejorar las estrategias de tratam...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Frasco cuadrado de 250 ml con tapónSchott Duran218203655Preparación de medios
Caldo 7H9Becton Dickinson271310Medios de crecimiento para M. tuberculosis (temperatura ambiente)
Placa de 96 pocillos con tapaCorning3596Microplacas tratadas con TC de poliestireno transparente de fondo plano de 96 pocillos, envueltas individualmente, con tapa, estériles (temperatura ambiente)
ART-Tips (1000 μ L)TARSON528106Filtros de polietileno hidrófobo con  Punta de filtro en gradilla de polipropileno-estéril (temperatura ambiente)
ART-Tips (200 μ L)TARSON528104Filtros de polietileno hidrófobo con  Punta de filtro en gradilla de polipropileno-estéril (temperatura ambiente)
Cloruro de bario dihidratoMerck217565Preparación estándar de McFarland (temperatura de ambiente)
Bedaquilina (BDQ)Jansen y JansenRegalo de Jansen y JansenFármaco antituberculoso (4 °; C)
CasitoneBecton Dickinson225930Suplemento para cultivo bacteriano (temperatura ambiente)
Delamanid (DEL)Productos farmacéuticos OtsukaRegalo de Otsuka PharmaceuticalsFármaco antituberculoso (4 °; C)
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich67-68-5Preparación de existencias de medicamentos (temperatura de la habitación)
Filtro 0.2 μ mMilliporeSLGVR33RS0.22  μ m PVDF, desechable, filtro de jeringa estéril (temperatura ambiente)
GlicerolMerck356350Añadido a los medios de cultivo (temperatura de la habitación)
Asa de inoculaciónSigma-AldrichI8263Para la preparación de la suspensión de cultivos (temperatura de ambiente)
Isoniazida (INH)Sigma-AldrichI3377-5GFármaco antituberculoso (4 °; C)
LJ medio InclinadoBD Mycobactosel221414Medios de crecimiento para M. tuberculosis (4 ° C)
Botella McCartney Bijou de boca estrecha, 14 mlSupertek12.124.0014Para la preparación de la suspensión de cultivos (temperatura de ambiente)
Botella McCartney Bijou de boca estrecha, 7 mlSupertek12.124.0007Para la preparación de la suspensión de cultivos (temperatura de ambiente)
Micropipetas (1000 μ L)GilsonF144059MPara una manipulación precisa de líquidos (temperatura ambiente)
Micropipetas (200 μ L)GilsonFA10005MPara una manipulación precisa de líquidos (temperatura ambiente)
Moxifloxacina (MOX)Sigma-AldrichSML1581-50 MGFármaco antituberculoso (4 °; C)
Pipeta multicanal (20– 200 μ L)VWR849070024Para pipeteo simultáneo entre pocillos
OADCBecton Dickinson211886Suplemento para cultivo bacteriano (4 ° C)
Rellenos de pipetasMerckZ333980Para una manipulación precisa de líquidos (temperatura ambiente)
Sal sódica de resazurinaSigma-Aldrich62758-13-8Indicador redox para ensayos REMA (temperatura de sala)
Pipetas serológicas, 10 mlCorningCLS4100Se utilizaron pipetas desechables estériles de poliestireno (temperatura ambiente)
Perlas de vidrio macizo, diámetro 6 mmSigma-AldrichZ265950Para la preparación de la suspensión de cultivos (temperatura de ambiente)
Ácido sulfúrico 95– 97%Merck100731Preparación estándar de McFarland (temperatura de ambiente)
Jeringas para filtroFurgoneta Dispo100032Para usar con filtros de jeringa
Mezclador de vórticeREMICM-101 PLUSPara la preparación de la suspensión de cultivos
Bolsa de polietileno con cierre superiorSigma-AldrichZ162949

Referencias

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