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Inoculación intradérmica de Mycobacterium avium en el oído de ratón

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DOI:

10.3791/67675

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3 de julio de 2025

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1Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children's Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of Washington School of Medicine, 3Department of Global Health, University of Washington

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para realizar una inoculación intradérmica de dosis baja de Mycobacterium avium en el oído de un ratón para reflejar condiciones similares a la exposición.

Resumen

A diferencia de las exposiciones o infecciones naturales de micobacterias no tuberculosas (NTM) cuya patología se basa en un organismo de replicación lenta, la infección por aerosol en un modelo de ratón puede causar una proliferación elevada de crecimiento bacteriano en los pulmones. Las infecciones crónicas por aerosoles y sistémicas pueden tratarse con fármacos antimicobacterianos, que también podrían reflejar una exposición previa, pero estos procedimientos son largos y menos representativos de las exposiciones naturales. El objetivo de este protocolo es desarrollar un modelo de ratón menos invasivo de condiciones similares a la exposición a NTM que sean más traslacionales. Aquí, describimos un método para desafiar intradérmicamente a ratones preclínicos a través del tejido del oído utilizando Mycobacterium avium (M. avium) para imitar una exposición y permitir respuestas inmunes a las bacterias sin enfermedad obvia. En este artículo, describimos el método de inyección intradérmica en el oído y confirmamos la presencia de infección micobacteriana sostenida y contenida, lo que brinda más oportunidades para interrogar las respuestas inmunes en este modelo in vivo .

Introducción

Las micobacterias no tuberculosas (MNT) son una lista cada vez mayor de especies que incluyen un subconjunto de bacterias patógenas que a menudo son difíciles de tratar 1,2. La MNT se puede encontrar en fuentes ambientales como el suelo, el agua y los aerosoles de agua 3,4,5. A pesar de las tendencias reportadas que sugieren un aumento de las infecciones por NTM, como grupo, se reportan de manera rutinaria en menos de 20 estados en los EE. UU.6,7. Los individuos con comorbilidades específicas, incluidas las personas con fibrosis quística o las personas que toman medicamentos inmunosupresores, tienen un mayor riesgo de infección productiva con especies patógenas de NTM2. Sin embargo, se presume que las personas sanas tienen exposiciones repetidas y continuas a la MNT a través de fuentes ambientales sin que ello provoque infecciones graves o crónicas. Existe cierta evidencia de que la exposición a NTM puede "precondicionar" la respuesta inmunitaria general a los antígenos micobacterianos en las vacunas8, los resultados después de la exposición a otras micobacterias y las pruebas diagnósticas9, pero hasta la fecha, el modelado preclínico de este tipo de exposición ha sido difícil.

Las infecciones pulmonares crónicas10 y los tratamientos que se aprovechan para los estudios de eficacia de vacunas específicas para patógenos no representan exposiciones ambientales relativamente inocuas, y las presumiblemente diferentes respuestas inmunitarias resultantes. Las infecciones crónicas, por ejemplo, pueden inducir un daño severo en el tejido y una enfermedad diseminada10. Ha habido un impulso reciente para abordar esta brecha de investigación, incluido un modelo de ratón que proporciona exposición a NTM a través del agua potable, del laboratorio Henao-Tamayo11, donde se interrogó más a fondo la respuesta inmune a esta exposición. La tuberculosis latente (TB) es otro estado patológico de la infección por micobacterias que ha sido difícil de modelar en animales preclínicos. El laboratorio de Kaufmann fue pionero en infecciones intradérmicas del oído con M. tuberculosis en ratones C57BL/612 y NOS2-/-13 para imitar la infección de tuberculosis latente, la reactivación y caracterizar los mecanismos de los granulomas hipóxicos. Nemeth et al. aprovecharon el modelo de oído intradérmico contenido para imitar la exposición previa a M. tuberculosis, caracterizando distintas respuestas inmunitarias, con el fin de determinar cómo esto afectaba a los resultados posteriores del desafío14. El modelo de oreja intradérmica se ha reportado con éxito utilizando 104 unidades formadoras de colonias (UFC) de las cepas H37Rv y Erdman de M. tuberculosis , pero hasta la fecha, no se ha probado con aislados de NTM.

El objetivo general de este método es establecer un modelo de provocación auditiva NTM reproducible que limite la enfermedad causada por otras vías de provocación y que pueda estudiarse más a fondo en relación con la respuesta inmunitaria a la exposición. La exposición de ratones C57BL/6 susceptibles a altas dosis de M. avium en el agua potable da lugar a más condiciones similares a la infección que las exposiciones11. Por lo tanto, la justificación para el desarrollo de esta técnica incluye el éxito previo en el uso de M. tuberculosis como un organismo de desafío para la dermis del oído con una dosis de desafío relativamente más alta 12,13,14. Aquí, nuestro objetivo fue evaluar si el modelo se puede adaptar con éxito para un aislado de M. avium a la mitad de la concentración bacteriana previamente reportada 12,13,14 (102 UFC). Esperamos que el avance de nuevos modelos de exposición a NTM, y no de infección, ayude a abordar las preguntas biológicas pendientes sobre esta influencia en la salud y la dinámica futura de infección/vacunación.

Protocolo

Las hembras C57BL/6 se compraron en un laboratorio de suministros de modelos de investigación a las 6-7 semanas de edad. Los ratones se alojaron en las instalaciones de bioseguridad de nivel 2 (BSL-2) del Seattle Children's Research Institute (SCRI) en condiciones libres de patógenos y se manejaron de acuerdo con protocolos experimentales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del SCRI. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes con respecto al bienestar animal. El instituto opera bajo el Certificado USDA #91-R-0061 y PHS Assurance #A4337-01. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de reservas bacterianas para la inoculación

  1. En una cabina de bioseguridad propicia para el trabajo con bacterias, retire un vial de Mycobacterium avium (ATCC 25291) del almacenamiento a -80 °C y descongele a temperatura ambiente.
    NOTA: Las concentraciones de existencias de M. avium se determinan de antemano, como mejor práctica con todos los materiales madre, mediante la siembra de diluciones en serie en placas de agar 7H10 y el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC).
  2. Con una aguja de punta roma de 26 G, vuelva a suspender la muestra madre pasando el líquido hacia arriba y hacia abajo por la jeringa de 1,0 ml 10 veces o más para crear una suspensión uniforme.
  3. Comprobar la concentración de M. avium mediante la siembra de 100 μL de diluciones en serie 1:10 de la suspensión en placas de agar 7H10. Incubar las placas durante 3 semanas a 37 °C y contar las colonias para garantizar que las concentraciones de inóculo sean precisas.
  4. Ajustar la concentración de M. avium a la dosis preferida diluyendo la muestra con PBS estéril. Manténgalo a temperatura ambiente hasta que esté listo para usar.
    NOTA: En este experimento, se utilizaron 102 UFC por dosis de 10 μL.

2. Preparación y anestesia de animales

  1. Antes de administrar anestesia, prepare una superficie caliente, como una almohadilla térmica, en la que se puedan mantener las jaulas de los ratones inoculados en un esfuerzo por regular su temperatura corporal durante la recuperación.
  2. Inyecte el cóctel de ketamina (100 mg/mL) y xilacina (20 mg/mL) en ratones por vía intraperitoneal.
  3. Una vez anestesiados, realice un pellizco en el dedo del pie para confirmar que los ratones están suficientemente anestesiados para las manipulaciones del procedimiento.
  4. Aplique el lubricante ocular bilateralmente.

3. Plataforma de inoculación y preparación de materiales

  1. Use un tablero de espuma para crear una repisa en la que el mouse pueda estabilizarse mientras lo manipulan.
    NOTA: La cinta adhesiva de doble cara ayudará a sujetar la oreja a la plataforma en una orientación plana. El adhesivo no debe ser demasiado fuerte para preservar la salud del tejido auditivo.
  2. Coloque una lupa iluminada para ver la plataforma.
  3. Reúna una jeringa Hamilton estéril y una preparación de M. avium que funcione a mano.

4. Inoculación de la dermis del oído

  1. Coloque el mouse en posición supina sobre la repisa de tal manera que la oreja se pueda colocar en cinta adhesiva de doble cara.
  2. Use una presión suave para aplanar la oreja sobre la cinta y asegúrese de que la oreja no se mueva.
    NOTA: Se pueden usar toallitas con alcohol en los oídos antes de la inyección para ayudar a limitar la contaminación cruzada y la infección con los comensales de la piel después de la infección. Sin embargo, tales infecciones no se han observado en estudios piloto sin el uso de toallitas con alcohol.
  3. Extraiga 10 μl de preparado de M. avium que contenga 100 UFC en la jeringa Hamilton estéril.
    NOTA: Agite la suspensión de M. avium antes de extraer un volumen de 10 μL para asegurarse de que sea homogéneo.
  4. Sostenga la plataforma en una mano y la jeringa Hamilton en la otra, asegurándose de que el lado biselado de la aguja esté apuntando hacia arriba (Figura 1).
  5. Coloque la jeringa Hamilton debajo de la dermis del oído con una presión muy ligera. Asegúrese de que la aguja no atraviese completamente el tejido delgado del oído.
  6. Una vez que la aguja esté en su lugar, presione el émbolo de la jeringa a un ritmo gradual y lento.
  7. Observe el color de la oreja durante la administración.
    NOTA: La administración exitosa aparecerá como una elevación opaca en el sitio de la inyección, como una burbuja.
  8. Una vez que la dosis esté completamente administrada, revise la oreja del ratón y la cinta adhesiva para ver si hay signos de fuga.
    NOTA: Si se produce una fuga, se puede administrar una dosis perdida estimada en el oído opuesto. Como mínimo, se marcará y registrará que el animal puede haber recibido una dosis inferior a la objetivo.
  9. Cuando la dosis sea exitosa, asegúrese de que el ratón se coloque de nuevo en su jaula doméstica para exponerlo a la superficie caliente mientras se lo monitorea hasta que se haya despertado con éxito de la anestesia.

5. Evaluación de la carga bacteriana

  1. Eutanasiar a los animales de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
    1. Aquí, la eutanasia se completa con un mínimo de dos métodos por sacrificio. Para este procedimiento, los dos métodos elegidos son el uso de la asfixia por CO2 y la luxación cervical.
    2. Primero, extienda un tubo para dispensar gas CO2 en la jaula de casa de los ratones y administre el gas hasta que no haya más signos de movimiento de los ratones. Tenga cuidado de usar una jaula que no permita que el gas se escape.
    3. A continuación, disloque las vértebras cervicales mediante manipulación manual.
  2. Diseccionar las orejas de los animales desafiados con M. avium cuatro semanas después de la exposición (28 días, coincidiendo con estudios previos12). Disecciona los oídos de 2 ratones con herramientas estériles. Inserte las orejas en tubos cónicos que contengan tampón CFU (PBS + 0,05% Tween80) y use un homogeneizador de tejidos para homogeneizar hasta que se forme una suspensión uniforme. Las orejas no desafiadas también se procesan y sirven como controles.
    NOTA: Se pueden utilizar todos los puntos de tiempo y órganos de interés posteriores a la exposición. Para este experimento, también se recolectaron el pulmón, el bazo, el ganglio linfático drenante y los órganos cerebrales.
  3. Agregue 100 μL de homogeneizado a 700 μL de tampón CFU en un bloque de pocillo profundo como una dilución de 1/8 de vez. Repita a lo largo del bloque para que se generen un mínimo de 5 diluciones en serie. Añadir 50-100 μL de homogeneizado puro o diluciones en serie (aquí se utilizan las diluciones 0 a 5) a las triplacas de agar 7H10, distribuidas uniformemente con esparcidores en T, e incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 2-3 semanas.
  4. Cuente las unidades formadoras de colonias (UFC) y transfórmelas enlog 10 con fines de análisis en un software de hoja de cálculo.

Resultados

Utilizamos el protocolo detallado anteriormente para determinar si se podía establecer un modelo de desafío NTM reproducible utilizando la dermis del oído como vía de infección o exposición. Las mazorcas se recolectaron de dos animales a los 28 días después del desafío, se homogeneizaron y se colocaron en placas como se describe en los medios 7H10 selectivos de micobacterias. Observamos que M. avium persistió hasta 28 días en las orejas que fueron desafiadas intradérmicamente y una ausencia de M. avium en la oreja no desafiada (Figura 2).

Si bien no observamos diseminación al oído no desafiado a los 28 días después de la infección, otros que utilizaron este modelo de dermis del oído para el modelado de TB latente han observado diseminación a otros sitios de órganos distales14. Planteamos la hipótesis de que una dosis más baja de provocación y el uso de aislado de M. avium pueden reducir la diseminación a puntos temporales posteriores que pueden reflejar mejor la exposición frente a la infección crónica. Por lo tanto, la eutanasia se realizó en cohortes de ratones desafiados con M. avium n = 5 a los 28, 56, 90 y 132 días después de la infección. Se homogeneizaron los siguientes órganos con el mismo protocolo descrito para los tejidos del oído: pulmón, bazo, ganglio linfático drenante (DLN) y cerebro. Esta vía de desafío dio lugar a una diseminación esporádica a lo largo del tiempo, en la que menos de la mitad de los animales demostraron UFC contables en los órganos analizados 56 o 90 días después de la infección (Tabla 1). A los 132 días después de la provocación con cáncer, todos los ratones tenían M. avium detectable en el bazo (n = 5/5 animales evaluados), pero parecían albergar un mínimo (n = 1/5 en DLN) o ninguna bacteria (n = 0/5 en pulmones o cerebro) en otros órganos en este punto de tiempo (Tabla 1).

figure-results-1
Figura 1: Orientación de una aguja con el lado bisel hacia arriba. Antes de la inserción de la aguja, el lado del bisel debe estar hacia arriba para administrar correctamente el inóculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Colonización del tejido del oído por M. avium 28 días después del desafío. Los ratones hembra C57BL/6 fueron desafiados en el oído con 102 UFC de Mycobacterium avium. La oreja desafiada (+) se comparó con la oreja no desafiada (-) a los 28 días, n = 2 animales individuales de un solo experimento mostrado, con cada animal en un color y símbolo diferente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tiempo (día)Registro de órgano10 UFC
PulmónBazoDLNCerebro
283.08, ND, ND, ND, ND2.81, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0.78, 0.90, ND, ND, ND
562.30, ND, ND, ND, ND1.53, 3.43, ND, ND, ND2.78, ND, ND, ND, ND1.20, ND, ND, ND, ND
90ND, ND, ND, ND, ND0.60, 3.35, 3.26, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0.60, ND, ND, ND, ND
132ND, ND, ND, ND, ND4.03, 3.58, 3.58, 4.03, 3.692.41, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND
DLN = ganglio linfático drenante, ND = no detectado

Tabla 1: Diseminación de M. avium desde la oreja a lo largo del tiempo después del desafío. Los pulmones, el bazo, el ganglio linfático de drenaje (DLN) y el cerebro se recolectaron de n = 5 ratones por punto de tiempo después del desafío. Los tejidos homogeneizados se sembraron y se evaluó el crecimiento bacteriano. Las UFC de órganos se presentaron como logaritmo10 valores transformados donde se contaron las bacterias y no se detectaron (ND) donde no se observaron UFC a ninguna concentración plateada. Datos de curso de tiempo representativos de un experimento.

Discusión

Aquí hemos demostrado cómo desafiar de forma reproducible a ratones con micobacterias en un modelo de oído intradérmico contenido. Es vital, al realizar este procedimiento, seguir las precauciones de esterilidad y evitar lesiones por pinchazos con agujas. Con este método de inoculación, es fundamental contar con una estación de configuración adecuada y una buena iluminación para garantizar que el espacio de la dermis se dirija y no se perfore por completo a través del oído. Si eso sucede, dependiendo del estudio, se puede hacer un segundo intento en el otro oído. Las orejas no tratadas dentro del mismo mouse también se pueden usar como control por mouse. Este método debe ser accesible para los investigadores con necesidades mínimas de equipo o tiempo. Dedicar ratones y tiempo al entrenamiento ayuda a la tasa de éxito de la inoculación del protocolo. Los errores más comunes en esta técnica son no entrar en el espacio intradérmico con la jeringa (y perforar el oído) o presionar la jeringa demasiado rápido, lo que provoca una entrega inconsistente o el deslizamiento de la aguja del espacio intradérmico. Una buena iluminación y aumento pueden ayudar a posicionar correctamente la aguja para la inoculación.

Estamos aprovechando la metodología para las condiciones de "exposición" de NTM. La gran mayoría de M. avium se encuentra dentro del oído o DLN. Sin embargo, una limitación de esta metodología es que se observó diseminación a los órganos sistémicos, concretamente al bazo, en todos los animales evaluados a los 132 días post-desafío. Puede haber un umbral de inoculación bacteriana que podría reducir la cantidad o la frecuencia de diseminación, lo que podría lograrse con un estudio de titulación. Este procedimiento es susceptible de modificar tanto el organismo, por ejemplo, otras especies de MNT, como la dosis administrada, dependiendo de la pregunta de investigación.

El comportamiento humano (falta de tratamiento adecuado de agua potable, contaminación, tabaquismo), el aumento del número de personas con una salud deteriorada debido a los15 años y otras comorbilidades, la falta de pruebas diagnósticas adecuadas y el cambio climático16 pueden desempeñar un papel en el aumento de las tasas de infecciones por MNT, y es probable que esta tendencia aumente en un futuro próximo. Proponemos que modelos como la administración de mucosas a través del agua potable11 o las infecciones de oído intradérmicas con MNT en ratones brindan la oportunidad de determinar qué influencia tendrá esta exposición creciente en la vacunación posterior y la eficacia de la vacuna. Aunque hemos adaptado esta metodología de un modelo de oreja confinada para M. avium, proponemos que puede ser utilizada con éxito para otras especies de MNT como técnica de exposición.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores expresan su gratitud al comprometido personal del vivero por su excepcional cuidado de los animales a lo largo de este estudio. Los autores también desean agradecer al Laboratorio Henao-Tamayo de la Universidad Estatal de Colorado por compartir la cepa de M. avium utilizada en este estudio. Los autores desean agradecer a los miembros de los laboratorios Aderem y Urdahl del Seattle Children's Research Institute por su formación en la metodología original. Este proyecto ha sido financiado en su totalidad o en parte con fondos federales del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, los Institutos Nacionales de Salud, el Departamento de Salud y Servicios Humanos, bajo el Contrato No. 75N93021C00029 (al RNC), y Subvenciones R01AI125160 y R01AI183642 (al RNC y al SLB).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de 0,05% Tween80SigmaP6224
de 1 mlFisher15-823-434
7H10 agar triplacasMoltox21-40S234
26G aguja romaFisherNC0981254
Cabina de bioseguridadNuaireNU-543-400
CO2 incubadoraFisher Scientific15-103-0513
Cinta adhesiva de doble caraScotch3136
Jeringa de microlitros Hamilton 701NFisher14-824-16
Puntas omnidireccionales de tejido duroFisher15-340-102
Almohadilla térmicaKent ScientificHTP-1500
Aguja de insulinaFisherNC1551333
KetaminaPatterson Veterinary07-890-8598
Lupa iluminadaBrightechB07MMZ27QK
PBSThermoFisher10010072
Homogeneizador de tejidosOmniTH115
Soporte de homogeneizador de tejidosOmniS1000
XilacinaPatterson Veterinary07-808-1947

Referencias

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