Metodología mejorada para la administración de líquido al pulmón de ratón: intubación mediante un otoscopio de consumo

Resumen

Este protocolo presenta cómo la posición óptima de un ratón y la inserción de un otoscopio basado en una cámara por vía transoral permite la visualización de la glotis, una intubación rápida con un traumatismo tisular mínimo y un suministro constante de líquido a los pulmones.

Resumen

El suministro constante de líquidos, incluidas las posibles terapias, a los pulmones es fundamental para modelar la enfermedad pulmonar y el desarrollo terapéutico preclínico. Sin embargo, los métodos actuales utilizados en ratones, como la aspiración orofaríngea por el método de extracción de la lengua, pueden resultar en un parto variable. Aquí, describimos el uso de un otoscopio iluminado asequible, conectado a un teléfono móvil, para visualizar la glotis y permitir la inoculación directa en la vía aérea. Detallamos una técnica de puesta en escena optimizada con ayudas adecuadas a la iluminación y al posicionamiento. También se describe cómo se puede llevar a cabo la intubación de forma fiable utilizando un catéter flexible de 20 G con o sin luz de fibra óptica. Esta técnica reduce en gran medida la varianza en la administración intrapulmonar y aumenta el volumen del líquido administrado que llega a los pulmones. Debido a la variación reducida, se pueden utilizar cohortes de animales más pequeñas cuando se emplea este método en lugar de la instilación orofaríngea mediante el método de tracción de la lengua. Lo que sigue es un método para la intubación efectiva, rápida y consistente de ratones y la administración a los pulmones, incluida la confirmación sólida de la colocación del tubo endotraqueal. Con esta metodología mejorada, la intubación consistente y segura y la administración replicable y eficiente a los pulmones están al alcance de la mano.

Introducción

A nivel mundial, las enfermedades respiratorias son la principal causa de muerte entre los niños menores de 5 años y son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en adultos¹. En 2021, la infección por SARS-CoV2 fue la tercera causa de muerte en los EE. UU.². Los modelos murinos se utilizan a menudo para estudiar enfermedades pulmonares, como el asma, la neumonía, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la fibrosis pulmonar. Casi todos estos modelos requieren la administración de agentes líquidos a los pulmones. Esto se puede hacer mediante canulación directa de la tráquea (generalmente bajo visualización directa utilizando una técnica quirúrgica de corte), administración intranasal o aspiración orofaríngea mediante el método bien establecido de extracción de la lengua ^3,4,5. Sin embargo, todas estas técnicas tienen inconvenientes. La formación de tejido cicatricial después de la técnica de corte quirúrgico hace que sea inapropiada para estudios que requieren la administración repetida de agentes en el pulmón, y las dos últimas técnicas pueden conducir a una administración pulmonar variable. Además, cuando se utiliza el método de tracción de la lengua, el traumatismo tisular de la lengua puede ser pronunciado, y la eficiencia de la entrega depende del investigador que realiza el procedimiento, ver Figura 1.

Figura 1: La intubación guiada y la instilación IT dan como resultado una mejor administración al pulmón y una menor variabilidad en comparación con el tirón de la lengua. (A) Tres investigadores diferentes administraron 50 μL de tinta china diluida por tirón de la lengua, el método establecido para la administración orofaríngea (OP). Dos investigadores también administraron tinta al pulmón mediante intubación, como se describe. (B) Los pulmones se extrajeron 1-4 h después del parto y se fotografiaron con un aumento de 2x. Las fotografías se evaluaron para determinar si había área teñida, utilizando ImageJ. (n=6 (intubación) o 9 (administración de OP), resultados de 2 o 3 réplicas independientes realizadas por 2 -3 investigadores diferentes, p<0,0001 Prueba T de Welch) (C) La variabilidad en la administración pulmonar también se calculó como una desviación porcentual de la media. La administración de la OP fue mucho más variable. (p = 0.0317, prueba T de Gales, GraphPad Prism 10.2.3 todas las estadísticas y gráficos) (Se utilizaron ratones macho y hembra C57BL/6J, tenían ~ 10 semanas de edad). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La anatomía murina hace que la intubación sea difícil y requiera mucho tiempo. La boca es pequeña y el tejido bucal puede obstruir la visión de la rima glotidis⁶ por parte de un investigador. Además, las cuerdas vocales son muy pequeñas y puede ser difícil verlas, ya que se encuentran cerca de la base de la lengua. Por último, la confirmación de la correcta colocación del tubo endotraqueal es difícil, ya que el pequeño volumen corriente a menudo no logra empañar un espejo⁷. Estas dificultades han fomentado una serie de técnicas innovadoras para intubar ratones. Estos métodos mejorados incluyen el uso de un laringoscopio neonatal y un alambre para avanzar un catéter en la tráquea ^8,9, el uso de una fuente de luz de fibra óptica para guiar y endurecer el catéter^10,11 y el uso de una transmisión de video en vivo⁶. Más recientemente, el uso de un otoscopio clínico ha ayudado en la intubación orotraqueal¹². Otros han empleado la transiluminación para visualizar la glotis e intubar ratones ^7,13,14. Sin embargo, estos métodos tienen muchas desventajas. El uso de agentes depilatorios en el cuello del ratón y la proximidad del animal a una fuente de luz caliente hacen que la transiluminación sea un enfoque menos que ideal. El uso de la aguja dentro del catéter o la inserción de instrumentos afilados en la boca significa que algunos métodos para endurecer el catéter ponen a los animales en un riesgo excesivo. Finalmente, hacer una incisión sobre la tráquea para confirmar la ubicación presenta desventajas significativas, incluida la necesidad de esterilidad y la acumulación de tejido cicatricial. Hasta este punto, la instilación intratraqueal por intubación ha demostrado ser demasiado difícil para una adopción generalizada¹⁵ y los avances en el desarrollo metodológico han permanecido aislados y no utilizados por muchos laboratorios¹⁵. Otros estudios se han centrado en la elección del anestésico durante el parto, encontrando que la ketamina puede tener ventajas sobre el isoflurano⁵. Sin embargo, el isoflurano, al no ser una sustancia controlada y desaparecer rápidamente al finalizar el procedimiento, presentó beneficios atractivos, por lo que hemos utilizado esta forma de anestesia optimizando otros aspectos de esta metodología^16,17.

El método que describimos supera los desafíos de visualización que otros han intentado abordar, mitiga los riesgos para los animales de experimentación, disminuye el tiempo necesario para instilar pequeños volúmenes intratraquealmente a través de un tubo endotraqueal, aumenta el volumen de líquido que llega al pulmón y ofrece un método mejorado para la confirmación de la colocación del tubo endotraqueal. El uso de un soporte de suspensión, manos de ayuda magnéticas (pinzas de cocodrilo en brazos flexibles asegurados a una base) e iluminación más brillante permiten a un investigador individual realizar una entrega intratraqueal eficiente. La visualización se facilita utilizando un otoscopio "en casa" con conectividad WIFI. Este dispositivo es más asequible que los instrumentos de intubación comerciales. Además, la conectividad WIFI permite una transmisión de video simultánea en un dispositivo portátil (como un teléfono móvil), lo que lo hace adecuado para el entrenamiento. La intubación puede utilizar una fuente de luz de fibra óptica enhebrada a través de un catéter flexible (PTFE) de 20 g x 1" (sin aguja) o el catéter sin la luz. La profundidad se controla mediante dos métodos: la adición de una cuña de seguridad para la intubación (un protector cónico en el catéter) y la observación de la profundidad en la transmisión de video. La colocación del tubo endotraqueal se confirma utilizando el "método de la burbuja" para visualizar el volumen corriente con mayor claridad que el método tradicional de niebla de espejo¹⁸. Esto es menos estresante para el animal que depender de la obstrucción traqueal para modificar la urgencia respiratoria¹⁰ para confirmar la colocación. El uso combinado de un tubo de extensión acoplado al catéter para confirmar el éxito de la intubación (en lo sucesivo denominado método de la burbuja), simplificado de Watanabe et. Al⁷, y un videootoscopio de consumo en un solo procedimiento hace que la intubación sea un método práctico para la administración terapéutica al pulmón y una clara mejora del método de extracción de la lengua (ver Figura 1). Si busca un método confiable, consistente y asequible para la administración de líquidos no quirúrgicos en los pulmones de ratón, especialmente sin el uso de sustancias controladas (como la ketamina) o equipos costosos, el siguiente método puede ser ideal.

Protocolo

Es imperativo que estos procedimientos sean revisados y aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC), que figura en el protocolo, y que se consulte al personal veterinario antes de proceder. La IACUC de nuestra institución aprobó el protocolo antes de comenzar el experimento y revisó el contenido del video antes de su presentación. Se recibió apoyo y capacitación a través del Departamento de Medicina Comparativa de Tulane para garantizar el más alto nivel de atención para todos nuestros animales de laboratorio.

1. Configurar

NOTA: Consulte la Figura 2 para ver la configuración.

Figura 2: La estación utilizada para la intubación guiada se prepara como se muestra. De izquierda a derecha: pipetas para la administración, tubo de burbujas para confirmar la colocación adecuada del tubo endotraqueal, pinzas, espátula, espéculo nasal pediátrico (discutido pero no necesario para este procedimiento), manos amigas, luz de aumento, soporte de ratón con cono nasal, sonda de fibra óptica, cámara de inducción de anestesia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Limpie la cuña de seguridad provista con el kit de intubación con una almohadilla de preparación de isopropanol. Deslice la cuña de seguridad limpia (verde en el vídeo) sobre la cánula flexible de 20 g y deseche la aguja suministrada de forma segura.
   NOTA: El kit de intubación para roedores (Tabla de Materiales) utilizado incluye cuñas de seguridad para la intubación. Se trata de pequeñas fundas cónicas que se ajustan a un catéter flexible de 20 G x 1 pulgada. Evitan que el catéter dañe la carina.
2. Reúna las otras herramientas necesarias, incluido un teléfono móvil, un otoscopio comercial, un soporte para mouse con un cono nasal, pinzas dobladas finamente dentadas, el tubo endotraqueal preparado (a partir de 1.1) y la luz de fibra óptica si lo usa. Limpie todo esto con almohadillas de preparación de isopropanol antes de usar.
3. Tome aproximadamente 20 cm de tubo flexible. Dóblalo en forma de U, añade una conexión de bloqueo Luer en un extremo y asegúralo con una brida. Agregue 200-300 μL de agua filtrada estéril o tinta china al tubo. A partir de ahora, este conjunto se denomina "tubo de burbuja".
4. Haga un bucle de sutura atando ~ 13 cm de sutura de seda trenzada tamaño 0 en un círculo. Coloque este lazo en la parte superior del soporte y asegúrese de que ambos lados de la sutura estén asegurados y que el soporte esté limpio. Coloque el soporte del mouse encima de la base metálica de la luz de aumento. Coloque las manos amigas alrededor de donde estará la boca del ratón.
   NOTA: Muchos proveedores fabrican soportes intercambiables (ver Tabla de Materiales), y uno se puede hacer dentro del laboratorio a bajo costo ^4,7,14. Se utilizó sutura de seda trenzada tamaño 0 para suspender al animal. Sin embargo, se ha descrito el uso de otros materiales para el mismo fin ^4,13.
5. Coloque un ratón en la cámara de inducción de anestesia. Utilice un caudal constante de_O2 a 0,8 L/min y un 2% de isoflurano. Anestesiar al animal lo suficiente (ver nota) para que no se despierte durante la colocación del cono de la nariz. No suprima significativamente la frecuencia respiratoria del ratón. Las respiraciones regulares ayudan a la apreciación de las cuerdas vocales.
   NOTA: La frecuencia respiratoria del ratón debe ser normal. Este criterio se utiliza para establecer la profundidad adecuada de la anestesia. Esto puede variar entre animales y puede superar las 200 respiraciones/min. Como tal, no es práctico ni necesario contar las respiraciones o usar un pellizco en los dedos de los pies.
   PRECAUCIÓN: Este procedimiento puede ser abortado cuando sea necesario. Sin embargo, los animales no deben permanecer en la cámara de inducción más tiempo del estrictamente necesario.
6. Conecte el otoscopio a un teléfono móvil y asegúrese de que la transmisión de video sea estable.
   PRECAUCIÓN: Para minimizar la exposición de los investigadores al isoflurano durante este procedimiento, use un respirador químico si realiza múltiples intubaciones o capacitación en este método. Alternativamente, realice el procedimiento en una campana extractora.

2. Puesta en escena de animales

1. Tan pronto como el primer animal esté dormido, retírelo de la cámara de inducción, córtelo y coloque sus dientes superiores a lo largo de la sutura. Aplique una ligera tensión al animal para mantener la posición de la sutura mientras recuesta el ratón en el soporte.
   NOTA: En promedio, los animales son anestesiados durante un total de 2 minutos, incluida la inducción. Esto disminuye en gran medida el riesgo para el animal, elimina la necesidad de lubricación oftálmica y evita la acumulación de saliva. Esfuércese por mantener a los animales sedados durante el menor tiempo posible.
2. Ajuste el ángulo del cuello ligeramente hacia atrás (colocando el cuello en una extensión menor, 5°-15°). Empuje suavemente el cono de la nariz sobre las narinas. No empuje el cono hacia abajo con firmeza, ya que puede interferir con la sutura, suspendiendo el ratón.
3. Agarre firmemente la lengua lo más cerca posible del labio inferior, usando pinzas grandes dobladas finamente dentadas. Tire de él hacia abajo y aléjelo de los dientes superiores hacia un lado de los dientes inferiores.
   PRECAUCIÓN: La tracción prolongada, la tensión excesiva o el aplastamiento de la lengua pueden comprometer la salud del animal. Vigile la lengua en busca de signos de traumatismo (hematomas, sangrado, hinchazón o desecación) y, si se observa, aborte el procedimiento y avise al personal veterinario.
4. Si usa manos amigas, sostenga las pinzas en esta posición. Dependiendo de la experiencia y la agudeza visual del investigador, una lupa iluminada puede ayudar a posicionar al animal de manera adecuada.
5. Alimente la luz de fibra óptica (si se usa) a través del catéter flexible con la cuña de seguridad para intubación (verde en el video) en su lugar.
   NOTA: No asegure el cable de fibra óptica a la fuente de luz con demasiada fuerza. Empujar demasiado fuerte dificulta la eliminación de la luz mientras se deja el tubo endotraqueal en su lugar.

3. Apreciación visual de las cuerdas vocales e intubación

1. Con el otoscopio en la mano no dominante, presiónelo ligeramente sobre la lengua. Luego, inclina la cámara y su fuente de luz para visualizar las cuerdas vocales cerca de la base de la lengua.
   NOTA: Ligeras variaciones en la anatomía y el color de los tejidos pueden dificultar la orientación. Utilice el movimiento asociado con la respiración para confirmar la identificación estructural.
2. Con la luz de fibra óptica encendida (si se usa), alimente la cánula a lo largo de la parte superior del otoscopio, haciendo un ligero contacto con la base de la lengua o la parte del labio del otoscopio como referencia. Apáguelo hasta la boca del ratón entre la paleta blanda y el borde del otoscopio.
   NOTA: Si no se está utilizando la luz de fibra óptica, el "tubo de burbujas" descrito en el paso 4 se puede conectar al catéter en esta etapa. Para esta modificación del procedimiento, es necesaria una iluminación brillante y enfocada en la boca del ratón.
3. Ajuste el ángulo de aproximación para que el catéter sea muy poco profundo. Inmediatamente después de insertar el catéter (menos de 1 mm más allá de las cuerdas vocales), eleve la punta del catéter, de modo que quede casi paralela a la mesa de trabajo. Esto evita que la epiglotis fuerce el catéter dorsalmente hacia el esófago. Especialmente durante el entrenamiento, cuando se tiene dificultad, o al principio de la experiencia, el uso de la transmisión de video es invaluable para colocar el tubo endotraqueal entre las cuerdas vocales.
   NOTA: La producción de saliva no obstruye la visualización de las cuerdas vocales mientras se realiza este procedimiento. Sin embargo, el uso de un aplicador de algodón con punta de lanza para eliminar la saliva obstructiva es descrito, en publicaciones previas, al intubar ratas¹⁹. Este método puede resultar útil si la saliva se convierte en un problema.
   1. Si encuentra resistencia, retire inmediatamente el catéter y permita que la respiración vuelva a la normalidad. Si se observa sangrado, consulte al personal veterinario.
      NOTA: Casi no debe haber resistencia al avanzar el catéter.

4. Confirmación de la colocación del tubo endotraqueal

1. Confirme visualmente que el tubo endotraqueal está en la ubicación correcta con el otoscopio. Además, asegúrese de la correcta colocación del tubo teniendo en cuenta que la tráquea proporciona menos resistencia durante la colocación que el esófago. Observe que en la posición adecuada, el tubo endotraqueal está ~5 mm más allá de las cuerdas vocales. Busque la luz de la fuente de fibra óptica que brilla a través de la piel del cuello para validar nuevamente que la ubicación es correcta.
   NOTA: La cuña de seguridad para intubación debe evitar que el tubo endotraqueal se inserte demasiado lejos. La cuña de seguridad evita el traumatismo en la carina; sin embargo, no tiene por qué impedir el avance. Debe usarse como una característica de seguridad y la profundidad óptima suele ser menos profunda de lo permitido por la cuña.
2. Luego, mientras sostiene el tubo endotraqueal en su lugar, retire la luz de fibra óptica. Asegúrese de que el catéter esté colocado correctamente utilizando el "método de la burbuja" (que se detalla a continuación) en lugar de empañarse en el espejo.
3. Recupere el tubo de burbujas preparado en el paso 1.3. Prepáralo con anticipación al procedimiento y reutilízalo para todos los animales.
   ATENCIÓN: Los 200-300 μL de agua o tinta en el tubo de burbujas nunca deben aspirarse. Para evitar esto, asegúrese de que el líquido esté lejos de la cerradura Luer.
4. Con el tubo endotraqueal en su lugar, asegure el tubo de burbujas en su lugar con el bloqueo Luer. El volumen corriente debe ser inmediatamente evidente. De lo contrario, el tubo endotraqueal está fuera de lugar. Retíralo rápidamente y permite que vuelva la frecuencia respiratoria normal del ratón.
   PRECAUCIÓN: Colocar mal el catéter en el esófago comprimirá la tráquea, impidiendo una respiración suficiente. El extravío suele ir acompañado de dificultad para respirar (incluyendo una contribución apreciable de los músculos intercostales) y/o una disminución drástica de la frecuencia respiratoria. Además, la canulación del esófago puede provocar un espasmo muscular que dificulta la intubación posterior; Por este motivo, aconsejamos el uso de varios animales durante el entrenamiento.

5. Parto intratraqueal

PRECAUCIÓN: Al igual que el método de extracción de la lengua para el parto orofaríngeo, el parto a través de la intubación corre el riesgo de ahogar al animal. En ratones adolescentes y adultos, 50 μL es un volumen generalmente seguro de líquido para administrar y es suficiente para extenderse por los pulmones.

1. Si usa una jeringa para la administración: Separe el tubo de burbujas y el bloqueo Luer del catéter, conecte una jeringa deslizante Luer cargada y presione el émbolo para administrar el volumen deseado (50 μL como máximo).
2. Si utiliza una pipeta para la administración: Pipetee el volumen deseado (50 μL como máximo) directamente en el catéter y permita que el ratón inhale la solución.
   NOTA: Si está capacitando, considere usar un indicador como tinta china diluida y filtrada o azul de metileno.
3. Para asegurar el suministro difuso a los pulmones, enjuague el líquido suministrado en los pulmones con hasta 500 μL de aire²⁰. Esto se puede hacer utilizando una jeringa de bloqueo Luer precargada de 0,5 ml o una pipeta P1000 equipada con una punta de filtro, ambas de las cuales han demostrado ser fiables. Si se desea, se pueden realizar múltiples depresiones de la pipeta sin riesgo de aspiración negativa del líquido suministrado.
   PRECAUCIÓN: Si inocula al animal utilizando este método, considere disminuir la concentración de inóculo debido al aumento de la eficiencia de la administración en relación con la aspiración orofaríngea o la administración intranasal.
   NOTA: Puede ser necesario el uso de más del volumen corriente (~200 μL) al enjuagar el inóculo con aire. Sin embargo, el uso de 500 μL no conlleva el riesgo de barotrauma, ya que es solo aproximadamente la mitad de la capacidad vital²¹. Los ratones adultos tienen una capacidad de reserva inspiratoria de aproximadamente ~800 μL, por lo que incluso si el ratón ha inspirado inmediatamente antes del lavado, el barotrauma no ocurre²¹. Considere si los volúmenes más bajos de lavado de aire podrían adaptarse a sus necesidades para la distribución del inóculo (se han sugerido 100-200 μL).

6. Evaluación de la entrega

NOTA: Esto se hace solo si uno está entrenando o practicando el procedimiento.

1. Sacrificar al animal de manera humanitaria de acuerdo con el protocolo aprobado por IACUC. Aquí se empleó la asfixia por CO₂ como método primario de eutanasia y la luxación cervical como método confirmatorio de eutanasia.
2. Abra la pared torácica y extraiga los pulmones. Para ello, abre el peritoneo, accediendo al diafragma desde el lado caudal y punturándolo con unas tijeras pequeñas donde se pueda ver el corazón. Esto hará que los pulmones se retraigan y den más espacio para abrir la cavidad torácica cortando las costillas.
   NOTA: Si se requiere perfusión para reducir la sangre en los pulmones, realice el procedimiento a través del ventrículo derecho del corazón en esta etapa.
3. Enjuague los pulmones brevemente con 1 mL de PBS estéril después de extraerlos. Colóquelos planos sobre una superficie blanca (como una esponja quirúrgica) para exponer el área máxima mientras mantiene la posición relativa del lóbulo.
4. Fotografiar los pulmones ex vivo (usamos un teléfono móvil), abrir las imágenes en ImageJ y cuantificar las áreas manchadas y no manchadas trazando el contorno del frente del tinte. Cuantifique el área teñida con un investigador independiente ciego para evitar sesgos.
   NOTA: Si se utiliza luminiscencia y el IVIS, como se muestra en la Figura 3, se deben realizar imágenes en vivo in vivo en lugar del Paso 6.

Resultados

Como se observa en la Figura 1 y la Figura 3, la inoculación intrapulmonar mediante el método tradicional de extracción de la lengua (administración orofaríngea) dio lugar a una distribución de tinta irregular e irregular y a una mayor variabilidad entre los investigadores. Por el contrario, la instilación IT después de la intubación condujo a un parto más consistente tanto en el pulmón derecho como en el izquierdo y fue menos variable (Figuras 1C y Figura 3D). En los pulmones de los animales a los que se les administró tinta por aspiración orofaríngea con tirón de la lengua, la tinta es sutil y solo está presente cerca de las grandes vías respiratorias de los animales (Figura 1A). Por el contrario, cuando se utilizó la intubación guiada para administrar la tinta, se extendió mucho más en el tejido, marcando un área mucho mayor de los pulmones. Cuando se comparó el área de la superficie pulmonar teñida por la tinta entre métodos, el método de intubación demostró ser muy superior al tirón de la lengua (Figura 1B). La variabilidad en la cantidad de tinta suministrada también fue drásticamente menor en la condición de intubación (Figura 1C). El aumento del área pulmonar manchada y la menor variabilidad en la cantidad de líquido que llega a los pulmones sugieren fuertemente que la administración de IT es superior a la extracción de la lengua.

Como se observa en el Video 1, los endoscopios tradicionales (tal como se han publicado anteriormente) tienen una distancia focal demasiado larga, para apreciar las cuerdas vocales y guiar la colocación del tubo endotraqueal ^6,19. Por el contrario, las imágenes de vídeo tomadas con un otoscopio de consumo (Figura S1 y marcas de tiempo: 6:34 y 7:05 en el vídeo) tenían una resolución mucho mejor, lo que mejoró la visualización de la glotis.

Este método de intubación incluye múltiples verificaciones de la colocación del tubo en la tráquea. El volumen corriente del ratón fue fácilmente evidente cuando se utilizó el método de la burbuja (Figura S2 y marca de tiempo: 8:25) y actúa como una garantía final de que cualquier líquido suministrado ingresará a los pulmones.

Para evaluar aún más la varianza de los dos métodos de administración, evaluamos la expresión de transgenes en el tejido pulmonar después de que los ratones fueron inoculados con 1 x 10¹¹ vg de AAV6.2-luciferasa utilizando los dos métodos diferentes (instilación orofaríngea por el método de extracción de la lengua o administración intratraqueal después de la intubación guiada). Siete días después de la administración del vector, se tomaron mediciones de luminiscencia utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS) (Figura 3A). A continuación, calculamos la radiación media en ambos pulmones. 10 minutos antes de la toma de imágenes (exposición de 30 s), se les inyectó (por vía subcutánea) 200 μL de luciferina (15 mg/mL). Como se muestra en la Figura 3B, los animales que recibieron el vector por instilación orofaríngea tenían una señal luminiscente que se distribuyó ampliamente tanto en el tórax como en la región nasal. Por el contrario, los animales a los que se les administró el vector por administración intratraqueal mediante intubación guiada mostraron luminiscencia concentrada en los pulmones. La radiación promedio en los animales intubados fue sustancialmente mayor en comparación con el parto orofaríngeo, lo que indica una mejor eficiencia en el suministro de vectores a los pulmones y una disminución de la variabilidad en el parto, calculado utilizando la diferencia de la media (Figura 3C y Figura 3D).

Los resultados positivos del método de intubación fueron la instilación replicable de hasta 50 μL en los pulmones del ratón (realizada en la Figura 1 y la Figura 3), con distribución difusa en todo el pulmón (como se evidencia en la Figura 1) y no en otras áreas (como las vías respiratorias superiores/nariz como se ve en la Figura 3).

Cualquier daño causado al animal, estrés excesivo, reducción del volumen de líquido que llega a los pulmones, mala distribución del inóculo en los pulmones o necesidades de entrenamiento prolongadas habrían constituido un resultado negativo, pero no ocurrió.

Video 1: Una vista endoscópica tradicional de la orofaringe y las cuerdas vocales del ratón está desenfocada y es difícil de usar de manera efectiva. La distancia focal de 3 cm de este endoscopio hace que las cuerdas vocales y la orientación sean difíciles de apreciar. Lengüeta en la parte inferior izquierda. Haga clic aquí para descargar este video.

Figura 3: La intubación produce una mayor entrega al pulmón con menos variabilidad en relación con la aspiración de P.O. (A) Ratones hembra BALB/c de 6 a 10 semanas de edad se dosificaron con 1x10¹¹ vg de AAV6.2-luciferasa (Penn Vector Core), luego se evaluaron con imágenes bioluminiscentes in vivo (IVIS) 7 días después. 10 minutos antes de la obtención de imágenes (exposición de 30 s), se les inyectó (por vía subcutánea) 200 μL de luciferina (GoldBio, 15 mg/mL). (Creado con biorender.com) (B) Imágenes representativas de IVIS de ratones que recibieron AAV6.2-luciferasa por aspiración OP (tirón de la lengua, izquierda) o administración IT (intubación, derecha). Las regiones de interés tienen el mismo tamaño y el resplandor promedio dentro de la región se muestra en la imagen. (C) Cuantificación de la señal de luciferasa en ratones de aspiración OP (n=7) frente a intubación (n=5). p<0.0001 por la prueba t de Welsh no apareada con después de la transformación logarítmica de los datos brutos de luciferasa. (D) Desviación de la media como porcentaje de la radiancia media media. (p=0,0381, prueba T de Welsh) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura S1: Se muestran imágenes de ejemplo del otoscopio de consumo utilizado en el protocolo descrito para la intubación guiada (izquierda) y un endoscopio de costo y disponibilidad similares (derecha). Nótese las claras diferencias de enfoque entre las imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S2: Una imagen de ejemplo que muestra el tubo de burbujas en uso. El volumen corriente mueve rápidamente la gota en el tubo de burbujas varios centímetros. La gotita se mueve muy poco si el tubo está en el esófago. La frecuencia respiratoria y el volumen corriente podrían estimarse mediante este método. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura S3: Un conjunto de iluminación básico que elimina la necesidad de comprar un costoso kit de iluminación de fibra óptica. Se empujó una aguja de 20 G a través de un cable cónico de fibra óptica de 0,75 mm de 50 mL, se compró a bajo precio (y a granel) y se cortó a medida (~ 1 m) con una cuchilla de afeitar y se pegó con cinta adhesiva en su lugar. No era necesario asegurar el catéter en su lugar debido al ajuste perfecto del cable de fibra óptica. Asegurar la tapa cónica sobre la linterna de un teléfono móvil da como resultado una transducción de luz suficiente para realizar la intubación en una habitación oscura. Este montaje disminuye aún más los costes asumidos por un laboratorio que incorpora esta técnica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La intubación y la instilación intratraqueal son los mejores métodos para la administración de líquido al pulmón, pero los abundantes desafíos presentados por la anatomía murina han impedido la adopción generalizada en los laboratorios de investigación pulmonar¹⁵. Aunque garantiza la administración eficiente de un inóculo al pulmón, una posible desventaja de la administración de IT mediante esta y otras técnicas de intubación es la derivación de la vía aérea superior. La administración intranasal es un método comprobado que no evita las vías respiratorias superiores. A pesar de que la administración intranasal se utiliza a menudo en los laboratorios de virología pulmonar y puede ser más eficaz en algunos casos²², no refleja la vía de exposición natural²³ para algunos agentes aspirados, da lugar a cantidades más variables de inóculo en el pulmón²⁴ y es menos eficaz cuando se utiliza isoflurano como anestésico⁵. Por lo tanto, se ha realizado un amplio trabajo sobre los aparatos de aerosolización y su comparación con otras técnicas de administración pulmonar²⁵, pero estos métodos presentan riesgos asociados a los aerosoles y tienden a ser costosos. Todas estas dificultades han llevado a la instilación orofaríngea por tirón de la lengua²⁶, siendo el método preferido para la administración de líquido pulmonar en muchos laboratorios. Como hemos demostrado, este método es mucho más variable que la instilación intratraqueal después de la intubación. Además, la administración por el método de tracción de la lengua no se puede evaluar durante la administración, y se puede causar un traumatismo excesivo en la lengua del ratón debido a la tensión necesaria para evitar la deglución. La lengua también se mantiene en la técnica de intubación guiada e instilación IT. Sin embargo, debido a que la transmisión de video muestra glotis, un investigador que utilice nuestro método no necesita forzar la posición laríngea colocando una tensión significativa en la lengua. Esta disminución de la tracción causa menos trauma tisular. Sin embargo, a pesar de las considerables ventajas que presenta la intubación y la instilación de TI, los desafíos se han interpuesto en el camino de su uso en algunos laboratorios. Por ejemplo: la compresión de la tráquea debido a una canulación errónea del esófago puede obstruir la respiración y aumentar la mortalidad; La inserción del tubo endotraqueal demasiado profundo puede provocar daños en la carina o en los bronquios principales; Y, por último, la intubación murina por métodos tradicionales lleva mucho tiempo, por lo que es poco práctica para la mayoría de los investigadores que buscan un parto intrapulmonar fiable. Nuestro método aborda las dificultades asociadas a la intubación en ratones, incluso superando las barreras anatómicas para la intubación de ratones.

Se han propuesto varios métodos para superar los desafíos anatómicos de la intubación murina mediante la implementación de ayudas visuales. Por ejemplo, se ha propuesto el uso de un endoscopio tradicional⁶. Sin embargo, la gran profundidad focal del instrumento no es adecuada para ser utilizada para la intubación murina (Figura S1). Esto también es evidente en el video 1, donde se pueden ver las cuerdas vocales pero están borrosas. Los otoscopios clínicos también se han utilizado para la laringoscopia directa¹². Sin embargo, el costo de los otoscopios clínicos y la falta de una transmisión de video los hacen inaccesibles para la mayoría de los laboratorios y no son adecuados para la capacitación. El uso de un otoscopio de consumo ampliamente disponible ha mejorado en gran medida la practicidad de la intubación guiada. La distancia focal más corta, el cuerpo más pequeño y el labio depresor extendido permiten una transmisión de video más clara, una mejor maniobrabilidad y posicionamiento, y el labio del otoscopio se puede usar para aplicar presión en la base de la lengua, lo que mejora el acceso a la rima glotidis. Más allá de estas ayudas visuales, la transiluminación también se ha utilizado para visualizar con éxito la glotis e intubar ratones ^7,13,14. Sin embargo, los enfoques basados en la transiluminación pueden requerir agentes depilatorios en el área que recubre el cuello del ratón, proximidad a una fuente de luz caliente, uso de la aguja dentro del catéter, inserción de instrumentos afilados en la boca del ratón y/o se debe hacer una pequeña incisión sobre la tráquea para confirmar la colocación. El método descrito aquí evita estos riesgos y se basa en los mejores aspectos de estos métodos publicados. Además de superar las barreras anatómicas para la intubación, en nuestro método se han tenido en cuenta consideraciones de costo.

Junto con el uso de manos amigas, un soporte para el ratón, el otoscopio y una luz de fibra óptica hacen que la intubación sea más fácil de aprender y mucho más rápida de realizar, a un costo reducido para los laboratorios. El costo del soporte de intubación disponible en el mercado se puede evitar utilizando uno hecho a mano²⁷. El costo del ensamblaje de luz de fibra óptica se puede sufragar comprando el cable de fibra óptica por separado (a un costo mucho menor, ~ $ 9 frente a $ 218-kent científicos- en el momento de escribir este artículo). Para completar la fuente de luz de fibra óptica, se puede usar una tapa cónica de 50 mL con un orificio y cinta adhesiva para recolectar la luz de la linterna de un teléfono móvil (consulte la Figura S3 y la Tabla de materiales). Das et. Al describir un dispositivo similar¹¹. Para algunos laboratorios, el costo reducido de esta solución puede hacer que nuestro método sea un procedimiento mucho más accesible. Más allá de los costos, la dificultad para confirmar la colocación del tubo endotraqueal ha hecho que la intubación de ratones sea desalentadora.

En el pasado, para confirmar que el tubo endotraqueal está colocado correctamente, los investigadores han confiado en el empañamiento del espejo sosteniendo un espejo dental sobre el tubo endotraqueal¹⁸. Sin embargo, el pequeño volumen corriente y las variaciones de la temperatura ambiente a menudo evitan el empañamiento de los espejos y conducen a errores de juicio. En el caso de la intubación murina, esto supone un grave riesgo de lesión. Otros han recurrido a inducir dificultad respiratoria mediante la obstrucción del tubo endotraqueal¹⁰. Esto causa un gran estrés al animal y proporciona menos información que el "método de la burbuja". Además, la introducción de terapias pulmonares y aire en el estómago debido a una confirmación inadecuada de la colocación del tubo endotraqueal puede causar angustia, además de obstaculizar la eficacia del agente administrado. El uso del "método de la burbuja" proporciona una confirmación visual más rápida y fiable de la colocación del tubo endotraqueal y es una ligera mejora con respecto a un método similar descrito anteriormente²⁸. El "método de la burbuja" también permite al investigador estimar de forma aproximada la frecuencia respiratoria y el volumen corriente del animal.

La posición de los animales y la visualización de las cuerdas vocales son clave en esta técnica. Descubrimos que los espéculos nasales pediátricos eran demasiado grandes y engorrosos para mantener la boca abierta y las mejillas fuera del camino durante la intubación, pero fueron muy útiles durante el entrenamiento, ya que permitieron al investigador demostrar la colocación del otoscopio. Guiar a un aprendiz para que reconozca la anatomía relevante es difícil, y la mejora de la visibilidad en la boca del ratón fue clave, lo que se vio significativamente favorecido por el uso del otoscopio comercial. La puesta en escena con una lupa iluminada y manos amigas son fundamentales para ayudar a los operadores inexpertos en la intubación, aunque pueden no ser tan críticos para los operadores experimentados.

Durante la capacitación en este método, puede ser necesario solucionar problemas. Si el tubo endotraqueal entra repetidamente en el esófago, la glotis puede haber espasmódico, el paladar blando puede estar inflamado y la colocación adecuada puede ser más difícil. En esta circunstancia, permita que el animal se recupere durante varios minutos antes de intentar la intubación nuevamente. El número de reintentos debe especificarse en el protocolo IACUC y cumplirse siempre. Si tiene problemas para ver las cuerdas vocales, es posible que la frecuencia respiratoria se suprima debido a un exceso de anestesia o que la posición del ratón sea inadecuada (lo más común es que la cabeza esté demasiado inclinada hacia atrás). En este caso, vuelva a colocar al animal y permita que se recupere de la anestesia antes de volver a intentarlo. El tubo de burbujas debe mostrar claramente el volumen corriente del animal. Si la burbuja se mueve solo ligeramente, los jadeos debidos a la presión ejercida sobre la tráquea por un tubo endotraqueal mal colocado pueden estar causando este movimiento. En este caso, consulte la Marca de tiempo: 8:25 y la Figura S3 para ver qué tan evidente es el volumen corriente cuando se usa el "tubo de burbujas" en un tubo endotraqueal colocado correctamente. Si el tubo endotraqueal está extraviado, retírelo inmediatamente y permita que el animal se recupere antes de volver a intentar el procedimiento.

Aunque la intubación y la instilación intratraqueal son muy superiores a otros métodos, han sido técnicamente demasiado difíciles para ser ampliamente adoptados. Los métodos descritos aquí hacen que la instilación intratraqueal y la intubación murina sean accesibles y prácticas. Aunque las aplicaciones futuras de esta técnica dependen en gran medida de lo que se administra a los pulmones y en qué contexto se les administra, un método fácil y confiable allana el camino para muchos avances en la biología pulmonar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Luz de Fibra ÓpticaiKit de Iluminación de Fibra Óptica, Ratón	Kent Scientific	ETI-12ETI-MSE-02	Un componente del conjunto de fibra óptica, compatible con otras luces y el cable de fibra óptica de repuesto debajo
Conjunto de fibra óptica alternativo	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	una alternativa, no discutida (pero no vemos ninguna razón por la que no funcione)
Ensamblaje de fibra óptica alternativo	Aparato	Harvard 72-9075	una alternativa, no discutida (pero no vemos ninguna razón por la que no funcione)
Ensamblaje de fibra óptica alternativo	hecho a mano por laboratorio	N/A	Instrucciones encontradas aquí usando un tapón de goma: DOI 10.3791/50318
Ensamblaje de fibra óptica alternativo	hecho a mano por laboratorio	N/A (materiales enumerados a continuación)	Hecho de una tapa cónica de 50mL, cinta y soporte de intubación de fibra óptica de 0.75mm
, ratón	Kent Scientific	ETI-MSE-01	Soporte ajustable para intubación, muchas versiones de fabricación propia disponibles, bastidores de puntas y plataformas de madera utilizadas, algunas alternativas enumeradas muchas alternativas adecuadas disponibles.
Soportes de intubación alternativos	Braintree Scientifuc	RIS 100	una alternativa, no discutida (pero no vemos ninguna razón por la que no funcione)
Soportes de intubación alternativos	Natsume Seisakusho	KN-1014	una alternativa, no discutida (pero no vemos ninguna razón por la que no funcione)
Soportes de intubación alternativos	Vetland	000A3467	una alternativa, no discutida (pero no vemos ninguna razón por la que no funcione)
Soportes de intubación alternativos	hechos a mano por laboratorio	N/A	Hecho de una carpeta de 3 anillos aquí: DOI 10.3791/60844 (varios métodos alternativos publicados)
Sutura de seda trenzada no absorbible, tamaño 0	Herramientas de ciencia fina	18020-00	cualquier longitud de más de 1 pulgada dañará la carina
Catéter intravenoso Safelet 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	O similar
RS-5358 Micro Pinzas de disección Fisher		RS-5358	O similar, incluye manos amigas
Lupa con luz y soporte, EOOKU Mano de ayuda magnética flexible, 5X& 10X 12V 108pcs LED Beads Lámpara de aumento, 3 modos ajustables Brazos giratorios de cuello de cisne y Placa base resistente	Amazon	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Flexible-Ajustable-Cuello de cisne /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSM gW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& palabras clave = lupa + vidrio + con + luz + EOOKU + 3 + en + 1 y qid=1709661 709& prefijo = lupa + + con luz + + eooku + 3 + en + 1% 2 Tapas %2C98 y sr = 8-5	O similar, cualquier pinza doblada finamente dentada funcionará
Eliminación de cerumen - Herramienta para eliminar cerumen con 8 piezas Juego de oídos - Limpiador de oídos con cámara - Kit de eliminación de cerumen con luz - Cámara de oído con cuchara para 6 oídos - Limpiador de oídos para iOS y Android (Negro)	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- Removed-Remover-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& psc=1	o similar, varias marcas disponibles
Cable de fibra óptica de extremo de plástico PMMA AZIMOM 0.75mm(0.02in) 100m(328ft)/Rollo para techo de cielo estrellado Todo tipo de luz LED Driver Driver Source	Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastic-Cuttable-Ceiling-1pcs0-00 98in328ft/dp/B07WC9JV5N/ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY.AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& palabras clave=fibra%2Boptic%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th = 1	O similar, la fibra se usa para construir el dispositivo en la línea 7
Cell Treat	de tubo cónico de 50 ml	229421	cualquier tapa cónica de plástico opaco de 50 ml debería funcionar. No entra en contacto ni se acerca mucho al animal, por lo que no necesita esterilidad
Isoflurano	VetOne		Veternary
Innoculum	N/A	Específico para su experimento
Puntas de pipeta (filtro)	N/A	Filtro estéril p100 y p1000 puntas utilizadas	Marca/Proveedor no relevante
Cámara de inducción	N/A	Según esté disponible en su institución	Marca/Proveedor no relevante
Almohadillas de preparación de isopropanol	N / A	para limpieza de instrumentos	Marca / proveedor no relevante
Tubería	N/A	La tubería flexible de diámetro pequeño funcionará	Para la construcción de "tubos de burbujas" (el nuestro tiene ~ 3 mm de diámetro y fue tomado de una vía intravenosa)
Luer lock	N/A	para adaptarse a su tubo de arriba	Para la construcción de un respirador de
media máscara 3M	3M	17-986-9B	para limitar la exposición al gas
Twist Tie	N/A	N/A	para mantener la forma de U del tubo de burbujas