Este protocolo describe el cultivo, la recolección y la concentración de las proteínas secretadas de Mycobacterium tuberculosis. Las proteínas filtradas de cultivo (CFP) se cuantifican, se separan en 20 fracciones mediante enfoque isoeléctrico y se resuelven en 30 fracciones utilizando un SDS-PAGE preparativo y un sistema de electroelución.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Separación y fraccionamiento de proteínas filtradas de cultivo (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteínas secretadas de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) desempeñan un papel crucial en la patogénesis de la tuberculosis, la modulación inmunitaria y la progresión de la enfermedad. Comprender su composición y función es esencial para identificar nuevos biomarcadores que puedan ayudar en el diagnóstico de la tuberculosis, el desarrollo de vacunas y las intervenciones terapéuticas. Este estudio se centra en el aislamiento, fraccionamiento y caracterización sistemáticos de proteínas filtradas de cultivo (CFP) para permitir análisis inmunológicos y proteómicos exhaustivos. Los CFP se obtuvieron de cultivos H37Rv de M. tuberculosis cultivados en condiciones químicamente definidas para garantizar una expresión controlada de proteínas. El sobrenadante del cultivo se purificó mediante filtración y se concentró utilizando un sistema de fibra hueca para retener las proteínas por encima de 10 kDa. El fraccionamiento se logró mediante enfoque isoeléctrico en fase líquida, separando las proteínas en función de sus puntos isoeléctricos en 20 fracciones distintas. Se realizó una resolución adicional mediante electroforesis preparativa en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), seguida de electroelución, obteniendo 30 fracciones proteicas. Las proteínas fraccionadas obtenidas a través de este enfoque proporcionan un recurso valioso para el perfil inmunológico y los análisis proteómicos basados en espectrometría de masas. Mediante el aislamiento y la caracterización sistemática de las proteínas secretadas, este estudio contribuye a la identificación de biomarcadores proteicos específicos de la tuberculosis, lo que podría mejorar la precisión diagnóstica y avanzar en nuestra comprensión de la patogénesis de M . tuberculosis .
Introducción
Una amplia investigación ha puesto de manifiesto el importante papel de las proteínas secretadas en el crecimiento y las interacciones inmunitarias de Mycobacterium tuberculosis1. El filtrado de cultivo de M. tuberculosis contiene una compleja gama de componentes proteicos y no proteicos, lo que lo convierte en un recurso valioso para comprender su biología y propiedades inmunogénicas. Los primeros estudios proteómicos identificaron casi 450 proteínas en el cultivo filtrado2, muchas de las cuales desempeñan un papel fundamental en la obtención de respuestas inmunitarias contra la tuberculosis. La identificación de estos antígenos inmunológicamente relevantes es esencial para el desarrollo de diagnósticos y vacunas innovadores contra la tuberculosis. Sin embargo, los avances en esta área se ven obstaculizados por la complejidad de la respuesta inmunitaria a la infección por M. tuberculosis y las limitaciones técnicas de los métodos de purificación bioquímica utilizados para aislar proteínas micobacterianas.
Se han empleado varias técnicas de separación para resolver las proteínas de M. tuberculosis, lo que facilita la detección de proteínas menores pero funcionalmente significativas y amplía el alcance de los estudios proteómicos. Un método de separación ideal resuelve eficazmente mezclas de proteínas complejas en un número limitado de fracciones distintas. Dos enfoques ampliamente utilizados para separar las proteínas micobacterianas son los métodos basados en cromatografía y electroforesis 1,2.
Las técnicas cromatográficas, como la afinidad, el intercambio iónico y la cromatografía de fase reversa, han sido la piedra angular del fraccionamiento de proteínas durante más de una década. Estos métodos han sido ampliamente utilizados para separar las proteínas de M. tuberculosis 3. Sin embargo, están limitados por factores como los bajos rendimientos proteicos y la interferencia de componentes no proteicos, lo que puede complicar los análisis inmunológicos posteriores. Estos inconvenientes restringen la utilidad de la cromatografía para identificar antígenos inmunológicamente relevantes.
Para abordar estas limitaciones, se adoptó un método de separación basado en electroforesis bidimensional. En la primera dimensión, las proteínas se separan en función de su enfoque isoeléctrico (IEF) utilizando un sistema IEF preparativo, que segrega las proteínas según sus puntos isoeléctricos. En la segunda dimensión, las proteínas se resuelven aún más por peso molecular utilizando SDS-PAGE preparativo, seguido de elución con un instrumento elutor de gel completo.
Este enfoque bidimensional ofrece varias ventajas. Reduce significativamente la complejidad de las proteínas filtradas de cultivo (CFP) al fraccionarlas en 600 fracciones distintas. Además, las fracciones son adecuadas para el análisis inmunológico directo, ya que el proceso de elución no introduce componentes que interfieran con los ensayos inmunológicos celulares 4,5,6.
Este protocolo detalla la preparación y separación de proteínas filtradas de cultivo para análisis inmunológico6.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis y preparación de proteínas filtradas de cultivo (CFP)
- Preparación del medio líquido de Sauton
- Combine los siguientes componentes en 950 mL de agua destilada: Glicerol, 30.0 mL; Ortofosfato de dihidrógeno potásico (KH2PO4), 0,5 g; Sulfato de magnesio, 0,5 g; Ácido cítrico, 2,0 g; Hidrolizado de caseína, 0,5 g; Sulfato de amonio férrico, 0,05 g; Glutamato de sodio, 4,0 g.
- Ajuste el pH a 7,2 utilizando hidróxido de potasio al 40% (aproximadamente 5 mL/L).
- Aumente el volumen a 1 L y autoclave a 15 psi durante 20 min.
- Preparación de la suspensión de micobacterias
- Transfiera las colonias de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) cultivadas en pendientes de Lowenstein-Jensen (LJ) a 2 mL de medio líquido de Sauton.
- Rompa los grupos de micobacterias agitando vigorosamente con perlas de vidrio en condiciones estériles.
- Iniciar el crecimiento de micobacterias
- Transfiera la suspensión bacteriana a una botella de McCartney que contenga 10 ml de medio líquido de Sauton.
- Incubar el biberón a 37 °C durante 2 semanas.
- Ampliación de la cultura
- Transfiera el cultivo cultivado a 200 ml de medio de Sauton en una botella de 1 l.
- Incubar en un agitador a 37 °C durante 4 semanas.
- Transfiera el cultivo en fase logarítmica a un matraz de 4 L que contenga 2 L de medio de Sauton.
- Cultive el cultivo a 37 °C en condiciones estacionarias durante 4 semanas adicionales hasta que se forme una película superficial.
- Recolección de las proteínas filtradas de cultivo (CFP)
- Coseche el cultivo por centrifugación a 1.000-1.500 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
- Filtrar el sobrenadante a través de un sistema de filtración al vacío de 0,45 μm.
- Concentrar el filtrado que contiene CFP utilizando un sistema de filtración de flujo tangencial con un corte de 10 kDa.
- Almacenamiento de la CFP cosechada
- Calcule el contenido de proteínas utilizando el kit de ensayo de BCA disponible en el mercado.
- Alicuente las proteínas, agregue azida de sodio hasta una concentración final de 0,2% y almacene a -80 °C.
2. Enfoque isoeléctrico preparativo en fase líquida (IEF)
- Preparación de la muestra de proteínas
- Solubilizar Mycobacterium tuberculosis CFP en 60 mL de tampón de separación IEF que contiene 8 M de urea, 1 mM de ditiotreitol (DTT), 5% glicerol, 2% digitonina, 2% anfolitos (pH 3,0-10,0 y pH 4,0-6,0 en una proporción de 1:4).
- Configuración del sistema IEF
- Llene la cámara del ánodo con ácido fosfórico 0,1 M y la cámara del cátodo con hidróxido de sodio 0,1 M.
- Ensamble la celda IEF preparatoria de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Realización de IEF
- Cargue hasta 350 mg de proteína en el sistema IEF.
- Proteínas de enfoque a 4 °C con un sistema de agua circulatoria de enfriamiento.
- Aplique una potencia constante de 12 W hasta que el voltaje se estabilice en aproximadamente 1400 V, luego continúe durante 30 minutos más.
- Recolección y análisis de las fracciones
- Cosechar las fracciones IEF y determinar su pH.
- Analice cada alícuota mediante SDS-PAGE y visualice las proteínas mediante tinción de plata.
3. SDS-PAGE preparativo y elución en gel completo
- Preparación de muestras para SDS-PAGE
- Mezcle fracciones IEF con tampón de muestra SDS-PAGE 6x disponible en el mercado.
- Calienta la mezcla a 95 °C durante 5 min.
- Ejecución de SDS-PAGE preparativa
- Cargue hasta 10 mg de proteína en un gel de poliacrilamida de 16 cm × 20 cm con un gel apilante al 4% y un gel resolutivo al 12,5%.
- Ejecute la electroforesis a una corriente constante de 50 mA hasta que el frente del tinte esté a 2 cm de la parte inferior.
- Proteínas eluidoras del gel
- Equilibrar el gel en tampón de elución (60 mM de Tris, 40 mM de CAPS, pH 9,4) durante 10 min.
- Transfiera el gel al instrumento elutor de gel completo.
- Eluir proteínas aplicando una corriente constante de 250 mA durante 1 h.
- Recolección y análisis de las fracciones
- Eluir las proteínas separadas en 30 fracciones individuales, cada una con un volumen de 2,5 mL.
- Determine la concentración de proteínas utilizando el método de estimación de proteínas BCA siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Analice 10 μg de proteína de cada fracción mediante SDS-PAGE y visualice mediante tinción de plata.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La Figura 1 ilustra la complejidad de las proteínas filtradas de cultivo (CFP) preparadas. Inicialmente, 100 μg de CFP se sometieron a un análisis PAGE 2D-SDS para evaluar su complejidad. Este análisis reveló la presencia de casi 100 puntos de proteína distintos en el CFP (Figura 1).
Las 20 fracciones recolectadas de cada corrida fueron analizadas por SDS-PAGE. De estas, en la Figura 2 se muestran tres fr...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Las proteínas filtradas de cultivo (CFP) de Mycobacterium tuberculosis representan una mezcla compleja de diversos componentes proteicos presentes en diferentes concentraciones. Los estudios proteómicos han identificado hasta 1.314 proteínas dentro de la CFP 4,5. Numerosas investigaciones han puesto de manifiesto el papel crucial de los CFP en la modulación de las respuestas inmunitarias. Específicamente, las CFP juegan ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ä Sistema de filtración de flujo tangencial KTA | CYTIVA | 29038437 | |
| Anfólitos (pH 3.0 a 10.0) | BIO-RAD | 1632094 | |
| Anfólitos (pH 4.0 a 6.0) | BIO-RAD | 1631143 | |
| Ensayo de proteína BCA | MERCK | 71285-M | |
| CAPS | MERCK | C2632 | |
| Hidrolizado de caseína | MERCK | 65072-00-6 | |
| Ácido cítrico | MERCK | C0759 | |
| Digitonina | MERCK | 300410 | |
| TDT | MERCK | D9779 | |
| Sulfato de amonio férrico | HIMEDIA | GRM10944 | |
| Glicerol | MERCK | G5516 | |
| Glicerol | MERCK | 252859 | |
| Lowenstein-Jensen inclina | HIMEDIA | SL001 | |
| Sulfato de magnesio | MERCK | M7506 | |
| Sistema de filtración al vacío de liberación rápida Millipore Stericup | MERCK | S2HVU11RE | |
| Ácido fosfórico | MERCK | 695017 | |
| Ortofosfato de dihidrógeno potásico | MERCK | P0662 | |
| Hidróxido de potasio | MERCK | 484016 | |
| Célula IEF preparativa (Rotofor) | BIO-RAD | 170-2986 | |
| Azida de sodio | MERCK | S2002 | |
| Glutamato de sodio | MERCK | 49621 | |
| Hidróxido sódico | HIMEDIA | MB095 | |
| Tris | MERCK | 252859 | |
| Urea | MERCK | U5128 | |
| Aparato de elute de gel completo | BIO-RAD | 1651250 |
Referencias
- Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
- de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
- Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
- Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
- Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
- Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
- Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
- Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
- Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
- Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
- Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
- Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
- Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
- Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
- Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
- Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
