Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

Resumen

Este protocolo separa las proteínas insolubles de la pared celular y la membrana en fracciones simples (1-5 proteínas) utilizando un enfoque isoeléctrico preparativo (IEF) basado en el punto isoeléctrico, seguido de una separación por peso molecular. Las fracciones resultantes se pueden utilizar directamente para análisis inmunológicos y proteómicos sin necesidad de una mayor purificación.

Resumen

Las proteínas de la pared celular y la membrana de Mycobacterium, que desempeñan un papel central en la patogénesis de la tuberculosis, se separaron con éxito mediante el enfoque isoeléctrico preparatorio (IEF) y la electroforesis preparativa en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Seguido de la elución en gel, superando las limitaciones de los métodos convencionales para la separación de proteínas hidrofóbicas. En este procedimiento, las colonias de M. tuberculosis se transfirieron de las inclinaciones de Lowenstein-Jensen a 2 ml de caldo 7H9, se dispersaron con perlas de vidrio y se incubaron a 37 ° C durante 2 semanas. Luego, el cultivo se amplió a 200 ml y se cultivó en un agitador durante 4 semanas. Se amplió aún más a 1 L con 500 ml de caldo 7H9 y se cultivó durante 4 semanas adicionales. Las micobacterias cultivadas se granularon por centrifugación a 1741 × g durante 30 min. Por cada gránulo de 2 g, se agregó 1 ml de tampón de ruptura y se sonicó la muestra. El lisado se centrifugó a 3436 × g durante 15 min para eliminar las células intactas, y se concentró el sobrenadante. Este sobrenadante (lisado de células completas) se centrifugó a 13751 × g durante 30 min para granular las proteínas de la pared celular. El sobrenadante restante se ultracentrifugó a 100.000 × g durante 4 h para separar la membrana celular y el citosol. Las proteínas aisladas de la pared celular y la membrana se cargaron en un sistema IEF preparatorio líquido a 4 °C y se separaron a 12 W hasta que el voltaje se estabilizó a 1400 V, lo que separa 20 fracciones. Estas fracciones de IEF se separaron aún más mediante SDS-PAGE preparativa, y las proteínas se eluyeron utilizando un elutor de gel completo a 250 mA, lo que dio como resultado 30 fracciones. A través de este protocolo, pudimos identificar nuevas paredes celulares de M. tuberculosis y biomarcadores específicos de membrana, y también muestra potencial para caracterizar proteínas similares en otros patógenos.

Introducción

Los estudios inmunológicos han demostrado que, además de las proteínas solubles, que son fáciles de purificar, la respuesta inmune humana a patógenos como M. tuberculosis también se dirige a la proteína hidrofóbica presente en la pared celular¹ y las proteínas de la membrana celular² de Mycobacterium tuberculosis. Estas proteínas de la pared celular y la membrana juegan un papel crucial en el control inmunológico contra muchos patógenos, incluida la tuberculosis. Algunas de estas proteínas se informan como antígenos inmunodominantes que montan la respuesta de las células T y B. Por el contrario, otras proteínas se identifican como firmas moleculares de patógenos que se reconoce que inician una respuesta inmune innata, como los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) por parte de las células inmunes, iniciando así una respuesta inmune. Por ejemplo, las lipoproteínas micobacterianas como LprG, LpqH, LprA y PhoS1 son reconocidas por el receptor tipo Toll 2³.

La naturaleza hidrofóbica de las proteínas de la pared celular y la membrana presenta importantes desafíos técnicos en términos de su solubilización y separación. Los estudios han demostrado que las proteínas de membrana constituyen aproximadamente del 20% al 30% de las regiones codificantes de todos los organismos, incluidas las micobacterias ^4,5. Debido a su naturaleza intrínseca y a los desafíos técnicos, las proteínas de la pared celular y la membrana son más difíciles de solubilizar y aislar en comparación con las proteínas solubles. Como resultado, solo se ha informado el 2% de las estructuras de proteínas de membrana⁶. Varios factores contribuyen a la dificultad de aislar estas proteínas. El principal desafío es su baja abundancia dentro de la célula, lo que complica el aislamiento de proteínas individuales para su posterior caracterización⁷. Además, estas proteínas tienden a agregarse, lo que complica aún más su solubilidad. Este problema se puede abordar agregando detergentes para ayudar en la solubilización. Sin embargo, algunas proteínas aún pueden formar agregados incluso en presencia de detergentes, en cuyo caso se pueden usar agentes caotrópicos y agentes reductores para mejorar la solubilidad.

El uso de detergentes para la solubilización puede interferir con los métodos de separación posteriores. Por ejemplo, los detergentes cargados no se pueden usar con cromatografía de intercambio iónico, y todos los detergentes pueden interrumpir la cromatografía de interacción hidrofóbica⁸. Por lo tanto, es fundamental seleccionar un detergente compatible con el método de separación elegido. Otro paso importante en el aislamiento de proteínas de pared celular y membrana es la eliminación de detergentes utilizados para la solubilización, ya que pueden interferir con los análisis funcionales posteriores de las proteínas.

Hemos desarrollado una metodología robusta que supera muchos de los desafíos asociados con el análisis de proteínas de membrana, particularmente las proteínas hidrofóbicas de la pared celular y la membrana celular. Un desafío clave en el estudio de estas proteínas es su solubilización, ya que su naturaleza hidrofóbica las hace difíciles de extraer y analizar. La metodología descrita aquí emplea un tampón de enfoque isoeléctrico (IEF) especialmente formulado, que solubiliza eficientemente las proteínas de la pared celular y la membrana celular. Este paso de solubilización es fundamental ya que permite el análisis posterior de estas proteínas hidrofóbicas.

Una ventaja adicional de este método es su capacidad para reducir la complejidad de la mezcla de proteínas. Mediante el empleo de dos técnicas de separación complementarias, basadas en el punto isoeléctrico (pI) y el peso molecular de las proteínas, esta metodología separa eficientemente las proteínas de la pared celular y la membrana celular en fracciones simplificadas. Cada fracción suele contener solo de una a tres proteínas, lo que mejora significativamente la resolución y facilita la caracterización posterior.

Esta metodología, desarrollada utilizando proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis como sistema modelo, aborda eficazmente los desafíos asociados con el aislamiento y el análisis de proteínas hidrofóbicas. Proporciona un enfoque confiable para el aislamiento, la separación y la caracterización de estas fracciones de proteínas complejas, lo que mejora la capacidad de estudiarlas en detalle.

Protocolo

Este estudio ha cumplido con las directrices gubernamentales pertinentes y ha sido aprobado por el Comité Asesor Científico Institucional y el Comité de Ética. Se obtuvo el consentimiento informado de la población de estudio antes de la extracción de las muestras.

1. Cultivo de M. tuberculosis

1. Transfiera aproximadamente 10 colonias de M. tuberculosis de las inclinaciones de Lowenstein-Jensen a 2 ml de caldo medio 7H9 (suspenda 2,35 g de base de caldo Middlebrook 7H9 en 400 ml de agua destilada, 50 ml de suplemento de albúmina dextrosa catalasa oleica [OADC], 0,5 g de Tween 80 y prepare hasta 500 ml)
   NOTA: M. tuberculosis es un patógeno del grupo de riesgo 3; debe manipularse en un gabinete de seguridad biológica (BSC) en la instalación BSL3. Se debe utilizar el equipo de protección personal (EPP) adecuado.
2. Disperse las células con perlas de vidrio en condiciones estériles en un agitador de botellas a 15 rpm durante 1 min.
3. Transfiera la suspensión bacteriana a 10 ml de medio de caldo 7H9 en una botella McCartney e incube a 37 ° C durante 2 semanas en una incubadora agitadora a 30 rpm.
4. Amplíe el cultivo en fase logarítmica a 200 ml de medio de caldo 7H9 y déjelo crecer en un cultivo agitador durante 4 semanas a 30 rpm.
5. Además, amplíe el cultivo en un matraz de 1 L que contenga 500 ml de medio de caldo 7H9 y crezca como cultivo agitador a 30 rpm durante 4 semanas a 37 ° C.
6. Coseche las micobacterias centrifugando a 1741 g durante 30 min.

2. Preparación de proteínas lisadas de células enteras

1. Someter el pellet bacteriano aislado a sonicación siguiendo un protocolo estándar.
2. Prepare el tampón de ruptura con la siguiente composición: 20 mM Tris con 8,5% (8,5 g por 100 ml) de NaCl.
3. Ajuste el pH final a 7,4 con HCl concentrado.
4. Agregue inhibidores de la proteasa recién preparados al tampón de ruptura con las siguientes concentraciones (los detalles de los inhibidores de la proteasa que se agregarán se enumeran en la Tabla complementaria 1)
5. Tratar los bacilos de M. tuberculosis (100 ml de volumen empaquetado y pesado) por cada 2 g de gránulos de células bacterianas, añadir 1 ml de tampón de ruptura con lisozima (1 mg/5 ml de suspensión celular) e incubar durante 15 min a 37 °C con agitación suave.
6. Suspenda los bacilos en el doble de su volumen de tampón de rotura.
7. Añadir al tampón un 0,04% (en peso/vol) de azida sódica y un 0,05% de Tween 80.
8. Interrumpa las células bacterianas en el tampón de ruptura utilizando un sonicador con un ciclo de 9 s encendido y 9 s apagado durante 30 min al 40% de amplitud, manteniendo la suspensión en hielo para evitar la desnaturalización de las proteínas.
9. Centrifugar el lisado preparado a 3438 g durante 15 min a 4 °C para eliminar las células intactas.
10. Concentre el sobrenadante utilizando concentradores centrífugos (corte de 3 kDa- 5 mL).
11. Determine la concentración de proteína en el sobrenadante utilizando el ensayo de cuantificación de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) utilizando la proteína BSA como estándar.
    NOTA: En el análisis SDS-PAGE, cargue 50 μg de proteína para el análisis.

3. Aislamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular por ultracentrifugación

1. Aísle la pared celular, la membrana celular y las proteínas citosólicas del lisado celular completo siguiendo el protocolo de Raja et ^al.9. como se describe a continuación.
2. Centrifugar el lisado celular completo a 13751 × g a 4 °C durante 30 min, separando las proteínas de la pared celular en forma de gránulos.
3. Someter el sobrenadante a ultracentrifugación a 100.000 × g a 4 °C durante 4 h utilizando una ultracentrífuga, separando las proteínas de la membrana celular en forma de gránulo y dejando las proteínas citosólicas en el sobrenadante.
4. Estimar las concentraciones de proteínas en la pared celular y las fracciones de la membrana celular utilizando el ensayo de proteínas BCA.
   NOTA: En el análisis SDS-PAGE, cargue 50 μg de proteína para el análisis. La pared celular y la membrana celular separadas se almacenan en un congelador a -80 °C hasta su posterior análisis.

4. Enfoque isoeléctrico preparatorio en fase líquida (Rotofor [aparato IEF])

1. Solubilizar la pared celular y las proteínas de la membrana celular aisladas por ultracentrifugación en un tampón IEF que contiene urea 8 M, DTT 1 mM, glicerol al 5%, digitonina al 2%.
2. Agregue un 2% de anfólitos (pH 3.0 a 10.0 y pH 4.0 a 6.0 en una proporción de 1: 4)
3. Fraccionar las proteínas solubilizadas utilizando un sistema IEF líquido mantenido a 4 °C con un baño de agua de enfriamiento.
4. Realice la separación IEF de acuerdo con las instrucciones del fabricante, aplicando una potencia constante de 12 W hasta que el voltaje se estabilice (entre 1300 V y 1600 V).
5. Continúe la ejecución de IEF durante 30 minutos adicionales después de la estabilización de voltaje, con un tiempo total de ejecución de aproximadamente 5-6 h.
6. Recoger las fracciones individuales de IEF con una bomba de vacío y determinar sus valores de pH.
7. Someter las fracciones separadas (50 μg) a SDS-PAGE y visualizar las proteínas utilizando Coomassie Brilliant Blue (CBB) o tinción de plata. Almacene las fracciones IEF separadas en un congelador a -80 °C hasta su posterior análisis.

5. SDS-PAGE preparativa y elución en gel completo

1. Mezcle las fracciones de pared celular y membrana celular separadas por IEF con tampón de muestra SDS-PAGE 6x y caliente a 95 °C durante 5 min antes del análisis SDS-PAGE.
2. Separe las fracciones de proteínas en la segunda dimensión utilizando geles de poliacrilamida de 16 cm y 20 cm que consisten en un gel de resolución al 12,5% y un gel de apilamiento al 4%.
3. Utilice un solo pocillo de muestra de 13 cm de largo para cargar la muestra.
4. Realice la electroforesis a una corriente constante de 50 mA/gel hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel.
5. Equilibre el gel en tampón de elución (60 mM Tris, pH 9,4; 40 mM de ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico [CAPS]) durante 10 min después de la electroforesis.
6. Transfiera el gel a un aparato de elusión de gel completo como lo describe el fabricante del instrumento.
7. Eluya las proteínas del gel haciendo funcionar el elutor a una corriente constante de 250 mA durante 1 h.
8. Recoja aproximadamente 30 fracciones de proteínas, cada una con un volumen de 3 ml, de cada gel usando una bomba de vacío.
9. Cuantifique la concentración de proteínas en las fracciones eluidas utilizando el ensayo de proteínas BCA.
10. Someter 10 μg de las fracciones eluidas al análisis SDS-PAGE y visualizar mediante tinción con azul brillante de Coomassie (CBB).
    NOTA: Las fracciones eluidas de gel enteras separadas se almacenaron en el congelador a -80 °C hasta su posterior análisis.

Resultados

Aislamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular mediante ultracentrifugación de alta velocidad
Las proteínas de la pared celular y la membrana se aislaron de lisados celulares completos mediante ultracentrifugación como se describe en el protocolo. El análisis SDS-PAGE de las fracciones subcelulares separadas: pared celular, membrana celular y perfiles de proteínas del citosol de M. tuberculosis se muestra en la Figura 1.

Discusión

La naturaleza hidrofóbica de las proteínas de la pared celular y la membrana presenta importantes desafíos experimentales en su solubilización y separación. En el protocolo mencionado anteriormente, describimos un nuevo método de separación bidimensional basado en electroforesis para aislar eficazmente estas proteínas hidrofóbicas. En este protocolo, inicialmente separamos las proteínas de la membrana y la pared celular en función de sus puntos isoeléctricos utilizando el sistema IEF líq...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo 7H9	Himedia	M198
40% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte	BIO-RAD	1631113
Ensayo de proteína BCA	MERCK	BCA1
Bio-Lyte 5/7 Anfolito	BIO-RAD	1631152
concentradores centrífugos 3 kDa	MERCK	Z629456
Digitonina.	MERCK	D141
ADN	MERCK	11284932001
TDT	MERCK	D9779
EDTA	MERCK	E9884
EGTA	MERCK	E3889
Glicerol	MERCK	G5516
Leupeptina	MERCK	E18
Pepstatina A	MERCK	P5318
PMSF	MERCK	78830
Rnasa	MERCK	10109134001
Rotofor	BIO-RAD	170-2986	aparato de enfoque isoeléctrico (IEF)
Sonicador	Vibra-Cell, Sónicos	VC 750
TLCK	MERCK	T7254
TPCK	MERCK	4376
urea	MERCK	U5378
Aparato de elute de gel completo	BIO-RAD	1651250