Disposición espacialmente compacta de secciones de larvas de pez cebra para análisis transcriptómico espacial

Resumen

Aquí, presentamos un método para alinear y crioseccionar múltiples muestras de larvas de pez cebra (Danio rerio) y recolectarlas en un solo portaobjetos para el análisis transcriptómico espacial.

Resumen

Las técnicas transcriptómicas espaciales son una herramienta sofisticada en la investigación biomédica para visualizar patrones de expresión génica registrados espacialmente. La obtención de imágenes y el análisis de múltiples muestras con plataformas de imágenes espaciales pueden ser costosos. La realización de estas pruebas en múltiples condiciones experimentales, como se ha visto en los estudios de desarrollo, aumenta aún más los costos. Para reducir costos, este estudio buscó optimizar las técnicas y estrategias de disposición de muestras transcriptómicas espaciales para estudios de desarrollo. Aquí, el estudio utilizó peces cebra, que son un modelo de vertebrados en desarrollo bien establecido que es transparente durante el desarrollo, tienen ~ 70% de homología genética con los humanos y un genoma altamente anotado ideal para el análisis transcriptómico. Debido a su pequeño tamaño, el pez cebra en desarrollo también permite la colocación compacta de secciones en serie a través de varias réplicas biológicas. En este artículo, informamos sobre la fijación optimizada, la criosección y la alineación confiable de múltiples muestras de peces dentro del área de imágenes de una plataforma de imágenes espaciales de hibridación in situ múltiple . Con este método, el pez cebra de tan solo 15 días después de la fertilización (dpf) de al menos 4 moldes diferentes y hasta 174 secciones puede crioseccionarse con éxito, recolectarse dentro del área de imagen de 22 mm 10,5 mm (para un portaobjetos transcriptómico espacial in situ ) y procesarse simultáneamente. En función de la calidad de la sección, la alineación de la muestra y el tamaño de la muestra por portaobjetos, este método en el pez cebra optimiza la salida y el coste por muestra de las técnicas transcriptómicas espaciales.

Introducción

La evaluación de patrones de expresión espacialmente distintos en los tejidos sigue siendo fundamental para nuestra comprensión de las influencias genómicas en el desarrollo, el cáncer y la enfermedad ^1,2,3. La transcriptómica espacial combina técnicas de expresión multiplexada con el registro espacial de la expresión en tejidos. La "transcriptómica espacial" fue acuñada por primera vez por Ståhl y sus colegas⁴, donde los especímenes de cáncer montados se sondearon utilizando secuenciación de próxima generación in ....

Protocolo

Este protocolo sigue las pautas del comité institucional de cuidado y uso de animales de Dartmouth College.

1. Preparación del criostato

1. Enfríe el criostato a -22 °C y limpie las superficies interiores del criostato cepillando los residuos en el receptáculo. Coloque todos los cepillos y herramientas necesarios dentro de la cámara.

2. Preparación del molde base desechable

1. Prepare un molde base (molde de plástico desechable de 37 mm, 24 mm, 5 mm) para la alineación de muestras dibujando una línea recta a través del in....

Resultados

En este método (Figura 1), el pez cebra se utiliza como modelo animal para sondear los patrones de expresión génica resueltos espacialmente. La criosección eficiente de larvas de pez cebra para la obtención de imágenes espaciales es un desafío. Las secciones deben ser de alta calidad para conservar la estructura del tejido y los genes detectables (Figura 4). Las secciones que contienen múltiples muestras para obtener imágenes espacialmente eficientes deben aline.......

Discusión

Este informe proporciona soluciones detalladas a muchos de los desafíos técnicos asociados con el pez cebra como organismo modelo en el análisis transcriptómico espacial durante el desarrollo. Al abordar estos desafíos, nuestra disposición compacta de muestras optimiza los costos en las plataformas transcriptómicas espaciales emergentes¹. La criosección de larvas de pez cebra para la obtención de imágenes espaciales es un desafío. Las secciones deben conservar una.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vaso de precipitados de 1 L	Pyrex	1003
200 proof etanol puro	Koptec	V1001
Ácido acético, glacial	VWR	0714	alcohol acidificado
Papel
Cubrecubiertas	Epredia	24X50-1.5-001G
Molde base desechable	Fisher HealthCare	22-363-556
Agua
Montaje DPX	Sigma-Aldrich	06522	Soporte para histología
Pellets
Pinzas de #5SF Dumont	Fine Science Tools	11252-00
Eosin-Y	Epredia	71204	Eosina Y 1%
Gill 1 Hematoxilina	Epredia	72411	hematoxilina
Kimwipe	Kimberly-Clark Professional	34120	toallita absorbente y sin pelusa
Cinta de etiquetado de laboratorio	VWR	89097-934
Hoja de micrótomo MX35 Ultra	Epredia	3053835
Microtomo Cryostat	Thermo Scientific	Microme HM 525
O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	23-730-571	medio de congelación
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	158127	PFA
marcador permanente	VWR	52877-886
Transportador
SafeClear Sustituto de xileno	Fisherbrand	68551-16-6	Sustituto de xileno
Cuchillas de un solo filo	American Line	66-0407
Esteriomicroscopio	Zeiss	4350639000	Stemi 305 con LED de doble punto (4355259020) y soporte K lab (4354259010)
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
Pipeta
Portaobjetos Xenium V1	10X/Xenium	3000941	portaobjetos de imágenes transcriptómicas espaciales

de aluminiodestiladade hielo seco Alcohólica de transferencia