In situ Aislamiento y cultivo de bacterias recalcitrantes del suelo mediante un chip de aislamiento (iChip)

Resumen

Este protocolo describe el diseño y uso de un chip de aislamiento (iChip) para el cultivo in situ de microbios recalcitrantes del suelo en su entorno natural. También describe el cultivo in situ de bacterias del suelo productoras de antimicrobianos. El protocolo se puede adaptar para recuperar bacterias de diversos nichos con otras propiedades deseables.

Resumen

Los ecosistemas albergan millones de microbios ambientales, algunos de ellos capaces de producir productos biotecnológicamente relevantes como enzimas, vitaminas, aminoácidos, ácidos orgánicos, agentes antiparasitarios y agentes antimicrobianos. La mayoría de estas bacterias ambientales se consideran "incultivables" ya que los métodos de cultivo de laboratorio no cumplen con sus requisitos nutricionales / ambientales. Además, como coexisten en la naturaleza, también pueden depender de un nutriente/metabolito producido por otro miembro de la comunidad microbiana. Incorporar la diversidad microbiana "no cultivada" al cultivo presentará una oportunidad para explorar la amplia gama de productos bioactivos que pueden codificar. Este artículo describe la implementación de la tecnología iChip, una cámara de difusión multicanal desarrollada para un cultivo in situ de alto rendimiento de las bacterias "incultivables". Dada la amenaza mundial de la resistencia a los antimicrobianos, el artículo proporciona un protocolo detallado para el cultivo in situ y la recuperación de aislados de la "materia oscura" microbiana capaz de producir agentes antimicrobianos, por ejemplo. Este protocolo describe los pasos involucrados, desde el paso de recolección de muestras de suelo hasta la recuperación de aislamientos, y destaca los factores plausibles que pueden influir en el éxito del aislamiento. El uso de esta tecnología no solo facilita el aislamiento de bacterias que de otro modo serían "incultivables" para el descubrimiento de antibióticos, sino que también permite a los investigadores profundizar en la compleja ecología del suelo, que luego se puede aprovechar para una gran cantidad de otras aplicaciones.

Introducción

Existen ricos depósitos de microbios previamente inexplorados en entornos naturales como el suelo, los cuerpos de agua y los entornos extremos. Sin embargo, es un desafío aprovechar esta enorme biodiversidad de microbios, ya que la mayoría de ellos no se pueden cultivar fácilmente utilizando medios y métodos de laboratorio tradicionales. La gran anomalía del recuento en placa describe este fenómeno, destacando el número discordante de microorganismos que se pueden observar visualmente frente a los que se observa que crecen en los medios de cultivo¹. Superar esta barrera y permitir el acceso a la diversidad incultivable de microbios y sus productos podría abordar diversas necesidades biotecnológicas.

Por ejemplo, el desarrollo de resistencia a los antimicrobianos se ha convertido en una amenaza para la salud pública mundial. Las principales corporaciones farmacéuticas se han mostrado reacias a buscar el descubrimiento de nuevos antimicrobianos, lo que ha provocado que la tasa de descubrimiento disminuya en comparación con la tasa de aparición de resistencia a los antibióticos existentes ^2,3. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de descubrir nuevos antimicrobianos⁴. Dado que las comunidades microbianas han evolucionado juntas concomitantemente o en competencia⁵, han desarrollado el potencial para producir nuevos compuestos químicos que mejoran sus posibilidades de supervivencia. La enorme diversidad de microbios ambientales y sus productos no se ha explorado completamente, ya que los métodos tradicionales basados en cultivos de laboratorio a menudo conducen al aislamiento de microbios similares y conocidos. Esto se debe a que los medios y métodos de cultivo convencionales están sesgados hacia el cultivo de microbios relevantes para los humanos y no imitan los entornos naturales. El diseño de medios de cultivo para cultivar microbios ambientales es un desafío, ya que el crecimiento de algunas especies puede requerir varios nutrientes, a menudo producidos por otros microbios en las cercanías, y condiciones ambientales específicas.

Para abordar este problema y cultivar microbios ambientales in situ, se desarrollaron primero cámaras de difusión⁶. La cámara de difusión es una junta tórica de acero inoxidable. El espacio dentro del anillo se llena con agar sembrado con una dilución de muestra adecuada. La parte superior e inferior del anillo se sellan con membranas de policarbonato, que permiten la difusión de nutrientes y metabolitos derivados del suelo al tiempo que evitan la infiltración de otros microbios en la cámara⁶. Después de la siembra, la placa se coloca en el entorno del que se recolecta la muestra para permitir el cultivo in situ. La cámara de difusión fue altamente eficiente y dio como resultado el cultivo de numerosos microbios previamente incultivables. Sin embargo, el diseño de la junta tórica con agar se volvió laborioso y de bajo rendimiento, dejando abierto un espacio problemático para futuras innovaciones⁶. Poco después, se diseñó un chip de aislamiento (iChip), que era capaz de cultivar in situ y recuperar simultáneamente cultivos puros de alto rendimiento⁷. Este diseño es conceptualmente el mismo que una cámara de difusión, pero consta de múltiples canales donde cada canal actúa como una cámara de difusión independiente, lo que permite la recuperación potencial de una sola microcolonia de cada cámara⁸. La reinvención del diseño de la cámara de difusión mejoró enormemente el rendimiento de la tecnología y permitió el aislamiento y cultivo de una mayor biodiversidad de taxones del suelo, agua marina⁹, aguas termales¹⁰, etc. La teixobactina, un antibiótico recientemente descrito, fue descubierto siguiendo la tecnología descrita anteriormente¹¹. Exhibió un mecanismo novedoso de acción antimicrobiana y se descubrió que era letal contra los patógenos que causan infecciones invasivas, lo que demuestra que el aislamiento de alto rendimiento de microbios a partir de "materia oscura" microbiana se puede optimizar de manera eficiente para el descubrimiento de productos naturales biotecnológicamente relevantes utilizando esta tecnología¹².

Este artículo sirve como guía de procedimiento para la implementación efectiva de esta tecnología de alto rendimiento para el cultivo in situ y la recuperación de bacterias recalcitrantes productoras de antimicrobianos a partir de la "materia oscura" microbiana del suelo. El protocolo describe el diseño de un chip de aislamiento, la recolección de muestras, la preparación de muestras, la siembra, la incubación y la recuperación. Aunque el protocolo presentado demuestra el cultivo in situ de microbios del suelo, el mismo se puede adaptar fácilmente para el cultivo in situ de microbios de cualquier entorno. Las capacidades de alto rendimiento de esta tecnología podrían aumentar la probabilidad de descubrir nuevos microbios y utilizar su potencial biosintético para diversas aplicaciones biotecnológicas.

Protocolo

1. Diseño e impresión 3D

1. Elija el diseño y el tamaño en función del tipo de muestra, el volumen por cámara de difusión, las dimensiones de la membrana que se utilizará y el rendimiento requerido (número de cámaras de difusión).
   NOTA: El grosor de la placa intermedia y el diámetro de cada canal determinan el volumen de cada cámara de difusión cilíndrica. El tamaño depende del número de cámaras de difusión individuales que se van a alojar, y las dimensiones de la membrana dependen directamente del número de cámaras de difusión cubiertas (Figura 1).
2. Utilice la opción de inserción de formas en cualquier programa de software de presentación para insertar círculos de las dimensiones necesarias para que sirvan como iChip. Inserte círculos más pequeños dentro para representar los canales. Organice los círculos más pequeños en el patrón deseado para preparar un diseño preliminar para la placa superior / inferior y central. Seleccione el diseño y use el menú contextual para guardar el diseño preliminar como una imagen.
3. Usando el diseño preliminar como plantilla, comience a crear un diseño bidimensional (2D) utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD).
   1. En el menú de boceto, inserte formas predefinidas, predominantemente círculos, para crear el diseño básico de las placas y la matriz de canales.
   2. Utilice la opción de cota para definir las cotas reales de las placas y los canales. Haga clic en Aceptar para finalizar el diseño y luego use la función de extrusión para convertir el diseño 2D en un modelo 3D del grosor deseado.
   3. Finalmente, use el menú de archivo Guardar para guardar una copia del modelo 3D en el formato de archivo de estereolitografía (STL), compatible con la impresión 3D.
4. Elija el material para imprimir en función de la aplicación deseada, teniendo en cuenta factores como el método preferido de esterilización y el sitio de plantación. Por ejemplo, elija un material resistente a la temperatura si se utilizará autoclave para la esterilización o si se plantarán en un sitio donde la temperatura es alta.
   NOTA: La impresión 3D para este experimento se realizó utilizando un material similar a la cerámica que puede soportar altas temperaturas de hasta 268 °C y, por lo tanto, era esterilizable en autoclave.
5. Elija un método de impresión 3D adecuado, según las dimensiones (detalle y resolución) y el material utilizado.
   NOTA: La impresión 3D mediante estereolitografía, un método de fabricación aditiva, puede crear estructuras intrincadas curando una resina termoestable con un láser ultravioleta (UV). La estereolitografía se puede utilizar con varios materiales y permite excelentes acabados superficiales y una resolución de alto detalle.

2. Recogida de muestras de suelo

1. Descargue e instale una aplicación móvil de geocodificación que permita la identificación de sitios de 3 m x 3 m en todo el mundo al proporcionar una dirección única de 3 palabras para el sitio desde cualquier tienda de aplicaciones móviles. Identifique un sitio para la recolección de muestras de suelo. A continuación, abra la aplicación móvil de geocodificación para identificar el sitio de interés y su dirección única de tres palabras.
2. Registre la dirección única de tres palabras, la fecha, la hora, la profundidad a la que se recolectará la muestra, las condiciones climáticas, la vida vegetal y animal cercana, la exposición del sitio y la temperatura del sitio (superficie y subsuperficie a la profundidad deseada).
   NOTA: El suelo puede contener bacterias patógenas. Por lo tanto, use el equipo de protección personal adecuado (guantes, batas de laboratorio, etc.) y siga los protocolos apropiados para el nivel de bioseguridad 2. Minimice el contacto para evitar la contaminación y exposición de la muestra. Desinfecte la superficie de trabajo antes y después de manipular muestras de suelo.
3. Descontamine la pala rociándola con etanol al 70% y limpiándola. Descontamine la caja de poliestireno, en la que se recogerá el suelo, rociándola con etanol al 70% y limpiándola. Deje que el etanol residual se seque por completo antes de continuar.
   NOTA: Aunque este protocolo utiliza una caja de poliestireno para recoger la muestra y realizar la incubación, también se pueden utilizar alternativas como recipientes de vidrio y metal si se desea.
4. Retire cualquier material vegetal, hojarasca y / o piedras de la superficie para exponer la capa superior del suelo. Descontamine la pala nuevamente como antes, limpie la capa superior del suelo y evalúe el suelo a una profundidad de 3 a 6 pulgadas bajo la superficie. Usa una regla para medir la profundidad desde la superficie. Con la pala esterilizada en superficie, recoja 4-5 kg de tierra de la profundidad deseada en la caja de poliestireno.
5. Selle la caja con una tapa. Si se va a recolectar más de una muestra, descontamine la pala entre dos sitios de muestreo para evitar la contaminación cruzada. Una vez que se hayan recolectado todas las muestras, transporte las muestras de regreso al laboratorio de inmediato.

3. Preparación de muestras para la siembra

1. De la muestra de suelo recolectada, pesar 1 g de suelo libre de escombros, rocas y hojarasca en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml que contenga 10 ml de solución salina estéril.
   NOTA: Conserve parte de la muestra de suelo ya que el glicerol almacena^13,14 a -80 °C para conservar la población microbiana nativa para necesidades futuras.
2. Mezcle la tierra con la solución salina en vórtice durante unos 10 s para crear una suspensión de tierra. Deje el tubo de la centrífuga intacto durante 5 minutos para permitir que las partículas grandes de suciedad en el tubo se asienten. Luego, transfiera con cuidado la suspensión de tierra sobrenadante a un tubo de ensayo nuevo etiquetado como "S".
3. Utilizando la suspensión de suciedad como muestra sin diluir, realice una dilución en serie transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de solución salina estéril en un tubo nuevo. Prepare diluciones de ^10-1 a ^10-5.
   NOTA: El recuento en placa de las suspensiones de suelo diluido en medios no selectivos puede proporcionar información sobre la densidad de bacterias en la muestra, que se puede utilizar para elegir la dilución adecuada para la siembra. Sin embargo, tenga en cuenta que esto es solo una estimación de las bacterias cultivables presentes en la muestra.

4. Siembra y montaje

1. Dentro de un gabinete de bioseguridad, descontamine la superficie de la placa superior, la placa inferior y la placa central sumergiéndolas en etanol al 70% durante 10 min. Enjuague el exceso de etanol lavando las placas con agua desionizada estéril y déjelas secar al aire en una placa de Petri estéril.
2. Coloque la placa del medio en una placa de Petri estéril, lista para sembrar. A continuación, fundir el medio de agar SMS en un microondas, dejar que se enfríe y transferir 22,5 ml de agar SMS a 45 °C en un tubo de centrífuga de 50 ml.
3. A esto, agregue 2,5 ml de una dilución adecuada de la muestra de suelo y mezcle bien mediante una inversión suave, evitando la introducción de burbujas de aire.
   NOTA: Elija una dilución adecuada para la siembra. Para lograr una densidad de siembra final como en la dilución ^10-4 , elija la suspensión ^10-3 , ya que la muestra se diluirá 10 veces más en el medio utilizado para la siembra.
   1. Elija la dilución de siembra para inmovilizar 1 célula por cámara, que luego puede convertirse en una colonia in situ.
      NOTA: El agua destilada también se puede usar en lugar del medio SMS para imitar el entorno del suelo y permitir el crecimiento de microorganismos que crecen solo en tales condiciones. Opcionalmente, también se pueden agregar agentes antifúngicos como la cicloheximida al medio de siembra para evitar el crecimiento de hongos.
4. Vierta lentamente 3-4 ml del medio de agar SMS sembrado sobre la placa central, cubriendo toda la superficie. A continuación, deje que el medio de agar SMS se asiente durante unos 5-10 min. Compruebe si el medio de agar SMS está configurado. Luego, con una cuchilla de afeitar estéril, raspe el exceso de agar SMS de la superficie de la placa, dejando atrás los tapones de agar en las cámaras de difusión individuales.
5. Después de retirar la lámina protectora de uno de los filtros de membrana de policarbonato de 0,03 μm, colóquela con cuidado en el interior de la placa superior con unas pinzas estériles. Luego, coloque otro filtro de membrana de policarbonato de 0,03 μm en el lado expuesto de la placa central sembrada con unas pinzas estériles.
6. Coloque las placas superior e inferior, intercalando la placa central y las membranas de policarbonato, teniendo cuidado de alinear los orificios de los tornillos en todas las placas, para completar el ensamblaje (Figura 1B). Apriete las tuercas y los tornillos para asegurar el conjunto.
   NOTA: Es una buena práctica armar un iChip de control con solo agar SMS estéril, sin sembrar, en paralelo y plantarlo en el suelo junto con el sembrado para verificar el sello. Esto descartaría la posible entrada de microbios del medio ambiente y actuaría como un control negativo.

5. Cultivo y recuperación in situ

1. Cree una depresión mayor que el tamaño del iChip en el suelo recogido en la caja de poliestireno con una pala estéril. Plante el conjunto verticalmente dentro de la depresión y empaquételo con tierra firmemente, asegurándose de que todas las superficies estén completamente cubiertas. Luego permita el cultivo in situ durante la duración deseada de 2 a 4 semanas. Durante la incubación, use agua destilada estéril para humedecer el suelo periódicamente para evitar que se sequen los tapones de agar SMS sembrados en las cámaras de difusión.
   NOTA: Colocar el conjunto en posición vertical evita la filtración continua de agua a través de las cámaras de difusión durante la humectación regular del suelo, como puede ocurrir si se planta horizontalmente.
2. Después de la incubación deseada, desaloje suavemente la tierra alrededor del iChip plantado para recuperarlo. Luego, lávelo con solución salina estéril para eliminar las partículas de suciedad adheridas y transfiéralo a un gabinete de bioseguridad para su posterior procesamiento.
3. Desata las tuercas y los tornillos del conjunto. Luego, desmóntelo con cuidado. Con pinzas estériles, retire las membranas de policarbonato y transfiera la placa central a la placa de Petri preparada.
4. Utilice aplicadores de madera estériles para recuperar los tapones de agar individuales dentro de cada cámara de difusión. Inocule los tapones de agar en medios apropiados como agar SMS o agar de caldo de soja tríptico 0,1x para intentar el cultivo en laboratorio.
   NOTA: Los aislados cultivados pueden ser examinados para la producción de antimicrobianos mediante métodos de rutina como la superposición de agar¹⁵.
5. Alternativamente, tiña y toma imágenes de los tapones de agar recuperados que contienen bacterias del suelo recalcitrantes cultivadas in situ para confirmar el crecimiento de microcolonias en condiciones in situ .
   NOTA: Para mejorar la sensibilidad de la detección, el tapón de agar triturado también se puede teñir con tintes fluorescentes que pueden teñir bacterias, seguido de microscopía de fluorescencia.

Resultados

El iChip utilizado en este protocolo fue diseñado, impreso en 3D y ensamblado como se muestra en la Figura 1. La descripción general del protocolo descrito se muestra en la Figura 2. La muestra de suelo utilizada para el experimento se recolectó del campus de IIT Jodhpur en Rajasthan, India. La dirección única de tres palabras de la ubicación era 'comunicar, supervisar, recurrir. La ubicación elegida fue una zona semiárida con una temperatura de 40 °C el día del...

Discusión

Los numerosos hábitats únicos en la Tierra albergan distintas comunidades microbianas que representan una enorme diversidad. Esto permanece inexplorado debido a las limitaciones en la provisión de las condiciones de crecimiento apropiadas requeridas para su cultivo. Algunas bacterias dependen de los metabolitos liberados por otras para su supervivencia y, por lo tanto, no pueden sobrevivir de forma independiente en condiciones de laboratorio. Además, las bacterias también juegan un papel...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Impresora 3D	Protolabs, EE. UU.	1631-833 Proveedor de servicios de	impresión 3D
Agarose	Himedia, India	MB002	Componente de medios
Casaminoácidos	Sisco, India	68806	Componente de medios
Caseína Digest	ASES, India	C5890	Componente de medios
Membrana de policarbonato	Sterlitech, EE. UU.	PCT00347100
Almidón de patata	Himedia, India	GM403	Componente de medios
PowerPoint	Microsoft, EE. UU.	N/A	Utilizado para la creación de componentes iChip diseño preliminar
PTC Creo	PTC, EE. UU.	N/A	Utilizado para 3D asistido por computadora modelado de componentes iChip Caldo de
soja tríptico	Himedia, India	M011	Medio de laboratorio
What3Words	What3Words, Reino Unido	N/A	Se utiliza para registrar las coordenadas de la ubicación de muestreo

consumible