Este método describe la explotación de la señal endógena en un modelo de ratón transgénico ARL13B-CENTRIN-2 para obtener imágenes de cilios primarios in situ, en tres dimensiones a través de grandes áreas de tejido mineralizado, desde la recolección de tejido hasta el análisis de la organización de los cilios. Este protocolo también se puede aplicar a otros tipos de tejidos.
Artículo de método
Imágenes volumétricas y análisis de cilios primarios en tejido musculoesquelético utilizando el modelo de ratón ARL13B-CENTRIN-2
En este artículo
Resumen
Resumen
El cilio primario es un orgánulo solitario e inmóvil ensamblado por la mayoría de los tipos de células. Es esencial para el desarrollo y la homeostasis del esqueleto y para coordinar las respuestas de las células a las señales bioquímicas y mecánicas de su entorno circundante. Debido a su tamaño a escala micrométrica, el cilio primario es difícil de visualizar in situ para caracterizarlo en los tejidos, de una manera de alto rendimiento y sin sesgos ópticos. La comprensión de su organización en su entorno 3D in vivo será clave para comprender las funciones ciliares en la fisiología y la enfermedad. La línea de ratones ARL13B-CENTRIN-2 presenta una marca mCherry en la proteína del axonema ciliar ARL13B y una etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP) en la proteína centriolo CENTRIN-2, localizada en la base del cilio. Esta línea de ratón permite obtener imágenes del cilio primario sin necesidad de tinción, lo que reduce el número de pasos en la recopilación de imágenes y evita los problemas de señal-ruido. Esta publicación describe un protocolo paso a paso para obtener imágenes de cilios primarios en tejidos musculoesqueléticos mientras se preserva la señal fluorescente. También describe una canalización de análisis de imágenes de aplicación universal, que permite la cuantificación imparcial de las características de los cilios, como la longitud y la orientación 3D.
Introducción
El cilio primario es un orgánulo esencial en el desarrollo y la homeostasis de muchos tejidos y órganos, incluido el esqueleto. Durante el crecimiento postnatal, regula la mineralización del cartílago durante la osificación endocondral1. En los seres humanos, las mutaciones genéticas que afectan a las proteínas relacionadas con los cilios causan una serie de enfermedades y trastornos del desarrollo, conocidos como ciliopatías. La comprensión de la organización de los cilios primarios dentro de los tejidos es importante para comprender cómo regulan el comportamiento celular a nivel de órganos. Se ha demostrado que la incidencia, la longitud y la orientación de los cilios primarios varían dentro y entre los tejidos, lo que sugiere un papel de la organización de los tejidos en su función 2,3,4. La placa de crecimiento, la capa de cartílago al final de los huesos largos donde se produce la mayor parte del crecimiento óseo postnatal desde los primeros años de vida y hasta la adolescencia, es un tejido altamente organizado con células de condrocitos dispuestas en columnas. En la placa de crecimiento, los condrocitos pasan por etapas de diferenciación, desde el reposo hasta la proliferación y la hipertrófica.
Esta organización celular se pierde en algunas ciliopatías, lo que sugiere que los cilios primarios pueden desempeñar un papel en la coordinación de esta organización celular y/o, al menos, estar asociados con la polarización celular. Además, la orientación primaria de los cilios parece desempeñar un papel en su función mecanosensorial, observándose diferencias entre las regiones que soportan carga y las que no lo hacen en el cartílago articular4. Nuestros estudios recientes han implicado roles diferenciales dentro de diferentes regiones del cartílago articular y la placa de crecimiento 5,6. Los estudios previos que han obtenido imágenes de cilios primarios en la placa de crecimiento se han limitado a 2D, lo que pierde información relacionada con la organización de los cilios en el tejido o se limitan a un pequeño número de células en 3D, lo que reduce la escala y la potencia del análisis 7,8.
Entre los desafíos para obtener imágenes del cilio primario se encuentran su tamaño a escala micrométrica y la no especificidad de los anticuerpos inmunohistoquímicos. El uso de una señal fluorescente nativa garantiza una fuerte localización y especificidad. Sin embargo, las señales fluorescentes nativas pueden ser difíciles de visualizar en los tejidos mineralizados, ya que el largo proceso de descalcificación para incrustar los tejidos en la parafina puede provocar la pérdida de señal. La criosección de muestras congeladas en estado nativo evita esta pérdida al acelerar el proceso de inclusión y seccionamiento.
Para obtener imágenes de los cilios primarios in situ, Bangs et al. generaron una doble línea de ratón transgénico, que expresa la proteína similar al factor de ribosilación ADP (ARL13B) fusionada con mCherry y CENTRIN-2 fusionada con GFP9. ARL13B es una pequeña GTPasa localizada en la membrana primaria del cilio, y CENTRIN-2 es una proteína centriolar localizada en los dos centrosomas en la base del cilio 10,11. Esta línea de ratón, por lo tanto, permite obtener imágenes de cilios primarios marcados con fluorescencia sin necesidad de inmunohistoquímica.
El protocolo descrito aquí hace uso de esta línea transgénica para obtener imágenes de cilios primarios en 3D en placas de crecimiento postnatal murinas con microscopía confocal, que solo requiere tinción adicional con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Cientos de cilios primarios en cientos de células pueden ser visualizados y analizados colectivamente en un contexto de tejido. Posteriormente, una tubería de análisis de imágenes mide la incidencia, la longitud y la orientación de los cilios primarios en las diferentes regiones de la placa de crecimiento. La tubería también es capaz de cuantificar estas características para los centriolos. En la Figura 1 se presenta un resumen de los pasos del protocolo.
Protocolo
La cría de animales y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los marcos éticos de la Universidad de Oxford y bajo una licencia de proyecto otorgada por el Ministerio del Interior del Reino Unido. Este protocolo se realizó en ratones de entre 2 y 10 semanas de edad, pero funcionaría en el cartílago de ratones más allá de esta edad.
1. Recolección de tejidos
- Eutanasiar ratones llenando una caja que contenga los ratones con dióxido de carbono hasta el 80% en volumen y manteniendo su concentración durante 5 min. Realizar luxación cervical.
- Disecciona el tejido de interés.
NOTA: A continuación se muestra un protocolo para diseccionar las rodillas de la pata trasera, incluidas las placas de crecimiento tibial y femoral y el cartílago articular.- Incide la piel en el pie y corta hasta la parte superior del muslo. Retire la piel de la línea de incisión con pinzas.
- Recorta el músculo y el tejido graso de las piernas.
- Para separar la pierna del cuerpo, corta limpiamente a través del fémur en la parte superior de la cadera. Corta el pie en la parte inferior de la tibia.
- Elimine el exceso de músculo y tejido graso que quede en la pierna.
2. Fijación e inclusión de tejidos
NOTA: A lo largo del protocolo, tenga cuidado de mantener el tejido en la oscuridad para evitar la pérdida de señal fluorescente.
- Fijar el tejido en formol al 10% a temperatura ambiente durante 4 h.
- Transfiera los tejidos a formalina al 2,5% a 4 °C durante la noche.
- Transfiera los tejidos a un 30% de sacarosa en agua destilada (dH2O) y gírelos suavemente a temperatura ambiente durante la noche o durante 3 días a 4 °C. Llene los tubos hasta la parte superior para asegurar una inmersión completa del tejido durante la rotación. Después de esta incubación, el tejido se hundirá hasta el fondo del tubo.
- Coloque una pequeña cantidad de hielo seco en una caja separada y coloque el criommoldo en la parte superior. Traza una línea de medio supercriogénico (SCEM) y coloca la extremidad a lo largo de ella, con la rótula hacia abajo y abriendo la tibia y el fémur para que la pierna quede lo más plana posible. Manténgalo en su lugar con pinzas hasta que el SCEM haya comenzado a solidificarse y la extremidad ya no se mueva cuando no se mantiene presionada.
- Cubra completamente con SCEM, llenando el molde hasta arriba. Coloque la muestra en la caja de hielo seco, manteniendo la muestra plana para evitar el movimiento del tejido, hasta que el SCEM se solidifique por completo.
- Trasvasar a -20 °C.
3. Seccionamiento
- Retire el bloque del molde y recórtelo hasta un tamaño que quepa en el mandril de un criostato. Fije el bloque al mandril aplicando SCEM en el mandril y colocando el bloque encima.
- Deje que se solidifique durante al menos 5 minutos a -20 °C en el criostato.
- Coloque el mandril en el portamuestras y una cuchilla en el portacuchillas.
- Recorte el bloque hasta que se alcance la placa de crecimiento tibial. Lo ideal es seccionar con la tibia apuntando hacia arriba.
- Corte la cinta de película criogénica a un tamaño que se ajuste a la muestra con suficiente espacio a su alrededor. Monte la película criogénica en la superficie de corte, asegurando una adhesión firme de la película criogénica con una herramienta adecuada. Corte secciones de 40-60 μm de grosor para obtener secciones de dos celdas de grosor. Recoja la cinta con pinzas y colóquela en un portaobjetos, con la muestra hacia arriba, y la placa de crecimiento tibial en línea con el portaobjetos corto del portaobjetos.
- Guarde los portaobjetos de muestra a -20 °C.
4. Preparación y montaje de la corredera
- Descongele el portaobjetos horizontalmente a temperatura ambiente.
- Lave el portaobjetos con una gota de PBS durante 3 x 5 minutos para eliminar el SCEM.
- Teñir con 10 μM de DAPI durante 1 min.
- Lave el portaobjetos con una gota de PBS durante 2 x 5 min.
- Montar, cubrir con un cubreobjetos y dejar a temperatura ambiente durante la noche. Selle los bordes del cubreobjetos con sellador de cubreobjetos.
- Imagen al día siguiente.
5. Imagen por microscopía confocal
NOTA: La resolución del objetivo 40x/1.4 en el microscopio confocal utilizado es de 240 nm.
- Configura el microscopio.
- Encienda el microscopio y abra el software. Haga clic en el botón Sistema .
- En la pestaña Adquisición , haga clic en Configuración inteligente para configurar los canales. Seleccione y agregue los canales GFP, mCherry y DAPI. Seleccione la opción Airyscan y la función SR8Y en el triángulo Airyscan (entre resolución y velocidad-multiplex 8Y). Haga clic en Mejor señal | OK (Figura suplementaria S1A).
- En la pestaña Localizar , en Control de microscopio, seleccione el objetivo 40x/1,4 con inmersión en aceite.
- Localice la región de interés.
- Coloque la corredera en el portaobjetos y levante el objetivo hasta que el aceite toque el cubreobjetos.
- Coloque la placa de crecimiento u otra región de interés debajo de la trayectoria de la luz.
- En la pestaña Localizar , haga clic en Fluorescencia, seleccione DAPI y, con el ocular, mueva el soporte de portaobjetos con el joystick para colocar la placa de crecimiento o la región de interés bajo el campo de visión.
- En la pestaña Adquisición , comience seleccionando solo el canal DAPI .
- Haga clic en Continuo para ver la imagen de ese canal en la pantalla y asegurarse de que la placa de crecimiento esté a la vista.
- Abra el visor de mosaicos haciendo clic en Mostrar visor en la pestaña Mosaicos . Agregue el número de mosaicos necesarios (generalmente 1 mosaico en la dirección x y 3-5 en la dirección y) y haga clic en Vista previa e inicio (Figura complementaria S1B).
- Compruebe que las baldosas cubren las tres zonas del cartílago de crecimiento: reposo, proliferación e hipertrófica. Ajuste la posición y el número de la ficha según sea necesario.
- Configure los parámetros de imagen.
- Haga clic en Continuo en la pestaña Adquisición . En la pestaña Canales , ajuste la ganancia (maestro) y la potencia del láser para ver los núcleos claramente en la pantalla. Permita que el detector Airyscan se alinee. Abra la ventana de ajuste del detector Airyscan haciendo clic en el símbolo de la roseta en mosaico en la parte inferior de la ventana; una vez que se haya alineado, todas las baldosas se volverán verdes (Figura complementaria S1C).
- Seleccione los canales GFP y mCherry individualmente y repita estos pasos: configure la ganancia (maestro), la potencia del láser y alinee el detector Airyscan.
- Seleccione los tres canales y haga clic en Continuo. Permita que el detector Airyscan se alinee.
- En la pestaña Modo de adquisición, defina los valores Tamaño de imagen, Píxel, Tamaño, Tamaño de fotograma, Velocidad y Promediado. Consulte la Figura complementaria S1D,E para conocer los valores de los ajustes del modo de adquisición, la ganancia (maestro) y la potencia del láser para los canales utilizados.
- Adquirir imágenes.
- En la pestaña Adquisición , haga clic en la casilla de verificación Z-Stack .
- Con solo el canal DAPI seleccionado, haga clic en Continuo para ver la imagen en la pantalla. Mueva el objetivo hacia abajo hasta el plano más cercano al que se va a obtener la imagen. En la pestaña Z-Stack , haga clic en Establecer primer plano, concéntrese hasta el último plano que se va a ver y haga clic en Establecer último plano. Imagen: Pilas z de 30-40 μm.
- Ajuste el intervalo a 0,15 μm.
- Muévete al centro de la pila z. En la pestaña Mosaicos , en Regiones de mosaicos, haga clic en Verificar y haga clic en Establecer Z y mover al siguiente.
- En la pestaña Estrategia de enfoque , compruebe que la estrategia de enfoque esté establecida en Usar valores Z/Superficie de enfoque definida en la Configuración de mosaicos.
- Haga clic en Iniciar experimento para iniciar la adquisición de la imagen.
- Tratamiento de imágenes
- En la pestaña Procesamiento, seleccione el modo Único o Lote . Seleccione Procesamiento de Airyscan. Marque Procesamiento 3D y seleccione Filtro automático estándar. Seleccione la imagen sin procesar adquirida e inicie el procesamiento (Figura complementaria S2A).
- Una vez completado el procesamiento de Airyscan, seleccione Costura en los métodos de procesamiento. Seleccione Nueva salida, Fusionar mosaicos, Corregir sombreado y Todo por referencia, con la referencia como DAPI. Seleccione la imagen procesada de Airyscan e inicie el procesamiento (Figura complementaria S2B).
- Guarde las imágenes sin procesar y procesadas dos veces. Este último se guarda automáticamente en el modo por lotes .
6. Análisis de imágenes
NOTA: La canalización de análisis utilizada aquí se personalizó para los propósitos de este estudio. Los detalles de las operaciones de canalización se muestran en la Figura complementaria S3.
- Importe el archivo de imagen czi en el software. Abra el panel de análisis; en el menú desplegable , seleccione Nueva canalización...
- Para crear una canalización de detección de celdas, importe el segmentador de Python Cellpose en la canalización12. Establezca Model_Name en cyto2, Input_channel en 2, Second_channel en 3, Diameter_in_μm en 10, Flow_threshold en 0,4 y Cellprob_threshold en 0. Agregue un operador Importar objetos de documento (renombrado a Importar etiquetas manuales) antes y un operador de filtro de características de objeto (renombrado a filtro de tamaño) después de la canalización haciendo clic en + Agregar operación. Consulte la figura complementaria S3A para conocer los valores de la configuración de la tubería.
- Mover el visor al primer plano de interés
- Haga clic en el icono de la herramienta Dibujar objetos
- Haga clic en el icono del modo Polígono
- Área de dibujo a analizar
- Mover el visor al último plano de interés
- Área de dibujo a analizar
- Haga clic en la marca verde Aplicar cambios
- Haga clic en el icono Mostrar tabla de objetos
- Haga clic con el botón derecho en el objeto creado y seleccione Cambiar nombre de objeto para cambiar el nombre del objeto a un nombre apropiado. Haga clic con el botón derecho en el objeto creado y haga clic en Agregar etiqueta. Agregue una etiqueta denominada Región de análisis.
- Ejecute esta canalización haciendo clic en la flecha azul hacia adelante en la parte superior del panel Análisis .
- Para crear una tubería de detección de cilios primarios y centriolas, abra el panel de análisis, en el menú desplegable seleccione Nueva tubería.... Agregue los siguientes operadores a la canalización: Importar objetos de documento (renombrado a Importar etiquetas manuales), dos operadores de Segmentador de umbral de intensidad (renombrados a Umbral de cilios y Umbral de centriolo), División (renombrado a División de centriolo), Filtro de características de objeto (renombrado a Filtro de tamaño de división de Centriolo) y Compartimiento (renombrado a Compartimiento - Celda). Consulte la figura complementaria S3B para conocer los valores de la configuración de la canalización.
- Ejecute esta canalización haciendo clic en la flecha azul hacia adelante en la parte superior del panel Análisis.
- Abra la ventana Objetos. Haga clic en Im/Export..., seleccione Excel Export.... Seleccione las siguientes características para guardar: # Hijos, Nombre, Nombres principales, Límites orientados 3D Lado corto, Lado medio, Lado largo, Ángulo XY, Ángulo XZ, Ángulo YZ, Cuadro delimitador X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, TamañoX, TamañoY, TamañoZ, Centro de geometría X, Y, Z, Plano primero, Último, Recuento, Esfericidad (Malla), Volumen (Malla), Área de superficie (Malla).
Resultados
Se obtuvieron imágenes de la placa de crecimiento de un ratón de 6 semanas de edad utilizando el protocolo descrito y se mapeó la organización de los cilios primarios en el tejido. Se capturó una imagen de las tres regiones de la placa de crecimiento (en reposo, proliferativa e hipertrófica) y se pasó por el proceso de análisis (Figura 2A). Las células individuales se pueden identificar con la tinción DAPI, con su axonema ciliar en rojo y sus centriolos en verde. La resolución utilizando este método es lo suficientemente alta como para discriminar centriolos individuales (Figura 2B). Con esta resolución, los cilios se pueden visualizar en su entorno 3D, apuntando en diferentes direcciones (Video 1).
También se pueden capturar imágenes de menor resolución, con objetivos de aumento más altos, para visualizar cilios primarios en una región más grande del tejido; sin embargo, estos no son adecuados para el análisis de la orientación de los cilios en 3D. Por ejemplo, se obtuvieron imágenes de los cilios primarios del cartílago articular con el objetivo 20x, lo que demuestra que el método también funciona en otros tejidos (Figura 2C). A esta resolución, se pueden identificar los axonemas ciliares en rojo, pero los centriolos son más difíciles de discriminar. El hueso subcondral tiende a presentar una gran cantidad de señal de fondo de GFP, lo que dificulta la identificación del centriolo en este tejido.
La tubería puede detectar células individuales, cilios primarios y centriolos, y funciona para placas de crecimiento jóvenes altamente organizadas y placas de crecimiento más viejas donde las columnas están menos definidas, como en ratones de 10 semanas de edad (Figura 3). Las células y los cilios se detectan en 3D, como se puede ver en la pila z.
Figura 1: Flujo de trabajo experimental. Diagrama de flujo de los diferentes pasos del protocolo, desde la recolección de tejidos hasta el análisis de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cilios primarios en tejidos murinos del ratón ARL13B-CENTRIN-2. (A) Una placa de crecimiento de 6 semanas de edad, con DAPI en blanco, CENTRIN-2 en verde y ARL13B en rojo, fotografiada con el objetivo 40x. (B) Acérquese a un cilio primario individual y sus dos centriolos. (C) Cartílago articular y hueso subcondral de un ratón de 4 semanas de edad, fotografiado con el objetivo 20x. (D) Riñón de un ratón de 6 semanas de edad fotografiado utilizando la misma tubería que para el tejido musculoesquelético. (E) Aumento de la caja blanca en D que muestra los cilios primarios individuales y sus centriolos en el riñón. Barras de escala = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tubería de detección de células y cilios. Ejemplo de aplicación de la canalización de análisis de imágenes en una placa de crecimiento de 10 semanas de antigüedad. (A) Imagen abierta en el software. (B) Resultado de la canalización de detección de células. (C) Resultado de la tubería de detección de cilios y centriolas. Los cilios están en rosa y los centriolos en verde. La vista lateral ejemplifica que la resolución es lo suficientemente alta como para discriminar cilios orientados en diferentes direcciones en 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1: Reconstrucción tridimensional de una placa de crecimiento de 6 semanas de edad del ratón ARL13B-CENTRIN-2. La reconstrucción tridimensional se llevó a cabo en el software Imaris y se grabó como un video de animación. Haga clic aquí para descargar este video.
Figura suplementaria S1: Ajustes de adquisición de imágenes en el sistema de microscopio. (A) Ventana de configuración inteligente para agregar los canales y elegir el modo Airyscan . (B) Visor de mosaicos para seleccionar y obtener una vista previa de los mosaicos a la imagen. (C) Ventana de ajuste del detector Airyscan , donde se confirma la alineación de los detectores Airyscan una vez que todas las casillas se vuelven verdes. (D) Ajustes del láser para los tres canales. (E) Modo de adquisición y configuración de Z-Stack. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria S2: Ajustes de procesamiento de imágenes en el sistema de microscopio. (A) Configuración de procesamiento de Airyscan. (B) Ajustes de costura. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria S3: Canalizaciones de análisis de imágenes personalizadas. (A) Canalización de detección de células utilizando los canales GFP y DAPI. (B) Canal de detección de cilios primarios y centriolos utilizando los canales mCherry y GFP, respectivamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
En este protocolo, es esencial proceder con los pasos de procesamiento e inclusión de tejidos inmediatamente después de la recolección. Sin embargo, los bloques y portaobjetos de tejido pueden conservarse durante al menos 3 meses a -20 °C. Se pueden modificar varios pasos de este protocolo para adaptarse a diferentes aplicaciones, en particular, el grosor de la sección, el aumento y los parámetros de la pila z. Esto influirá en la profundidad de la imagen y en la resolución obtenida. Los cambios en la apertura numérica y el modo de resolución se pudieron utilizar para obtener una resolución aún mayor y se disminuyó el tamaño del intervalo de las pilas z. Sin embargo, esto aumentaría el tiempo de obtención de imágenes o reduciría el tamaño del campo de visión que se puede obtener de imágenes. Los parámetros de imagen descritos son los requisitos mínimos identificados para el análisis 3D de la orientación de los cilios primarios.
La elección del medio de montaje es importante para obtener una alta resolución. El índice de refracción del medio de montaje debe ser similar al del medio de inmersión para minimizar la degradación de la imagen en la pila z. El índice de refracción del refrigerante y el aceite de inmersión utilizados aquí tienen índices de refracción de 1,52 y 1,518, respectivamente. La función Airyscan en el microscopio confocal utilizado aquí ofrece imágenes de superresolución. Se podrían utilizar otros microscopios de superresolución; Sin embargo, descubrimos que el modo confocal por sí solo no era suficiente para obtener la resolución requerida para el tamaño de las áreas fotografiadas. La resolución máxima del modo Airyscan Multiplex SR-8Y es de 120/160 nm en x/y y 450 nm en z, y un número máximo de fotogramas/s de 47,5. Encontramos que el modo Airyscan Multiplex SR-4Y, que presenta una resolución máxima de 140 nm en x/y y 450 nm en z, pero que muestra imágenes a la mitad de velocidad con un número máximo de fotogramas/s de 25, no presenta una diferencia significativa para obtener imágenes de cilios primarios en 3D. Del mismo modo, el modo de superresolución (SR) de Airyscan, que ofrece la resolución más alta en este microscopio (120 nm en x/y y 350 nm en z), tardaría más en obtener imágenes, ya que su número máximo de fotogramas/s es de 4,713.
La señal de GFP de fondo se puede observar en otros tejidos, como el músculo. Para minimizar esto, el rango de los láseres se puede reducir para reducir la superposición con otras longitudes de onda. Esta línea se ha utilizado previamente para obtener imágenes de cilios primarios en el embrión, cultivos de células primarias, fibras musculares y el epitelio pigmentario de la retina 9,14,15. Hemos obtenido con éxito imágenes de cilios primarios en tejido renal, cartílago y óseo. Es probable que se requiera cierta optimización de la configuración de imágenes para diferentes tejidos; Sin embargo, este protocolo de criosección debe garantizar la preservación de la señal.
Las secciones de dos células gruesas (40-60 μm) son suficientes para obtener información de orientación 3D en la placa de crecimiento, ya que esto permite obtener imágenes de células enteras y sus cilios primarios. Para otros tejidos donde las células son más grandes que los condrocitos, como los adipocitos, es posible que se requieran secciones más gruesas para recopilar datos de población celular. Dependiendo de la resolución de profundidad del microscopio utilizado, es posible que no sea posible obtener imágenes profundas en secciones más gruesas. Es probable que las técnicas de limpieza de tejidos conduzcan a la pérdida de la señal endógena de mCherry y GFP debido al tiempo que requiere. Esto se exploró, ya que se utilizaron métodos de aclaramiento para otras imágenes en la extremidad, pero no se encontró necesario en este contexto. Nuestra experiencia con CD31-RFP endógeno sugirió que las técnicas de limpieza necesitarían una optimización cuidadosa y personalizada de la muestra.
Esta línea ARL13B-CENTRIN-2 se puede cruzar con otras líneas de ratón para estudiar más a fondo la organización de los cilios primarios en los tejidos. Por ejemplo, lo hemos cruzado con un aggrecan-Cre IFT88fl/fl para eliminar condicionalmente IFT88, una proteína primaria de los cilios cuya deleción impide la ciliación, en células que expresan aggrecano (condrocitos postnatales)5,6. Estas señales fluorescentes ARL13B y CENTRIN-2 se pueden utilizar para medir la eficiencia de las perturbaciones genéticas a nivel de la estructura ciliar en los tejidos y cualquier cambio asociado en la organización ciliar. El trabajo en curso está haciendo exactamente esto. Nuestro primer objetivo será cuantificar, con esta metodología más robusta, el efecto de la deleción de IFT88 sobre la prevalencia de cilios. Anteriormente, lo hemos medido mediante el uso de inmunofluorescencia y lo hemos estimado en una reducción del 20%6. Este método también se puede combinar con la inmunohistoquímica para obtener imágenes de cilios primarios en combinación con otras proteínas, por ejemplo, una proteína de la membrana celular.
El transgén en ARL13B puede tener un efecto sobre la expresión de ARL13B y la longitud de los cilios primarios. Estudios previos han medido diferentes longitudes de cilios primarios con la línea ARL13B-CENTRIN-2 en comparación con ARL13B no transgénito en ciertas regiones del cerebro del ratón, sin diferencia en otras16. Otro estudio observó diferencias en la longitud de los cilios primarios en una línea de ratón ARL13B marcada con GFP en comparación con ARL13B no marcada en fibroblastos embrionarios de ratón10. El trabajo en curso está verificando cualquier cambio en la longitud de los cilios primarios en la placa de crecimiento y otros tejidos mediante la comparación de los resultados utilizando la línea de ratón ARL13B-CENTRIN-2 con tinción de anticuerpos contra ARL13B no transgénico.
El canal de análisis de imágenes en este protocolo se diseñó para medir posteriormente el porcentaje de ciliación, la longitud y la orientación 3D de los cilios primarios, así como el número de centriolos y la posición en la placa de crecimiento. El software de análisis de imágenes permite realizar canalizaciones personalizadas cambiando los pasos involucrados. La salida de esta canalización es una hoja de cálculo con las medidas de las características elegidas para las células, cilios y centriolos detectados. El posanálisis se puede realizar en R u otro software de acuerdo con los propósitos del estudio. Al igual que con la configuración de imágenes, los pasos de la tubería y la configuración específica se pueden cambiar para trabajar en diferentes imágenes y de acuerdo con los objetivos del estudio. En general, este método permite un análisis de alto rendimiento de los cilios primarios que el que se ha publicado anteriormente en la placa de crecimiento. El número de células y cilios asociados que se pueden estudiar permite mediciones más grandes y fiables.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos a todos los miembros del personal de BSU en el Instituto Kennedy de Reumatología, particularmente a Albertino Bonifacio, por la cría de animales. Agradecemos al Centro de Excelencia de Imágenes Biomédicas de Oxford-ZEISS por su ayuda en el uso del microscopio, en particular, al Dr. Jacky (Ka Long) Ko por su ayuda en el desarrollo de la línea de análisis de imágenes. Este trabajo fue apoyado por la beca de investigación en reumatología del Kennedy Trust (Johnson) y el Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC, BB/X007049/1).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 22 x 50 mm cubreobjetos | fisherscientific | ||
| arivis software Vision4D | Zeiss | N/A | Software de análisis de imágenes |
| Microscopio de barrido láser confocal | Zeiss Zeiss | 980 Airyscan 2 | |
| CoverGrip Sellador de cubreobjetos | Biotio | 23005 | |
| Cryofilm tipo 3C(16UF) (tipo hoja) 2,0 cm de ancho | Section-lab | C-FUF303 | Se puede comprar directamente en Section-lab |
| Cryostat | Leica | CM1900 UV | |
| DAPI | invitrogen | D1306 | |
| Moldes de base desechables | epredia | 58952 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | gibco | 14190 | |
| Formalin | Sigma | 20260630 | |
| Imaris software | Instrumentos de Oxford | N/A | Software de análisis de imágenes para reconstrucción 3D |
| Aceite de inmersión 518F | Zeiss | ISO 8036 | |
| Cuchillas de micrótomo | Feather | 02.075.00.006 | |
| SlowFade Glass Antifade Mountant | invitrogen | S36917 | |
| Sacarosa | Sigma | S9378 | |
| Super Cryoembedding Medium (SCEM) | Section-lab | C-EM001 | Se puede comprar directamente en Section-lab |
| Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio | avantor | 631-0108 | |
| Zen software | Zeiss | N/A | Freeware para microscopía de barrido láser confocal |
Referencias
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