Artículo de método

Caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos

DOI:

10.3791/67699

⸱

28 de febrero de 2025

 ,  ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 3Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, demostramos el método de caracterización de vesículas extracelulares (EV) recolectadas de fluidos biológicos, como lágrimas y saliva, de sujetos humanos. El escáner utilizado en este método es capaz de detectar el fenotipo, el tamaño y el recuento total de partículas de los EV a partir de 1 μL de la muestra.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las vesículas extracelulares (VE) son estructuras que se producen a partir de las células y participan en la comunicación intercelular transportando biomoléculas de una célula a otra. Se ha demostrado que los vehículos eléctricos recorren distancias cortas y lejanas en el cuerpo y son específicos de los tejidos. Las VE no solo se encuentran en los tejidos, sino que también se pueden encontrar en prácticamente todos los fluidos corporales, como las lágrimas, la saliva, el líquido cefalorraquídeo, la sangre, etc. A pesar de que los VE se pueden recolectar de manera no invasiva de las lágrimas y la saliva, solo se pueden recolectar pequeños volúmenes a la vez, lo que puede causar problemas para obtener suficientes EV para analizar proteínas. El escáner del que se habla en este artículo es un analizador de nanopartículas que proporciona una solución a este problema, lo que nos permite caracterizar y estudiar el fenotipo, el tamaño y el recuento total de partículas de los EV a partir de tan solo 1 μL de fluido biológico. Este protocolo ampliará el conocimiento de los VE a partir de pequeños volúmenes de muestras que son difíciles de extraer de los pacientes. Esto podría mejorar la comodidad del paciente y, potencialmente, identificar nuevos objetivos terapéuticos para una serie de enfermedades y trastornos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células se comunican con las células vecinas a través de varios mecanismos de señalización, incluida la liberación de vesículas extracelulares (EV), que desempeñan un papel clave en la comunicación intercelular. Los VE participan en la comunicación intercelular al pasar carga genética, como ADN, ARN y proteínas, de una célula a otra 1,2,3,4,5. En la actualidad, existen tres categorías de VE: exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos, que se caracterizan por su tamaño. Los exosomas son los más pequeños, con un diámetro de 30-150 nm 6,7,8, y se forman a partir del sistema de membrana endosomal 9,10,11 (Figura 1). Las microvesículas son más grandes que los exosomas en el sentido de que oscilan entre 100 y 1000 nm 12,13,14 y brotan de la membrana plasmática 11,12,13 (Figura 1). Los cuerpos apoptóticos son los más grandes de los EV y oscilan entre 1000 y 5000 nm 12,14,15, y también brotan de la membrana plasmática 12,16,17 (Figura 1). Además del tamaño, los VE se pueden clasificar en función de otras características biofísicas, que incluyen la densidad, los marcadores moleculares como CD63, CD81, CD9 y también el mecanismo de biogénesis18. Los vehículos eléctricos pueden recorrer distancias cortas entre células adyacentes y largas distancias en todo el cuerpo 19,20,21,22,23. Los VE se pueden encontrar en fluidos biológicos como la sangre 24,25,26, el líquido cefalorraquídeo 27,28,29, las lágrimas 30,31,32 y la saliva 33,34,35, por nombrar algunos.

Hasta la fecha, la ultracentrifugación es uno de los métodos más conocidos para aislar los VE de las muestras 36,37,38. Este método requiere múltiples rondas de centrifugaciones y ultracentrifugación, que se pueden llevar a cabo aumentando la velocidad para aislar los EV de las células y los restos celulares. Este método se puede iniciar con la velocidad baja con celdas de pellets que será seguida por una velocidad media para eliminar las vesículas más grandes y, finalmente, un paso de ultracentrifugación a los pellets EVs18. Si bien la ultracentrifugación se considera el mejor método para el aislamiento, aún existen algunas limitaciones en el sentido de que cambia la morfología de los VE 39,40,41. Otra técnica utilizada para aislar los VE es la citometría de flujo, que destaca las ventajas de la evaluación de múltiples puntos de tiempo y puntos finales y el análisis de un solo EV de alto rendimiento. Sin embargo, las limitaciones de la citometría de flujo incluyen, entre otras, la obstrucción de los poros y las señales débiles. Otro enfoque utilizado es la centrifugación en gradiente, que utiliza materiales con diferentes densidades para centrifugar con los VE y permite una mejor separación de los VE en comparación con la ultracentrifugación. Aunque esta técnica mejora la separación, requiere mucha mano de obra, requiere mucho tiempo y puede provocar una pérdida significativa de la muestra. Además, la precipitación y la filtración también se pueden utilizar para aislar los vehículos eléctricos. Ambas técnicas son sencillas y rápidas, pero ambas pueden provocar la contaminación de la muestra. Si bien existen varias técnicas para aislar las VE, cada técnica tiene sus ventajas y limitaciones, que se enumeran a continuación (Tabla 1) 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55, 56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67.

Una vez que se han aislado los VE, se pueden realizar ensayos moleculares para caracterizarlos. Las Western blots son un ensayo común para buscar la expresión de proteínas de superficie y carga 68,69,70 y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para la expresión de miRNA 71,72,73 para EV 74,75,76. Estos ensayos están establecidos y pueden generar resultados intrigantes. Una limitación de estos métodos es que requieren una gran cantidad de proteínas o ARN de EV para obtener una lectura de77, lo cual es un problema para las muestras que tienen un volumen o concentración de EV pequeño, para empezar.

El analizador de nanopartículas discutido en este documento permite al usuario superar muchas de las limitaciones establecidas en la Tabla 1 y la Tabla 2 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90 . Este método no requiere la utilización de técnicas de aislamiento, lo que ayudará a superar el rendimiento reducido de los vehículos eléctricos. Este método también permite al usuario analizar las proteínas de superficie y de carga, el recuento total de EV y el tamaño de EV a partir de un volumen de muestra de tan solo 1 μL. Esto se hace mediante el uso de chips de tetraspanina proporcionados por la compañía que utiliza un microarray de anticuerpos con anticuerpos de tetraspanina, CD63, CD81 y CD9, para identificar EV en una solución, como se muestra en la Figura 2. Los anticuerpos fluorescentes confirman la presencia de VE, además de evitar que las partículas contaminantes sesguen los resultados.

El objetivo general de esta técnica es proporcionar un método que requiera menos tiempo para analizar los VE, así como analizar los VE a partir de un pequeño volumen de muestra. El uso de este analizador de nanopartículas permite a los usuarios analizar el tamaño, el recuento total de partículas y las proteínas de la superficie de tan solo 1 μL de una muestra, lo que es ideal para fluidos biológicos como lágrimas y saliva.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los estudios descritos se adhirieron a la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento escrito de cada sujeto antes de ser incluido en el estudio. Se recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Universitario de Aarhus (1-10-72-77-14) y del Instituto Dean McGee (1576837-2) de acuerdo con las pautas federales e institucionales. Antes del procesamiento, todas las muestras de lágrimas y saliva fueron anonimizadas. Todos los estudios fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional Regional del Norte de Texas (#2020-030). El siguiente protocolo se adhiere a todas las pautas y ha sido aprobado, como se mencionó anteriormente.

1. Día 1: Preparación de la muestra e incubación

  1. Recoja muestras de fluido biológico, es decir, lágrimas y saliva de un sujeto o descongele muestras del congelador.
    1. Desgarros: Recoger las lágrimas del menisco lateral de forma pasiva mediante un tubo capilar de vidrio.
      1. Coloque el tubo capilar de vidrio en el párpado inferior, teniendo cuidado de no tocar la córnea.
      2. Recoja un volumen de 10 μL de lágrimas en 10 minutos.
      3. Utilice las lágrimas inmediatamente o guárdelas a -20 °C.
    2. Saliva: Recoja la saliva de la baba pasiva en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml
      1. Permita que el donante acumule saliva en su boca.
      2. Pídele al donante que babee en el tubo con un embudo.
      3. Utilice la saliva inmediatamente o guárdela a -20 °C.
  2. Coloque los chips de tetraspanina en la placa de arandela de virutas durante 15 minutos antes de agregar las muestras para permitir que alcancen la temperatura ambiente. Al colocar las virutas en el pocillo, asegúrese de que los números estén en la parte inferior hacia arriba y que las virutas no toquen las paredes laterales de los pocillos.
  3. Registre el número de identificación y el número de chip en el cuaderno para realizar un seguimiento de los chips.
  4. Conecte el bus serie universal (USB) que viene con el kit y extraiga y guarde la carpeta con el número de kit asociado en un área designada de su elección.
  5. Pipetear 99 μL de solución B en un tubo de 1,5 mL.
  6. Agregue 1 μL de líquido biológico en el tubo de 1,5 mL preparado en el paso anterior.
  7. Gira por los tubos.
  8. Tome 70 μL de la solución del paso 1.6 y pipetee el chip de tetraspanina.
  9. Coloque la película en la placa de lavado de virutas para evitar que la muestra se evapore.
  10. Incubar durante 16 h a temperatura ambiente (RT) en un banco sin vibraciones.

2. Día 2: Lavado de virutas

  1. Enciende la lavadora de chips.
  2. Retire la película del paso 1.9 de la placa.
  3. Coloque la placa en la arandela de virutas, asegurándose de que encaje en su lugar, y cierre la tapa.
    NOTA: La placa no se moverá fácilmente si se bloquea correctamente en su lugar.
  4. Presione la opción CW-TETRA v0 en la arandela de virutas.
  5. Seleccione la fila inicial y el número de filas que desea lavar.
  6. Presione Continuar en la lavadora de chips.
  7. Mientras se lavan los chips, prepare la solución de bloqueo que contiene los anticuerpos en un tubo de la siguiente manera:
    1. Prepare 300 μL de solución de bloqueo por chip.
    2. Añadir 0,6 μL o cada anticuerpo por chip (vórtice y reducir los anticuerpos antes de añadirlos a la solución de bloqueo)
    3. Vortex, la solución bloqueante + cóctel de anticuerpos.
      NOTA: Cubra la solución de bloqueo + cóctel de anticuerpos de la luz para garantizar la estabilidad del anticuerpo. Esto debe hacerse el día de uso.
  8. Cuando la lavadora de virutas emita un chirrido, agregue 250 μL de la solución de bloqueo + cóctel de anticuerpos encima de las virutas.
  9. Cierre la tapa y presione Continuar.
    NOTA: La lavadora de virutas ahora realizará una incubación de 1 hora junto con varias rondas adicionales de lavado y enjuague.
  10. Cuando la arandela de virutas emita un chirrido, retire la placa de lavado de virutas y mueva las virutas por la rampa.
  11. Vuelva a colocar la placa en la arandela de virutas, asegurándose de que encaje en su lugar. Cierre la tapa y presione Continuar.
  12. Cuando la lavadora de virutas complete el programa, retire la placa y coloque las virutas sobre una toalla de papel. Cubra las virutas de la luz.

3. Día 2: Escaneo de los chips

  1. Encienda el escáner y abra el software de escaneo.
    NOTA: El escáner se someterá a autocomprobaciones para indicar si hay algún error o si se puede continuar con el escaneo.
  2. Seleccione Guardar carpeta y elija la ubicación para guardar los archivos.
  3. Seleccione Carpeta ChipFile y elija la carpeta guardada en el paso 1.4.
  4. Seleccione la opción desplegable para elegir cada viruta y ubicarla en la posición de la viruta en el mandril. Repita este paso para todos los chips que deban escanearse.
  5. Encienda la fluorescencia haciendo clic en los tres cuadrados debajo de la posición de la ficha. Los cuadrados se volverán amarillos, azules y rojos, respectivamente.
  6. Retire la tapa del mandril presionando la tapa hacia abajo y tire de ella.
  7. Coloque la(s) viruta(s) en el mandril, asegurándose de que estén firmemente aseguradas.
  8. Vuelva a colocar la tapa del mandril colocando las clavijas en los orificios, presione hacia abajo y deslice la tapa para bloquearla en su lugar.
  9. Coloque el mandril en la plataforma, asegurándose de que encaje en su lugar.
  10. Seleccione Escanear fichas.
  11. Seleccione Aceptar.
  12. Una vez que la platina se haya movido completamente dentro de la máquina, cierre la puerta.
    NOTA: Se tarda aproximadamente 12 minutos en escanear un solo chip.
  13. Una vez que el programa haya terminado de escanear los chips, abra la puerta para expulsar la etapa y verifique si los escaneos fueron exitosos.
    1. Si los escaneos fueron exitosos, deseche las virutas y coloque el siguiente conjunto de virutas en el mandril, o devuelva el mandril vacío a la plataforma. Luego, salga del software y apague la máquina cuando haya terminado.
    2. Si los análisis no se realizaron correctamente, observe el código de error y corríjalo.

4. Tratamiento de datos

  1. Abra el software de análisis.
  2. Seleccione Datos de escaneo previo y elija la carpeta que tiene el escaneo del día 2 paso 3.2.
  3. Seleccione Siguiente.
  4. Etiquete los chips en la columna Nombre de la muestra con el nombre de la muestra haciendo clic en la celda y escribiendo el ID de la muestra.
  5. A continuación, etiquete las tetraspaninas en la columna Nombre del canal . Rojo = CD63, verde = CD81 y azul = CD9.
  6. Seleccione Siguiente.
  7. Seleccione CV alto en el grupo Seleccionar punto para inspeccionar el cuadro desplegable y desactivar los CV altos para cada chip desactivando uno o dos puntos.
  8. A continuación, seleccione Recuento alto e intente desactivar las advertencias de recuento alto.
    NOTA: Algunas muestras pueden tener un recuento demasiado alto, pero aún así se pueden analizar.
  9. Seleccione Todos los puntos en el menú desplegable, seleccione Montaje de puntos y compruebe visualmente cada chip en busca de deformidades o arañazos que puedan estar presentes.
  10. Seleccione Siguiente.
  11. En el canal CD63, establezca el mínimo en 300 para deshacerse de los glóbulos rojos de la fila Promedio % incluido; Las células amarillas están bien y pasan al canal CD81. Si establecer el valor mínimo en 300 no cambia la celda roja a amarillo o blanco, continúe con el paso 4.14 para solucionar problemas.
  12. En el canal CD81, establezca el mínimo en 300 para deshacerse de los glóbulos rojos en la fila Promedio % incluido; Las células amarillas están bien y pasan al canal CD9. Si establecer el valor mínimo en 300 no cambia la celda roja a amarillo o blanco, continúe con el paso 4.14 para solucionar problemas.
  13. En el canal CD9, establezca el mínimo en 400 para deshacerse de los glóbulos rojos de la fila Promedio de % incluido; Las celdas amarillas están bien y continúe con el paso 4.15. Si establecer el valor mínimo en 400 no cambia la celda roja a amarillo o blanco, continúe con el paso 4.14 para solucionar problemas.
  14. Solución de problemas
    1. Aumente el valor mínimo en 100 unidades.
    2. Si el paso 4.14.1 no funcionó, seleccione la ficha en la sección Seleccionar fichas para trabajar y elija la ficha. Seleccione Recuento de partículas y desactive las manchas que tengan un alto recuento de partículas. Seleccione Intensidad/Tamaño, seleccione Todas las fichas y vea si esto resuelve el problema.
    3. Si el paso 4.14.2 no funcionó, seleccione la ficha en la sección Seleccionar fichas para trabajar y elija la ficha. Seleccione Cortes de un solo chip y aumente el mínimo en 100 unidades. A continuación, seleccione Todas las fichas para ver si la célula roja es ahora amarilla. Si esto no funciona, repita este paso hasta que la celda Promedio de % incluido sea ahora amarilla o blanca.
  15. Seleccione Siguiente.
  16. Anule la selección del canal de mensajería instantánea.
  17. Establezca el valor del mapa de calor en la esquina inferior derecha para incluir todas las partículas y seleccione Agregar trazado al informe.
    1. Ajuste el número máximo en el cuadro desplegable e introduzca manualmente un valor.
  18. A continuación, seleccione el menú desplegable en la parte superior central debajo de Sondas de captura y seleccione CD63.
  19. Seleccione Agregar trazado al informe para agregar el recuento total de partículas al informe.
  20. Seleccione el menú desplegable en Modo de análisis, elija Colocalización y Agregar trazado al informe.
  21. A continuación, seleccione Tamaño, seleccione Cambiar vista a Trazar y seleccione Agregar trazado al informe.
  22. Por último, seleccione Imágenes y seleccione Agregar trazado al informe.
  23. Repita los pasos 4.18 a 4.22 para CD81 y CD9, asegurándose de anular la selección del canal de mensajería instantánea cada vez.
  24. Una vez que se hayan agregado todos los elementos al informe, seleccione Exportar informe, asegúrese de que se guarde en el archivo correcto y seleccione Carpeta.
    NOTA: Se han generado archivos e imágenes de Excel y ahora se pueden utilizar para análisis posteriores.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al analizar los puntos en los chips, apunte a una concentración óptima de EV observando EV marcados con fluorescencia en los canales CD63, CD81 y CD9, y el canal MIgG30,91 debe permanecer negro, ya que este es el canal de control como se ve en la Figura 3A. CD81 se reducirá para los fluidos biológicos. Si no hay fluorescencia en los canales CD63, CD81 y CD9, hay ausencia de EV (Figura 3B). Tenga cuidado de no saturar demasiado el chip (Figura 3C). Esto dificultará que el software de análisis calcule la precisión del tamaño, el recuento total de partículas y los fenotipos de los EV. A partir de los puntos de la concentración óptima, el software de análisis podrá medir el tamaño (50-200 nm), el recuento total de partículas y la expresión de tetraspanina de los EV (Figura 4) y se exportará a hojas de cálculo individuales para su posterior análisis. El análisis de tetraspanina incluirá la colocalización de las proteínas de superficie en los EV. La colocalización se representará con un "/", por ejemplo, "CD63/CD81". Esto no significa que CD63 y CD81 estén combinados; significa que tanto el CD63 como el CD81 se encuentran en la superficie del vehículo eléctrico.

Estos resultados proporcionarán información valiosa entre muestras sanas y enfermas. Podremos determinar si las muestras sanas o las muestras enfermas producen más VEs, VE más grandes o más pequeñas, y el fenotipo de las VEs. Cualquiera o todas estas características podrían desempeñar un papel en la biogénesis y/o progresión de la enfermedad. Con estos resultados, podremos ver si hay una ausencia o un aumento de los niveles de tetraspanina, lo que puede proporcionar información sobre los procesos celulares y la formación de EV.

figure-results-1
Figura 1: Los tipos y tamaños de los diferentes vehículos eléctricos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Esquema de cómo los chips de tetraspanina capturan y detectan los EV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Optimización de las concentraciones de vehículos eléctricos. (A) Concentración óptima de vehículos eléctricos. (B) Resultado negativo: no hay vehículos eléctricos presentes. (C) Sobresaturación de vehículos eléctricos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Datos generados por el analizador de nanopartículas. (A) Tamaño del diámetro EV medido en nanómetros. (B) Recuento total de partículas de los vehículos eléctricos. (C) Fenotipo colocalizado EV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

TécnicaVentajasLimitaciones
UltracentrífugaAlta pureza42,43Cambios en la morfología del EV42,44
Homogeneidad42,45Requiere gran volumen42,44,46
Funcionalidad42,43Caro42,43
Citometría de flujoEvalúe muestras en múltiples puntos de tiempo47Señal débil48,49
Múltiples puntos finales47,50Poros obstruidos51
Análisis de EV individual de alto rendimiento52,53
Centrifugación en gradiente de densidadProducir muestras de alta pureza54Laboriosa55,56
Variedad de muestras55,57Consumo de tiempo55,58 
Pérdida significativa de rendimiento54
PrecipitaciónSencillo59,60Contaminación36,44,61
Rápido61,62Inespecífico63
Alto rendimiento44,59,62
pH neutro36
FiltraciónSimple64 Trampa de exosomas65
Rápido64Daña las vesículas grandes36
Barato64Torta de filtración66,67
Obstrucción de exosomas65

Tabla 1: Ventajas y limitaciones de las técnicas de aislamiento de VE. Una lista de las diversas formas de aislar los vehículos eléctricos, incluidas sus ventajas y limitaciones.

TécnicaVentajasLimitaciones
Dispersión dinámica de la luzMida partículas de tamaño que oscilan entre 1 nm y 6 μM78 No es adecuado para medir muestras complejas de exosomas con un amplio rango de tamaños79 
El límite inferior es de 10 nm, adecuado para sistemas monodispersos79 No es capaz de distinguir las proteínas contaminadas de los exosomas79
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)Observar la morfología de los exosomas79,80 Complicadas preparaciones de muestras79 
Observar la estructura interna81 No es capaz de distinguir exosomas en función del tamaño y la forma debido a señales de fluorescencia exageradas82 
Análisis de seguimiento de nanopartículasMida la concentración, el tamaño y la distribución del tamaño de los exosomas en el rango de 10 nm a 2 μM78 No puede diferenciar los VE de los agregados de proteínas y otros contaminantes83 
Preparación y medición rápida de muestras78,84Costoso instrumento NTA85 
Las muestras se pueden recuperar en forma nativa84 Sensible a las vibraciones85
Western Blot (WBs)puede analizar cualitativa y cuantitativamente proteínas marcadoras79,86 Complicado y lento79 
Análisis de exosomas a partir de medios de cultivo celular79 Los aislados de EV pueden contener lipoproteínas y otros contaminantes86 
Citometría de flujoMayor sensibilidad e imágenes de alta resolución paraLaborioso y laborioso con límite de detección de 400 nm79,88 
Distinguir los exosomas teñidos de las contenciones87 
Baja concentración de muestra requerida79 Las señales ópticas dificultan la precisión y la resolución88 
ExoviewMedición de tetraspaninas (CD9, CD63 y CD81) en exosomas89 No mide tamaños EV más grandes75
Mide las proteínas de carga de los vehículos eléctricos90

Tabla 2: Ventajas y limitaciones de las técnicas de caracterización de VE.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El paso más crítico de este protocolo es asegurarse de que se logre una concentración óptima de vehículos eléctricos. Es necesario que haya suficientes vehículos eléctricos para obtener una lectura, pero no demasiados vehículos eléctricos que sobresaturen el chip. La mejor manera de determinar la concentración óptima de EV es hacer una ejecución de optimización con 1 μL de muestra y ver si es necesario ajustar la concentración. Otro paso crítico es ver si hay una abundancia de restos celulares en la muestra, lo que se puede determinar observando grandes trozos en los chips en el software de análisis. Si la muestra tiene restos celulares, una simple centrifugación o filtrado de la muestra debería resolver este problema.

Un paso adicional y crucial es asegurarse de que las virutas no toquen las paredes del pozo y evitar el contacto con el área central de las virutas al colocarlas en la rampa. El escáner leerá desde el cuadrado en el centro del chip, por lo que es esencial evitar tocar esa área con las pinzas para evitar interrumpir los EV.

Este método tiene algunas limitaciones, como tener una concentración insuficiente de EV para la detección por parte del instrumento. La concentración podría mejorarse mediante el secado de la muestra o el uso de un tubo concentrador. Otra limitación es que el software de análisis solo mide EV en el rango de 50-200 nm, excluyendo algunas microvesículas y todos los cuerpos apoptóticos de las mediciones de tamaño75.

Hay muchas formas de aislar (Tabla 1 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56,57,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67) y analizar los vehículos eléctricos (Tabla 2 78,79,80,81,82,83,84,85, 86,87,88,89,90), y el estándar de oro actual para el aislamiento de EV es la ultracentrifugación 36,37,38 para granular las células para ensayos como Western Blots 68,69,70 y PCR 71,72,73,74,75,76. Si bien este protocolo funciona bien para muestras grandes 42,44,46, la obtención de fluidos biológicos puede ser un desafío y, a menudo, solo se puede recolectar un pequeño volumen de muestras a la vez, lo que no es ideal para la ultracentrifugación. Por el contrario, el uso de este analizador de nanopartículas permite al usuario generar datos valiosos, como el tamaño, el recuento total de partículas y el fenotipo de los EV, en tan solo 1 μL de muestra, lo que lo hace ideal para fluidos biológicos. Podremos ampliar el conocimiento de los VE a partir de pequeños volúmenes de muestras que son difíciles de extraer, lo que puede aumentar la comodidad del paciente y posiblemente encontrar posibles dianas terapéuticas para diversas enfermedades y trastornos.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a los NIH por la financiación (EY031316 y EY034714). También nos gustaría agradecer a UNTHSC y NTERI por el espacio de laboratorio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ChipWasher 100NanoViewEV-CW100Incuba, lava, enjuaga y seca las virutas de tetraspanina. Este modelo actual ya no está disponible. Precio al momento de la compra: $9,995.00 
El software ExoView AnalyzerNanoViewN/Aanaliza la información del chip y produce archivos de Excel para su posterior análisis. Ya no está disponible.
ExoView R100NanoViewEV-R100Se utiliza para escanear los chips de tetraspanina a 3 longitudes de onda. Este modelo actual ya no está disponible. Precio en el momento de la compra:  $110,000.00
Software ExoView ScannerNanoViewN/AEscanea los chips en 3 longitudes de onda diferentes. Ya no está disponible.
Kits de Tetraspanin HumanoUnchained LabsEV-TETRA-CIncluye 8 chips de tetraspanina, solución de incubación, solución de bloqueo, anticuerpo CD63, anticuerpo CD81, anticuerpo CD9, solución A, solución B, USB y cubierta de placa.

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Radler, J., Gupta, D., Zickler, A., Andaloussi, S. E. Exploiting the biogenesis of extracellular vesicles for bioengineering and therapeutic cargo loading. Mol Ther. 31 (5), 1231-1250 (2023).
  3. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 113961(2021).
  4. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  6. Zhang, H., et al. Exosome-induced regulation in inflammatory bowel disease. Front Immunol. 10, 1464(2019).
  7. Barzin, M., et al. Application of plant-derived exosome-like nanoparticles in drug delivery. Pharm Dev Technol. 28 (5), 383-402 (2023).
  8. Zhou, C., et al. Stem cell-derived exosomes: emerging therapeutic opportunities for wound healing. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 107(2023).
  9. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), aau6977(2020).
  10. Mondal, J., et al. Hybrid exosomes, exosome-like nanovesicles and engineered exosomes for therapeutic applications. J Control Release. 353, 1127-1149 (2023).
  11. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  12. Paul, N., Sultana, Z., Fisher, J. J., Maiti, K., Smith, R. Extracellular vesicles- crucial players in human pregnancy. Placenta. 140, 30-38 (2023).
  13. Zaldivia, M. T. K., McFadyen, J. D., Lim, B., Wang, X., Peter, K. Platelet-derived microvesicles in cardiovascular diseases. Front Cardiovasc Med. 4, 74(2017).
  14. Tamasi, V., Nemeth, K., Csala, M. Role of extracellular vesicles in liver diseases. Life (Basel). 13 (5), 1117(2023).
  15. Fu, Y., et al. Emerging understanding of apoptosis in mediating mesenchymal stem cell therapy. Cell Death Dis. 12 (6), 596(2021).
  16. Santavanond, J. P., Rutter, S. F., Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. H. Apoptotic bodies: Mechanism of formation, isolation and functional relevance. Subcell Biochem. 97, 61-88 (2021).
  17. Yu, L., et al. Apoptotic bodies: bioactive treasure left behind by the dying cells with robust diagnostic and therapeutic application potentials. J Nanobiotechnology. 21 (1), 218(2023).
  18. Momen-Heravi, F., Getting, S. J., Moschos, S. A. Extracellular vesicles and their nucleic acids for biomarker discovery. Pharmacol Ther. 192, 170-187 (2018).
  19. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  20. Grange, C., Bussolati, B. Extracellular vesicles in kidney disease. Nat Rev Nephrol. 18 (8), 499-513 (2022).
  21. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends Cell Biol. 25 (6), 364-372 (2015).
  22. Iannotta, D. A. A., Kijas, A. W., Rowan, A. E., Wolfram, J. Entry and exit of extracellular vesicles to and from the blood circulation. Nat Nanotechnol. 19 (1), 13-20 (2024).
  23. Saint-Pol, J., Gosselet, F., Duban-Deweer, S., Pottiez, G., Karamanos, Y. Targeting and crossing the blood-brain barrier with extracellular vesicles. Cells. 9 (4), 851(2020).
  24. Alberro, A., Iparraguirre, L., Fernandes, A., Otaegui, D. Extracellular vesicles in blood: Sources, effects, and applications. Int J Mol Sci. 22 (15), 8163(2021).
  25. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  26. Thangaraju, K., Neerukonda, S. N., Katneni, U., Buehler, P. W. Extracellular vesicles from red blood cells and their evolving roles in health, coagulopathy and therapy. Int J Mol Sci. 22 (1), 153(2020).
  27. Li, C., et al. Cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles after spinal cord injury promote vascular regeneration via PI3K/AKT signaling pathway. J Orthop Translat. 39, 124-134 (2023).
  28. Deng, Y., et al. Phosphoproteome analysis of cerebrospinal fluid extracellular vesicles in primary central nervous system lymphoma. Analyst. 148 (15), 3594-3602 (2023).
  29. Hirschberg, Y., et al. Proteomic comparison between non-purified cerebrospinal fluid and cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles from patients with Alzheimer's, Parkinson's and Lewy body dementia. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12383(2023).
  30. Hefley, B. S., et al. Revealing the presence of tear extracellular vesicles in Keratoconus. Exp Eye Res. 224, 109242(2022).
  31. Cross, T., et al. RNA profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  32. Ma, H., et al. Metabolic signatures of tear extracellular vesicles caused by herpes simplex keratitis. Ocul Surf. 31, 21-30 (2024).
  33. Han, P., Bartold, P. M., Ivanovski, S. The emerging role of small extracellular vesicles in saliva and gingival crevicular fluid as diagnostics for periodontitis. J Periodontal Res. 57 (1), 219-231 (2022).
  34. Han, P., Li, X., Wei, W., Ivanovski, S. Saliva diagnosis using small extracellular vesicles and salivaomics. Methods Mol Biol. 2588, 25-39 (2023).
  35. Reseco, L., et al. Characterization of extracellular vesicles from human saliva: Effects of age and isolation techniques. Cells. 13 (1), 95(2024).
  36. Tiwari, S., Kumar, V., Randhawa, S., Verma, S. K. Preparation and characterization of extracellular vesicles. Am J Reprod Immunol. 85 (2), e13367(2021).
  37. Tomiyama, E., Fujita, K., Nonomura, N. Urinary extracellular vesicles: Ultracentrifugation method. Methods Mol Biol. 2292, 173-181 (2021).
  38. Xu, K., Jin, Y., Li, Y., Huang, Y., Zhao, R. Recent progress of exosome isolation and peptide recognition-guided strategies for exosome research. Front Chem. 10, 844124(2022).
  39. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  40. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  41. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  42. Ansari, F. J., et al. Comparison of the efficiency of ultrafiltration, precipitation, and ultracentrifugation methods for exosome isolation. Biochem Biophys Rep. 38, 101668(2024).
  43. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  44. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604(2021).
  45. Le Roy, A., et al. AUC and small-angle scattering for membrane proteins. Methods Enzymol. 562, 257-286 (2015).
  46. Chhoy, P., Brown, C. W., Amante, J. J., Mercurio, A. M. Protocol for the separation of extracellular vesicles by ultracentrifugation from in vitro cell culture models. STAR Protoc. 2 (1), 100303(2021).
  47. McDorman, K. S., Chan, C., Rojko, J., Satterwhite, C. M., Morrison, J. P. Chapter 7 - Special Techniques in Toxicologic Pathology. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology (Third Edition). , Academic Press. (2013).
  48. Woud, W. W., et al. An imaging flow cytometry-based methodology for the analysis of single extracellular vesicles in unprocessed human plasma. Commun Biol. 5 (1), 633(2022).
  49. Gul, B., Syed, F., Khan, S., Iqbal, A., Ahmad, I. Characterization of extracellular vesicles by flow cytometry: Challenges and promises. Micron. 161, 103341(2022).
  50. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-based screening using high-throughput flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
  51. Safford, H. R., Bischel, H. N. Flow cytometry applications in water treatment, distribution, and reuse: A review. Water Res. 151, 110-133 (2019).
  52. Kobayashi, H., et al. Precise analysis of single small extracellular vesicles using flow cytometry. Sci Rep. 14 (1), 7465(2024).
  53. Welsh, J. A., et al. A compendium of single extracellular vesicle flow cytometry. J Extracell Vesicles. 12 (2), e12299(2023).
  54. Carnino, J. M., Lee, H. Extracellular vesicles in respiratory disease. Adv Clin Chem. 108, 105-127 (2022).
  55. Sun, Y., Sethu, P. Low-stress microfluidic density-gradient centrifugation for blood cell sorting. Biomed Microdevices. 20 (3), 77(2018).
  56. Strachan, B. C., Xia, H., Voros, E., Gifford, S. C., Shevkoplyas, S. S. Improved expansion of T cells in culture when isolated with an equipment-free, high-throughput, flow-through microfluidic module versus traditional density gradient centrifugation. Cytotherapy. 21 (2), 234-245 (2019).
  57. Malvezzi, H., Sharma, R., Agarwal, A., Abuzenadah, A. M., Abu-Elmagd, M. Sperm quality after density gradient centrifugation with three commercially available media: a controlled trial. Reprod Biol Endocrinol. 12, 121(2014).
  58. Sun, Y., Sethu, P. Microfluidic adaptation of density-gradient centrifugation for isolation of particles and cells. Bioengineering (Basel). 4 (3), 67(2017).
  59. Karttunen, J., et al. Precipitation-based extracellular vesicle isolation from rat plasma co-precipitate vesicle-free microRNAs. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1555410(2019).
  60. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  61. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  62. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  63. Konoshenko, M. Y., et al. Isolation of extracellular vesicles from biological fluids via the aggregation-precipitation approach for downstream miRNAs detection. Diagnostics (Basel). 11 (3), 384(2021).
  64. Drozdz, A., et al. Low-vacuum filtration as an alternative extracellular vesicle concentration method: A comparison with ultracentrifugation and differential centrifugation. Pharmaceutics. 12 (9), 872(2020).
  65. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186(2022).
  66. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971(2021).
  67. Helling, A., et al. Investigation of microbial cell deformability by filter cake compressibility using ultrafiltration membranes. Colloids Surf B Biointerfaces. 185, 110626(2020).
  68. Bagci, C., et al. Overview of extracellular vesicle characterization techniques and introduction to combined reflectance and fluorescence confocal microscopy to distinguish extracellular vesicle subpopulations. Neurophotonics. 9 (2), 021903(2022).
  69. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. van Maanen, J. C., et al. A combined western and bead-based multiplex platform to characterize extracellular vesicles. Tissue Eng Part C Methods. 29 (11), 493-504 (2023).
  71. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: Sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  72. Lee, H., He, X., Le, T., Carnino, J. M., Jin, Y. Single-step RT-qPCR for detection of extracellular vesicle microRNAs in vivo: a time- and cost-effective method. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (4), L742-L749 (2020).
  73. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  74. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  75. Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. J Extracell Vesicles. 10 (10), e12130(2021).
  76. Salunkhe, S., Basak Dheeraj, M., Chitkara, D., Mittal, A. Surface functionalization of exosomes for target-specific delivery and in vivo imaging, tracking: Strategies and significance. J Control Release. 326, 599-614 (2020).
  77. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Adv Drug Deliv Rev. 179, 114001(2021).
  78. Gurunathan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the isolation, characterization, biological function, and multifarious therapeutic approaches of exosomes. Cells. 8 (4), 307(2019).
  79. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  80. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  81. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  82. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular vesicles: Composition, biological relevance, and methods of study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
  83. Kowkabany, G., Bao, Y. Nanoparticle tracking analysis: An effective tool to characterize extracellular vesicles. Molecules. 29 (19), 4672(2024).
  84. Li, H. Metastatic characteristics of SY86B human gastric carcinoma in athymic nude mice. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 10 (6), 421-423 (1988).
  85. Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 2, 80-103 (2021).
  86. Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends Biotechnol. 38 (10), 1066-1098 (2020).
  87. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  88. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. J Extracell Vesicles. 4, 25530(2015).
  89. Breitwieser, K., et al. Detailed characterization of small extracellular vesicles from different cell types based on tetraspanin composition by ExoView R100 platform. Int J Mol Sci. 23 (15), 8544(2022).
  90. An, H. J., Cho, H. K., Song, D. H., Kee, C. Quantitative analysis of exosomes in the aqueous humor of Korean patients with pseudoexfoliation glaucoma. Sci Rep. 12 (1), 12875(2022).
  91. Hefley, B. S., McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Ciolino, J. B., Karamichos, D. Corneal epithelial-stromal constructs to study differences associated with diabetes mellitus. Exp Eye Res. 248, 110100(2024).

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