Cuantificación del comportamiento de acicalamiento de Drosophila melanogaster para la evaluación de fenotipos de acicalamiento excesivo

Summary

El método presentado aquí implica la anotación manual de las imágenes adquiridas de Drosophila melanogaster para comportamientos específicos de acicalamiento. Permite cuantificar tanto el número de sesiones de acicalamiento como el tiempo total dedicado al acicalamiento para evaluar los fenotipos atípicos de autoacicalamiento.

Abstract

Los cambios observables en el acicalamiento estereotipado se aplican traslacionalmente en organismos modelo. Estos cambios son representativos de patologías que provocan desviaciones similares en el comportamiento humano; por ejemplo, el aseo excesivo actúa como un indicador de los comportamientos obsesivos y compulsivos presentes en afecciones como el síndrome de Tourette o el trastorno obsesivo-compulsivo. El ensayo de acicalamiento presentado permite evaluar fenotipos anormales de autoacicalamiento en Drosophila melanogaster. Las moscas se graban durante un período de 10 minutos, y estas grabaciones se observan y anotan a ciegas para los comportamientos de acicalamiento previamente definidos. Las medidas cuantitativas de la frecuencia de los combates de acicalamiento y el tiempo dedicado al aseo personal se pueden obtener anotando manualmente las imágenes. El ensayo es relativamente barato, requiere pocos materiales que no estén ya disponibles en entornos de laboratorio y es fácilmente adaptable para adaptarse a las necesidades específicas de cualquier estudio que tenga como objetivo observar el acicalamiento. Además, el bajo nivel de habilidad necesario para realizar el ensayo, en comparación con los métodos automatizados intensivos en informática, hace que el protocolo sea adecuado para laboratorios pequeños y estudiantes. Discutimos en detalle los pasos necesarios para realizar este ensayo y sus limitaciones actuales.

Introduction

Drosophila melanogaster es un organismo modelo bien establecido en estudios conductuales y neurobiológicos, que proporciona información sobre los mecanismos que impulsan comportamientos humanos análogos. El autoacicalamiento en este organismo es un comportamiento altamente regulado y bien definido, que sigue patrones estereotipados que se distinguen fácilmente entre sí¹. Los comportamientos de acicalamiento separados exhibidos por la mosca generalmente se pueden clasificar por la región anatómica², que se define más fácilmente como posterior o anterior. El acicalamiento de Drosophila se centrará inicialmente en la región anterior y posteriormente pasará al extremo posterior³. En condiciones típicas, las moscas exhiben comportamientos de acicalamiento para mantener la limpieza (por ejemplo, eliminando el polvo) y ocurren en respuesta a la exposición a estímulos externos potencialmente dañinos como microbios patógenos⁴.

Las anormalidades en el comportamiento de acicalamiento, específicamente el acicalamiento obsesivo espontáneo, se han utilizado en varios sistemas modelo como indicador de comportamiento obsesivo y/o compulsivo. Los hallazgos traslacionales que observan comportamientos obsesivos de acicalamiento en organismos como roedores, aves y caninos han dado una idea de las condiciones que provocan un comportamiento compulsivo similar^{en los seres} humanos. Estos incluyen afecciones como la tricotilomanía, el trastorno obsesivo compulsivo y el síndrome de Tourette⁶. El comportamiento de acicalamiento excesivo también se ha utilizado como punto de referencia para evaluar los fenotipos de comportamiento en modelos de condiciones de neurodesarrollo similares en Drosophila melanogaster. Se han observado comportamientos obsesivos de aseo en modelos de moscas del síndrome del cromosoma X frágil (FSX) y el trastorno del espectro autista (TEA) asociado. El exceso de acicalamiento espontáneo se produce bajo mutaciones de dfmr1, el ortólogo del gen FMR1 asociado a ASD y FSX ⁷. Además, hay un cambio notable en la distribución del acicalamiento entre los extremos posterior y anterior en estos mutantes⁸. Estos cambios se interpretan como un reflejo de los comportamientos obsesivos y compulsivos centrados en el cuerpo que muestran algunos pacientes con estas afecciones. Al utilizar el ensayo de acicalamiento descrito aquí, observamos comportamientos de acicalamiento en moscas después de una desminación mediada por ARNi del gen Atg8a de Drosophila producida por controladores GAL4 disponibles comercialmente y líneas UAS-RNAi⁹.

Este método implica la anotación manual de las imágenes tomadas de las moscas para comportamientos específicos de acicalamiento. Los estudios previos que tienen como objetivo evaluar el comportamiento de acicalamiento, como los que utilizan métodos indirectos como los tintes, si bien son efectivos para cuantificar la eficacia del acicalamiento, no permiten medir la duración o la frecuencia del acicalamiento¹⁰. Este ensayo, sin embargo, permite cuantificar la frecuencia y duración del acicalamiento de Drosophila , tanto en general como por región anatómica. El método detallado aquí presenta algunas ventajas sobre los métodos automatizados actuales, ya que es fácilmente modificable y puede ser realizado por personas que carecen de experiencia computacional. Con el equipo requerido fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios, presentamos una manera rentable de evaluar la presencia de un fenotipo de auto-aseo excesivo (ver Tabla de Materiales). Esto hace que el método sea fácilmente accesible principalmente para instituciones de pregrado y fácilmente adaptable a entornos de formación o laboratorios de enseñanza.

Protocol

NOTA: En la Figura 1 se presenta una descripción general del protocolo.

1. Preparación para el rodaje

1. Coloque cuatro platos de tres pocillos uno al lado del otro sobre una superficie blanca, cubriendo cada uno con un portaobjetos de vidrio.
2. Coloque una cámara (aquí, un sistema Raspberry Pi, pero cualquier cámara capaz de grabar video de alta definición es suficiente) sobre los platos.
   1. Verifique que todos los platos estén enmarcados y enfocados.
   2. Verifique que no haya deslumbramiento en los portaobjetos que limite la visibilidad de las moscas en el plato. Elimine el deslumbramiento ajustando la posición de la placa o atenuando las luces en el espacio de grabación.
   3. Utilice alta resolución (mínimo 1920 x 1080 píxeles) para visualizar con precisión las extremidades de las moscas.
3. Marque la posición de los platos y la cámara en el banco donde se está realizando la grabación.
   NOTA: Esto limitará el tiempo dedicado al paso 2 en el uso futuro del aparato. Realizar los ensayos al mismo tiempo y en el mismo espacio limitará la variabilidad en el comportamiento en función de factores más allá de las manipulaciones intencionadas.
4. Anestesiar ligeramente a las moscas de 4 a 9 días de edad con frío sobre un bloque de hielo cubierto con parafilm y una toalla de papel (la anestesia con CO₂ tendrá un impacto significativo en el comportamiento).
   1. Golpea las moscas en el bloque y, una vez anestesiadas, muévelas a las cámaras de observación lo más rápido posible con un pincel.
      NOTA: Esta transferencia debe ocurrir lo más rápido posible, ya que la exposición excesiva a la anestesia de cualquier tipo puede afectar negativamente a las moscas.
5. Coloque una sola mosca en cada pozo.
6. Permita que los archivos se aclimaten a su nuevo entorno durante 30 minutos después de la anestesia. No toque ni moleste los pozos que contienen moscas después de este punto, ya que los factores estresantes adicionales afectarán el comportamiento.

2. Grabación de las moscas

1. Después de los 30 minutos de aclimatación, graba las moscas con una cámara.
2. Utilice una cámara Raspberry Pi ejecutada a través de PiSpy¹¹ para la recopilación de datos de comportamiento.
   NOTA: El software es gratuito y está disponible en GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy), y un sistema Pi se puede configurar fácilmente por menos de 300 dólares. Otras cámaras, si ya están disponibles, también son suficientes para grabar imágenes
3. Inicie una grabación con Pi con el siguiente flujo de comandos.
   1. Abra el terminal y escriba cd PiSpy. A continuación, escriba python3 PiSpy.py, introduzca la duración de grabación deseada e introduzca la velocidad de fotogramas deseada. Seleccione la resolución deseada y haga clic en Captura rápida.
   2. Utilice la función de vista previa de la cámara para asegurarse de que las moscas estén enfocadas y sean lo suficientemente visibles.
4. Grabe las moscas durante 10 minutos a una velocidad de fotogramas recomendada de 24 fps y guarde el archivo (PiSpy se guarda automáticamente en la carpeta de videos).

3. Análisis de vídeo (Figura 2)

1. Para analizar el vídeo, importe el archivo en el software Elan 6.8¹².
   NOTA: Este software, aunque se desarrolló originalmente para la psicolingüística, permite la anotación detallada de videos y el análisis en profundidad de los comportamientos de aseo
2. Asigne cada fila como se ilustra a continuación para anotar manualmente el material de archivo de las personas.
   1. Haga esto con el siguiente flujo de comandos: Tier > Agregar nueva ubicación de tipo de > de nivel en el plato en Nombre de nivel > Agregar.
3. Dependiendo de las necesidades de un estudio, anote y cuantifique varios comportamientos específicos (aseo anterior y posterior, caminar, dormir y estar de pie).
   1. Realice anotaciones siguiendo los pasos que se indican a continuación.
      1. Haga doble clic en el nivel que desea anotar. Haga clic con el botón derecho y arrastre el cursor a lo largo del nivel seleccionado durante un período en el que se muestre un solo combate de acicalamiento. Haga clic con el botón izquierdo, seleccione Nueva anotación y haga doble clic en el período de tiempo recién resaltado. Escriba la abreviatura del comportamiento exhibido en ese momento dado.
   2. Observe los videos lentamente, desplácelos con un mouse y haga anotaciones. Acérquese a un solo cuadro de mosca durante la anotación para evitar la identificación falsa de comportamientos. Estos podrían incluir golpear el borde del vidrio con la mosca o mover las patas, lo que inicialmente podría parecer un acicalamiento.
4. Una vez que el video esté completamente anotado, obtenga un desglose de cada comportamiento. Asegúrese de utilizar la misma abreviatura o anotación en todos los vídeos para utilizar esta función.
   NOTA: Elan 6.8 proporcionará el número de veces que ocurre un comportamiento, la duración total de los comportamientos y el tiempo medio dedicado a cada comportamiento.
   1. Defina los episodios de aseo como 2 segundos de aseo ininterrumpido. Identifique cada comportamiento observado de la siguiente manera. Definir los parámetros de las regiones anatómicas antes de la realización del ensayo.
      1. Acicalamiento anterior: Identifique el acicalamiento realizado en la región anterior del cuerpo de la mosca como acicalamiento anterior.
         NOTA: Este comportamiento casi siempre implicará un movimiento de frotamiento en una parte anterior, como la cabeza o la probóscide, con las dos patas delanteras de la mosca.
      2. Acicalamiento posterior: Identifique el acicalamiento realizado en el extremo antero-posterior del cuerpo de la mosca como acicalamiento posterior.
         NOTA: Además, se incluyeron alas en la región posterior para simplificar. Este comportamiento casi siempre implicará un movimiento de frotamiento con el conjunto central y más posterior de patas al vuelo. Un buen indicador de que se está produciendo un acicalamiento posterior será que, a primera vista, puede parecer que a la mosca le faltan sus patas más traseras, como se muestra en la Figura 2D.

Results

Este ensayo produce datos cuantitativos que miden el tiempo y la frecuencia de los comportamientos de acicalamiento a partir de imágenes anotadas. En la Figura 2 se describe una imagen representativa de la configuración y de cómo se definen los comportamientos. Dada la subjetividad introducida por el análisis de vídeo, todas las anotaciones de los vídeos deben cegarse al investigador que realiza el análisis.

Este método se utilizó para evaluar el papel que tiene e...

Discussion

En general, este ensayo fácilmente ejecutable y rentable permite una caracterización robusta del comportamiento de acicalamiento de Drosophila melanogaster . Esta técnica proporciona información sobre la frecuencia, el tiempo dedicado a la participación y la distribución anatómica de un gran número de comportamientos de aseo previamente identificados. Un buen indicador de que el acicalamiento ocurrirá o está en marcha son los cambios en la colocación de las piernas, específicame...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tarjeta Micro SD de 16 GB	Adafruit	1294	Para su uso en la introducción del sistema operativo
Pantalla	Adafruit	3578	Cualquier pantalla que se pueda conectar por cable HDMI o flexible es suficiente
Línea de UAS Drosophila Atg8a-RNAi	Bloomington Stock Center	34340	Línea utilizada en datos representativos
Drosophila Ok6 Driver	N/A	N/A	Línea utilizada en datos representativos
Portaobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-550-A3	Mantiene las moscas en contención
Disipadores de calor	Adafruit		Evita el sobrecalentamiento de la computadora
Lente	Adafruit	4563	Se usa solo con cámara HD
PiCamera	Adafruit	4561	Aquí se usó la versión HD, pero se puede usar una cámara estándar bajo restricciones de presupuesto
Raspberry pi 4	Adafruit	4292	Computer PiSpy se ejecuta en
Ribbion Cable	Adafruit	1648	Para su uso en la conexión de componentes de cámara y pantalla
SB Estuche	Adafruit	4301	Protege la
computadora Placa	Fisher Scientific	S99406	versiones de Pyrex ya estaban disponibles para nuestro uso, pero las placas de cultivo celular o las placas puntuales de plástico también son suficientes
Trípode	Best Buy	6355959	Para la suspensión y el posicionamiento de la cámara, cualquier aparato capaz de esto es suficiente
Fuente de alimentación USB C	Adafruit	1995	Suministra energía a la computadora