Artículo de método

Determinación de cuatro componentes en un sistema de administración de ARN de nanopartículas lipídicas mediante cromatografía líquida combinada con un detector de dispersión de luz evaporativa

DOI:

10.3791/67711

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30 de mayo de 2025

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1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

En este artículo

Resumen

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Aquí, establecemos un método de análisis cuantitativo para cuatro componentes en un sistema de administración de ARN de nanopartículas lipídicas (LNP) utilizando cromatografía líquida de alta resolución combinada con un detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD). El método tiene buena separación, alta sensibilidad y alta eficiencia.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo presenta un método para el análisis de los componentes de las nanopartículas lipídicas (LNP). El LNP, que sirve como vector fundamental para los fármacos basados en ARN, se compone principalmente de colesterol, PEG con modificaciones, lípidos ionizables y lípidos auxiliares. Estos componentes exhiben una polaridad débil, lo que conduce a una fuerte retención y dificultad en la separación mediante cromatografía de fase inversa, además de carecer de características distintivas de absorción ultravioleta. Para hacer frente a este reto, se acopló un sistema de cromatografía líquida con un detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD). Mediante el ajuste sistemático del tipo de columna cromatográfica y la optimización del programa de elución en gradiente de la fase móvil, se logró una separación basal rápida y completa de los cuatro componentes críticos. El uso de la última tecnología ELSD mejoró significativamente la sensibilidad de detección y amplió el rango lineal del método. Los resultados experimentales demostraron que dentro de un rango de concentración de 5 μg/mL a 250 μg/mL, los cuatro componentes de LNP mostraron una excelente linealidad con coeficientes de correlación todos superiores a 0,999, y la precisión osciló entre el 94,2% y el 108,0%. En experimentos de precisión, las desviaciones estándar relativas del tiempo de retención y el área máxima para una solución estándar de 10 μg/mL estaban por debajo del 0,1% y el 2%, respectivamente. Cuando se utiliza este método para analizar diferentes muestras de LNP, todos los componentes se separan con éxito y sus respectivos contenidos se cuantifican con precisión, lo que pone de manifiesto la sólida adaptabilidad de este enfoque analítico.

Introducción

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La nanopartícula lipídica (LNP) es uno de los sistemas de administración de genes no virales más avanzados, utilizado principalmente para la administración de fármacos de ácidos nucleicos, como oligonucleótidos antisentido, pequeños nucleótidos interferentes, ARNm, etc. 1,2,3. El LNP generalmente se compone de cuatro componentes: lípidos ionizables, lípidos modificados con polietilenglicol (PEG), fosfolípidos y colesterol. El componente clave son los lípidos ionizables, que son el factor decisivo en la eficiencia de la administración de fármacos de ácidos nucleicos. Los otros tres componentes pueden aumentar la estabilidad de la LNP y reducir el reconocimiento del sistema inmune 4,5,6.

Las proporciones variables de los cuatro componentes en LNP pueden afectar significativamente el proceso de autoensamblaje de las nanopartículas, afectando propiedades como la eficiencia de encapsulación del ingrediente farmacéutico activo (API), su eficacia de administración y la tasa de liberación in vivo 7,8,9. Por lo tanto, es esencial establecer un método de análisis cuantitativo para los componentes de LNP, facilitando así la síntesis de un sistema óptimo de administración de LNP10,11.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica analítica contemporánea ampliamente empleada en el análisis farmacéutico y es apreciada por su alta eficiencia, sensibilidad y capacidades de automatización. La HPLC abarca varios detectores, incluidos los detectores ultravioleta (UV) convencionales, así como detectores de propósito general como los detectores de índice de refracción (RID), los detectores de dispersión de luz evaporativa (ELSD), los detectores de aerosoles cargados (CAD) y los detectores de radiofrecuencia (RF) altamente selectivos, entre otros12.

En el caso del análisis de los cuatro componentes de LNP, que carecen de grupos absorbentes de UV distintos y, por lo tanto, no producen respuesta en los detectores UV, se consideró el uso de detectores de propósito general. Aunque RID es una de esas opciones, no es adecuado para el análisis de gradiente y ofrece una sensibilidad relativamente menor en comparación con los otros dos detectores de propósito general; Por lo tanto, no se eligió12. Además, si bien los detectores CAD cuentan con una alta sensibilidad, su costo prohibitivo los hace menos atractivos12.

En consecuencia, se seleccionó el detector ELSD. Este detector cuenta con una opción distintiva de modo de ganancia, el modo "amplio", que permite el análisis simultáneo de componentes de alta concentración y trazas, mejorando la sensibilidad y ampliando el rango lineal.

En este artículo se emplea un sistema de HPLC acoplado a ELSD, logrando una separación eficiente y un análisis cuantitativo de los cuatro componentes de la LNP mediante la optimización de las columnas cromatográficas, la elución en gradiente de las fases móviles y otras condiciones13.

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Protocolo

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1. Preparación del instrumento

  1. Configuración del instrumento
    1. Configure un sistema de HPLC junto con un ELSD.
  2. Instalación de columnas
    1. Instale la columna cromatográfica (C4-300; 150 mm × 4,6 mm de diámetro interior, 5 μm), siguiendo la dirección de la flecha en la columna, con un extremo conectado a la salida del automuestreador y el otro a la entrada ELSD.
  3. Preparación de la fase móvil
    1. Preparar las fases móviles: Fase A, una solución acuosa TEAA de 10 mM (pH = 7,0), y fase B, una solución de metanol TEAA de 10 mM (pH = 7,0).
    2. Para preparar la fase A, pese con precisión 1,01 g de trietilamina, disuélvala en 1000 ml de agua, mezcle bien y ajuste el pH a 7,0 con ácido acético.
    3. Para preparar la fase B, disuelva 1,01 g de trietilamina en 1000 mL de metanol, mezcle y ajuste el pH a 7,0 con ácido acético.
  4. Edición de métodos
    1. Encienda los interruptores de alimentación de cada módulo del LC-ELSD e inicie el software LabSolutions . A continuación, abra la ventana Análisis en tiempo real .
    2. Haga clic en Archivo y seleccione Nuevo para crear un nuevo archivo de método. Modifique el tiempo de parada de LC en el método a 15 y haga clic en Aplicar a todo el tiempo de adquisición.
    3. A continuación, haga clic en Bomba para modificar los parámetros de la bomba. Seleccione el modo de análisis como Gradiente binario de alta presión (B.GE) y ajuste el caudal a 1,0 mL/min.
    4. A continuación, ajuste la concentración inicial de la bomba B (%B) al 80% y modifique el gradiente de fase móvil: a los 3 min, %B es el 80%, a los 4 min, %B es el 85% de 5,5 min a 12 min, %B es el 100%, a los 12,1 min, %B vuelve al 80%.
    5. A continuación, haga clic en Horno de columna y ajuste la temperatura del horno a 55 °C. Por último, haga clic en ELSD para modificar la temperatura del tubo de deriva a 40 °C. Guarde el método.
      NOTA: El resumen de los parámetros se muestra en la Tabla 1.
  5. Ponga en marcha y equilibre el instrumento.
    1. Haga clic en Descargar e iniciar para iniciar y equilibrar el instrumento.

2. Preparación de soluciones y muestras estándar

  1. Preparación de soluciones estándar
    1. Pesar con precisión 10,0 mg de las cuatro sustancias estándar componentes de LNP por separado, disolver en 1 mL de metanol y vortex hasta que se disuelva por completo para obtener soluciones madre con una concentración de 10 mg/mL para cada componente.
    2. Con una pipeta, transfiera con precisión 100 μL de cada una de las cuatro soluciones madre a un vial de muestra, luego agregue 600 μL de metanol. Mezclar bien para preparar una solución intermedia mezclada 1 con una concentración de 1000 μg/mL.
    3. Transfiera con precisión 20 μL de cada una de las cuatro soluciones madre a un vial de muestra, luego agregue 920 μL de metanol. Mezclar bien para preparar una solución intermedia mixta 2 con una concentración de 200 μg/mL.
    4. A continuación, prepare una serie de soluciones patrón a concentraciones de 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL y 250 μg/mL mediante dilución en serie de acuerdo con la Tabla 2.
  2. Preparación de muestras
    1. Con una pipeta, transfiera con precisión 100 μL de la muestra a un vial de muestra, luego agregue 900 μL de metanol y mezcle bien. En este punto, asegúrese de que la concentración de LNP en la muestra se diluya 10 veces y que el LNP se disocie del fármaco de ácido nucleico.

3. Adquisición de datos

  1. Coloque las soluciones estándar y las soluciones de muestra en el muestreador automático del cromatógrafo de líquidos.
  2. Haga clic en Lote en tiempo real en la barra de herramientas del asistente de la ventana Análisis en tiempo real . A continuación, haga clic en Nuevo en el menú Archivo para crear una nueva tabla de lotes.
  3. En la tabla de lotes, introduzca el # de vial, el nombre de la bandeja, el archivo de datos y el volumen de inyección de las soluciones estándar y de muestra, y seleccione el archivo de método guardado en el paso 1.4. Haga clic en Guardar archivo por lotes en el menú Archivo para guardar el archivo por lotes.
  4. Espere hasta que la presión del cromatógrafo líquido y la línea de base del cromatograma sean estables. A continuación, haga clic en Iniciar lote en tiempo real en la barra de herramientas del asistente para iniciar la adquisición de datos.

4. Análisis de datos

  1. Establecer curvas de calibración
    1. Abra la ventana del navegador del software LabSolutions y arrastre los datos de la solución estándar a la vista de resultados cuantitativos para establecer una curva de calibración. A continuación, modifique los parámetros de procesamiento de datos. Haga clic en Editar en la vista de métodos.
    2. En la ventana Parámetros de integración , cambie el valor de pendiente a 10000. A continuación, en los Parámetros de identificación, cambie el método de identificación a Banda y establezca el Ancho de banda predeterminado en 0,1 min.
    3. Después de eso, modifique los parámetros cuantitativos. Cambie el Método Cuantitativo a Estándar Externo y establezca el # de Nivel de calibración en 7. Seleccione el tipo de curva de calibración como Exponencialmente. A continuación, modifique el Compuesto.
    4. Introduzca los nombres y las concentraciones de solución estándar de los cuatro componentes de la LNP. Haga doble clic en el vértice máximo para actualizar los tiempos de retención. Por último, haga clic en Ver para completar la modificación de los parámetros de procesamiento de datos.
    5. Modifique el tipo de muestra en la vista de resultados cuantitativos a estándar (punto de cálculo). De acuerdo con las concentraciones, ajuste los niveles de la solución estándar de 1 a 7. Una vez establecidas las curvas de calibración, haga clic en Archivo en la barra de menú y guarde el archivo de método.
  2. Análisis cuantitativo de muestras
    1. Arrastre los datos de las muestras a la vista de resultados cuantitativos de la ventana del navegador, que mostrará los resultados de concentración de los cuatro componentes de LNP en las muestras.

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Resultados

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El análisis de la solución estándar de LNP utilizando este método logró un grado de separación mayor a 1.5 para los cuatro componentes, logrando una separación de línea base. Además, no se observaron residuos en soluciones estándar de alta concentración, como se muestra en la Figura 1. Se estableció una curva de calibración dentro de un rango de concentración de 5 a 250 μg/mL, exhibiendo coeficientes de correlación todos superiores a 0,999, lo que indica un amplio rango lineal y una excelent...

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Discusión

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Los cuatro componentes de LNP exhiben una polaridad relativamente débil. Cuando se analizan utilizando una columna C18, los compuestos objetivo demuestran una fuerte retención dentro de la columna, lo que conduce al ensanchamiento del pico de fosfolípidos para los componentes fuertemente retenidos. Además, después de analizar soluciones de alta concentración, los residuos se acumulan en la cabeza de la columna C18, lo que podría comprometer la precisión de la cuantificación. El cromatogr...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradece a las empresas biofarmacéuticas por suministrar las muestras de LNP para el experimento y a Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd por proporcionar la columna de cromatografía.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoANPEL Laboratory Technologies (Shanghái) Inc.CAEQ-4-000319-0050
BalanzaShimadzu (Shanghai) Consumibles de laboratorio global Co., LtdAP135W
ColumnaShimadzu (Shanghai) Consumibles de laboratorio globales Co., LtdShimNex WP C4 (380-01235-74)
ELSDShimadzu (China) CO.,LTDELSD-LT III (228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (China) CO.,LTD
LCShimadzu (China) CO.,LTDLC40D XR
MetanolANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
Pipeta-100 y micro; LShimadzu (Shanghai) Consumibles de laboratorio global Co., Ltd00-NAR-100
Pipeta-1000 y micro; LShimadzu (Shanghái) Consumibles de laboratorio globales Co., Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Tecnologías de laboratorio (Shanghái) Inc.CAEQ-4-012190-0250
Sistema de agua ultrapuraMilliporeZIQ7000T0C
Mezclador de vórticeANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.VM-B

Referencias

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  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
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  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
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  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
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